三磷酸腺苷－敏感性钾通道基因缺陷型动物的制作方法

专利名称：三磷酸腺苷－敏感性钾通道基因缺陷型动物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因缺陷型(剔除(knockout))动物，具体地涉及基因缺陷型小鼠，而且首先涉及三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道基因缺陷型小鼠。
胰岛素是由胰腺β-细胞所分泌的，它是一种降低血中葡萄糖水平的激素，而葡萄糖是胰岛素分泌的重要生理刺激物之一。在过去的二十多年内，已经对葡萄糖诱导的胰岛素分泌机制进行了充分研究，其中主要是以葡萄糖代谢假设为基础(Malaisse WJ.等人，代谢(Metabolism),28:373-386(1979))。这个假设已经引起了广泛的注意，它强调了在胰腺β-细胞中葡萄糖代谢产物作为胰岛素分泌信号的可能性。在各种不同的代谢产物中，ATP被认为是最重要的分子之一，它所起的作用是作为代谢能量载体，作为胰腺β-细胞分泌胰岛素的胞内信号(Ashcroft,SJH，生物化学杂志(Biochem.J.),132:223-231(1973))。
胰腺β-细胞是电生理可兴奋细胞，而且已知β-细胞的膜电位是胰岛素释放中刺激-分泌偶联过程中的关键因素(Henquin JC.,实验(Experimentia),40:1043-1052(1984))。还已知，葡萄糖通过控制膜对钾离子的通透性来调控β-细胞膜电位(Sehlin,J.，糖尿病(Diabetes)32:320-323(1983))。
之后，1984年，在Cook等人发现了ATP-敏感性钾通道(ATP-sensitivepotassium channel，简称为KATP)之后，先发现了一种使葡萄糖代谢与膜的钾通透性关联的分子(Cook,DL等人，自然(Nature),311:271-273(1984))。KATP通道最初是在心肌中发现的，它的特征是当胞内ATP浓度增加时，该通道被抑制(Noma,A.，自然(Nature)305:147-148(1983))。随后，在各种组织和细胞中发现了KATP通道，其中包括脑、垂体腺和骨骼肌(Ashcroft,FM，神经科学年报(Annu.Rev.Neurosci.),11:97-118(1988))。
根据胰腺β-细胞的胰岛素分泌机制，由葡萄糖代谢所产生的ATP会导致KATP通道的关闭，这又导致β-细胞膜的去极化，这之后是电压依赖型钙通道开启，从而允许Ca2+流入β-细胞。这样所造成的胞内Ca2+浓度上升，就触发了依赖Ca2+的胰岛素分泌(Wollheim,CB等人，生理学综述(Physiol.Rev.),61:914-973(1981))。因此，将细胞的代谢状态与细胞膜电位相关联的β-细胞KATP通道，是关键性的分子，因而认为它们的作用是胞内的ATP-和ADP-传感器，从而调控膜的兴奋性。
磺酰脲(Su剂)是一种促进胰岛素分泌的口服降血糖药，它是在治疗非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)中广泛使用的治疗剂，已表明磺酰脲可抑制β细胞KATP通道的活性(Sturges,NC等人，柳叶刀(Lancet),8453:474-475(1985),De Weille,J.，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:1312-1316(1988))。对KATP通道的电生理学研究已表明，它们的动力学和药理学特性在不同组织中是不同的，这暗示KATP在组织中有结构和功能上的差异(Terzic,A等人，Am.I.Physiol.,269:C525-C545(1995))。因为在胰腺β-细胞和分泌胰岛素的细胞系中KATP通道具有内向式整流(inward rectification)的特性，因此，它们在结构上可能与构成内向式整流K+通道家族的其他通道有关。内向式整流K+通道与电压门控型K通道(Kv)的区别在于前者并不被膜的去极化所激活而且它们允许K+的流入大于流出。
在了解内向式整流K+通道的结构和功能的过程中，由于表达克隆了编码3种截然不同的内向式整流K+通道的cDNA而获得了突破这3种K+通道是来自大鼠肾脏的ROMK1(Kir1.1)(Ho,K.等人，自然(Nature),362:31-38(1993))、来自小鼠巨噬细胞系的IRK1(Kir2.1)(Kubo,Y等人，自然(Nature),362:127-133(1993))和来自大鼠心脏的KGA(Kir3.1)(Dascal,N等人，美国科学院院报(Proe.Natl.Acad.Sci.USA),90:10235-10239(1993))。这些研究确立了新的Kir家族基因，它们编码结构和功能特征不同于Kv超家族的蛋白质。现在，根据Chandy和Gutman的命名，Kir亚家族被命名为Kir1.0-7.0(Chandy,KG.,Gutman,GA.，药理科学趋势(Trends Pharmacol.Sci.),14:434(1993)；Krapivinsky,G.等人，神经元(Neuron),20,995-1005(1998))。
将GIRK1 cDNA作为探针，已从各种组织中分离出Kir家族的一个新成员，uKATP-1(Kir6.1)(Inagaki,N.，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),270:5691-5694(1995))。而且，通过将Kir6.1 cDNA用作探针对人基因组文库进行筛选，还分离出一个新的Kir基因，人Kir6.2(也称为“BIR”)。此外，通过在标准杂交条件下筛选小鼠胰岛素分泌细胞系MIN6 cDNA文库的7×105空斑，还获得了小鼠Kir6.2(mBIR)基因，人和小鼠的该基因的DNA序列已经公开(日本未审查的专利出版物77796/97)。小鼠Kir6.2基因的DNA序列示于序列表(SEQ ID NO:1)中。
Kir6.2由390个氨基酸残基构成，在人Kir6.2和小鼠Kir6.2之间有96％相同性。此外，Aguilar-Bryan等人在克隆Kir6.2(BIR)的过程中发现了磺酰脲受体(SUR)(Aguilar-Bryan,L.等人，科学(Science),268:423-426(1995))。现在已知道胰腺β-细胞KATP通道含有至少两个亚基，即Kir6.2(BIR)和磺酰脲受体(SUR)，而且发生于KATP通道基因的突变被认为是非胰岛素依赖性糖尿病的主要致病因素之一。对于内向整流型钾通道的多样性和功能，可参见Horio,Y.,Seikagaku,70(2),p.73-83(1998)，和Seino,S.等人，糖尿病综述(Diabetes Reviews),4(2),177-190(1996)。
现在，糖尿病是一种全国性疾病，在日本和美国，包括潜在病人在内的病人数目已经到达了数百万，据估计，5-10％中年人或更高年龄的人是糖尿病患者。糖尿病被分为Ⅰ型即胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和Ⅱ型即非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)，而且非胰岛素依赖性的Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的90％以上。如上所述，非胰岛素依赖性糖尿病和ATP-敏感性钾通道之间的关系正逐渐地被阐明。然而，NIDDM的新治疗剂的开发却受到了障碍，因为无法获得所必需的实验动物，因而无法研究ATP-敏感性钾通道的生物作用以及在此基础上开发非胰岛素依赖性糖尿病的改良治疗剂。
另一方面，产生特定基因发生突变的模型动物，是研究导致多种病理状态的基因功能并且开发诊断药物或治疗药物或治疗方法的重要手段。最近分子生物学的进展已经建立了通过在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中采用基因导向，将缺失或突变引入小鼠染色体上所需基因的技术，从而能够产生剔除小鼠，即某个特定基因被破坏的小鼠(Capecchi,M.R.，科学(Science),244:1288-1292(1989))。
胰腺β-细胞中的KATP通道包括亚基，即磺酰脲受体(SUR1)和Kir6.2(Inagaki,N.等人科学(Science)270:1166-1170(1995)；Sakura,H.等人，FEBS Lett.,377:338-344(1995))，而骨骼肌或心肌中的KATP通道包括SUR2A和Kir6.2(Inagaki,N.等人，神经元(Neuron),16:1011-1107(1996))。因为Kir6.2被认为起着形成KATP通道的K+选择性孔洞的作用，因此，我们假设通过破坏Kir6.2基因可以产生缺乏KATP通道的小鼠。基于这种假设，本发明的目的是产生一种基因缺陷型(剔除)动物，特别是基因剔除的小鼠，其中缺失了Kir6.2基因，即KATP通道的亚基之一的基因。这些动物是阐明KATP通道(胰腺β-细胞分泌胰岛素中的关键分子)的功能和生理作用，以及开发非胰岛素依赖性糖尿病的治疗剂所必需的。
因此，本发明提供一种Kir6.2基因缺陷的、纯合的、非人的哺乳动物，其中ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因从两个等位基因座上被缺失掉。较佳地，非人哺乳动物是小鼠。
此外，本发明还提供Kir6.2基因缺失的、杂合的、非人的哺乳动物，其中ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因仅从两个等位基因座中的一个基因座上被缺失掉。较佳地，非人哺乳动物是小鼠。
此外，本发明还提供了这些非人哺乳动物的组织。术语“组织”包括胰腺组织、心肌组织、骨骼肌组织、脑组织、血管内皮组织和其他组织。
另外，本发明还提供了这些非人哺乳动物的细胞。术语“细胞”包括郎格罕氏β-细胞(Langerhans′β-cell)、骨骼肌细胞、心肌细胞、垂体腺细胞、血管内皮细胞和其他细胞。
通过提供这些缺乏与非胰岛素依赖性糖尿病(NDDM)发作直接有关的特定ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因的动物、组织和细胞，本发明将有助于研究NDDM的病因机制并加速NDDM改良治疗剂的开发。
纯合的Kir6.2基因缺陷型非人ES细胞系还可方便地用常规方法(例如，J.D.Watson等人，“重组DNA”(Recombinant DNA)，第2版，14章，W.H.Freeman andCompany(1992))，通过使用雄性和雌性的Kir6.2基因缺陷型纯合非人哺乳动物而建立，其中该动物在两个等位基因座上都缺失了ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因。
还提供了一种产生纯合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳动物的方法，其中在两个等位基因座上都缺失了ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因，该方法包括步骤如下用cDNA探针，从该非人动物基因组文库中分离出含Kir6.2基因的克隆，通过在该Kir6.2基因中插入可供选择的标记基因，破坏该分离出的克隆的DNA序列中的Kir6.2基因，构建导向载体，该载体含有包含该被破坏的Kir6.2基因的DNA序列，将该导向载体引入培养的ES细胞中，从而发生同源重组，分离和鉴定已发生同源重组的克隆，从怀孕动物获得胚泡，并将分离和鉴定的克隆的细胞注入该胚泡，将该胚泡移植入代理母亲动物的子宫内，获得嵌合动物，将该嵌合动物与野生型动物杂交获得F1动物，将该F1动物相互杂交，获得F2动物，和选择纯合的Kir6.2基因缺陷型动物。


图1显示了小鼠Kir6.2基因、所用的导向载体和同源重组偶联物的示意图。
图2显示了第二代的Southern印迹分析的结果。
图3显示了用Kir6.2+/+和Kir6.2-/-小鼠的胰腺、心脏和脑进行RT-PCR分析的结果。
图4为显示了胰腺β-细胞中整个细胞膜电流的图。
图5为显示胰腺β-细胞的KATP通道导电性的图。
图6为显示胰腺β-细胞的静息膜电位和胞内Ca2+基础浓度的图。
图7显示了促分泌剂对胰腺β-细胞中胞内Ca2+浓度的作用。
图8为显示批量孵育的胰岛的胰岛素分泌情况的图。
图9显示了在灌流的胰岛中，对葡萄糖和甲基磺丁脲的胰岛素分泌反应的时间过程。
图10显示了对于血糖水平的葡萄糖负荷和对于血清胰岛素浓度的反应情况。
图11为显示胰岛素负荷实验结果的图。
培养小鼠ES细胞并维持其全能性的技术，以及在培养的细胞中实现同源重组的载体系统的发展(Thomas,K.T.和Capecchi,M.R.，细胞(Cell),44:419-428(1986))，使得对Kir6.2基因进行基因导向成为可能。即通过从小鼠基因组文库中用DNA探针分离Kir6.2基因，在其中插入可选择标记基因从而摧毁该基因，将整合有该被破坏基因的载体引入培养的ES细胞从而让同源重组发生，分离和鉴别发生同源重组的克隆，将该克隆注入胚泡中，从而获得嵌合小鼠。因为受注入的ES细胞保留了分化成胚芽细胞的能力，因而突变ES细胞的遗传信息会以一定的概率传递给其子代，因此通过F1动物之间的杂交，可产生Kir6.2基因缺陷的纯合小鼠(Kir6.2-/-)，其中在两个等位基因座上都缺失了Kir6.2基因。确定小鼠是否是Kir6.2-/-，可通过从小鼠尾部抽提基因组DNA，用EcoRⅠ和BglⅡ消化，然后用约0.6kb的Kir6.2基因片段进行Southern印迹分析，该片段位于Kir6.2基因中XhoⅠ位点下游约4kb处而且在导向载体中并不包括该片段。一旦获得Kir6.2-/-小鼠，那么可以通过它们之间的杂交而维持具有该特征的小鼠。此外，通过将Kir6.2-/-小鼠与正常Kir6.2+/+小鼠杂交，可以轻易地获得杂合的Kir6.2缺陷型小鼠(Kir6.2+/-)，其中在两个等位基因座中仅一个基因座缺失Kir6.2基因。同样方法也适用于其他动物品种。
下面结合实施例进一步详细地阐述本发明。然而，应理解，本发明并不局限于实施例。
实施例<Kir6.2基因导向>
现参见图1，所给的图中显示了包含小鼠Kir6.2基因(SEQ ID NO:1)的基因组DNA的一部分、所用的导向载体和导向的等位基因(即同源重组偶联体)。在图中，外显子用虚线框表示。已知Kir6.2基因不含内含子。Neo和TK分别为新霉素抗性基因和胸苷激酶基因。“探针”表示Southern印迹分析中的探针位置，而箭头表示RT-PCR的引物。如图所示，利用Kir6.2基因中的限制性酶XhoⅠ位点，在导向载体中插入新霉素抗性基因“Neo”，它是阳性选择标记。在同源区域外，插入一个限制性酶XhoⅠ位点。制备基因导向载体的程序如下。
借助cDNA探针，从129/Sv小鼠基因组文库λFIⅫ(Stratagen)中分离出KATP通道Kir6.2基因。所用的探针是约1.2kb的DNA片段，它是用SmaⅠ和PmaCⅠ从我们已克隆的含有小鼠Kir6.2的cDNA质粒(科学(Science),17:1166-1170,(1995))中切下的。此DNA片段包括从Kir6.2的5′UT处的SmaⅠ位点至3′UT处的PmacⅠ位点之间的序列。用放射性同位素32P，通过缺口翻译法来标记探针，然后用其在高度严谨条件下来筛选基因组DNA文库，从而分离到9个阳性克隆。因为发现两个克隆与其余克隆中的克隆是相同的，因此对7个阳性克隆制作了限制性图谱。用SacⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、SphⅠ、EcoRⅠ、ScaⅠ、XbaⅠ、NheⅠ、DraⅠ、XhoⅠ、SmaⅠ、和NotⅠ，制作了此限制性图谱。
Kir6.2基因导向载体是如下制备的从Kir6.2基因氨基酸编码区域中的XhoⅠ位点算起，将位于5′方向8.0kb处位点和3′方向3.8kb处位点之间的部分选为导向载体的同源区域。将新霉素抗性基因“neo”(阳性选择标记)插入XhoⅠ位点，在同源区域的3′-端下游插入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因作为阴性选择标记。用pBluescriptⅡKS+(Stratagene)来制备导向载体。因为它在此同源区域5′-端上游有NotⅠ位点，因此可以用NotⅠ消化来使其线性化。
<制备ES细胞(胚胎干细胞)>
对于ES细胞，使用已从129/01a建立的E14细胞系，它由Kumamoto大学的S.Aizawa教授馈赠。ES细胞储藏在液氮中，而且在使用前，在含LIF、NEAA和丙酮酸的15％FCS-DMEM中培养。
<制备饲养细胞>
用表达neo(新霉素抗性基因)的转基因小鼠来制备饲养细胞。将14.5天龄的新霉素抗性基因的转基因小鼠胚胎，去除其胚外组织和脏器，然后切碎，在37℃,0.1％胰蛋白酶溶液(用5.9mM EDTA-PBS对GIBCO-BRL2.5％胰蛋白酶进行25倍稀释而制得)中振摇50分钟而分散。细胞悬浮在10％FCS-DMEM高葡萄糖培养基中，离心一次，然后在10厘米培养皿中于10％FCS-DMEM高葡萄糖培养基中培养，以得到第一代培养物。在使用前一天，将饲养细胞在含10微克/毫升丝裂霉素的10％FCS-DMEM高葡萄糖培养基中培养2小时，并亚培养，然后在次日用作饲养细胞。
<将基因掺入ES细胞>
将基因掺ES细胞，是采用电穿孔法，用Gene pulserⅡ(BioRad)进行。用NotⅠ消化120微克的导向载体，用苯酚/氯仿处理一次，再用氯仿处理一次，用乙醇沉淀，然后用PBS调至300微克/毫升。在电穿孔之前，将ES细胞刮下并悬浮于PBS中，浓度为1.43×107细胞/毫升。准备4个样品池(cuvette)，每个含有0.7毫升该ES细胞悬浮液(107细胞/样品池)和0.1毫升导向载体DNA(总计4×107细胞)，移液，在冰上放置10分钟，然后在210V,500μF下进行脉冲(打孔)。
<挑选集落>
在电穿孔之后，将一个样品池中的细胞转移至Falcon 2058管中，加入1毫升培养液而悬浮。再加入38毫升培养液使细胞分散，然后将其接种于4个已经接种有饲养细胞的10毫米培养皿中，每个皿中10毫升。在电穿孔后36小时，用250微克/毫升G418(新霉素，庆大霉素Gibco BRL)进行选择，48小时后用250微克/毫升G418和0.2nM FIAU(1-[2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶)(1-[2-deoxy-2-fluoro-β-arabinofranosyl]-5-iodouracyl)进行选择。
<集落的收获>
在电穿孔后第8天收获各集落。将各个集落吸入含有10微升0.25％胰蛋白酶EDTA的96孔培养皿中，37℃孵育6分钟。加入50微升PBS，细胞通过吸管吹吸而分散，然后接种于2个已接种饲养细胞的96孔培养皿，每孔接种30微升。一个培养皿被冰冻保藏以便进行胚泡注射，而另一个培养皿被培养以抽提基因组DNA进行筛选。
<鉴别发生了同源重组的克隆>
从收获的抗新霉素ES细胞中，通过以下步骤收集DNA苯酚/氯仿抽提、氯仿抽提、乙醇沉淀、然后用70％乙醇洗涤。那些实现了同源重组的克隆是这样选择的用EcoRⅠ和BglⅡ消化10微克如上收集的基因组DNA，用位于Kir6.2基因中XhoⅠ位点下游约4kb处的约0.6kb Kit6.2基因片段(该片段在导向载体中并不包含)探针，进行Southern印迹分析。筛选了393个ES细胞，鉴定出一个实现了同源重组的克隆。
<产生Kir6.2基因缺陷型纯合小鼠>
从怀孕的129/SV小鼠中取出3.5日龄的未分化胚胎，用约20个亚培养的突变ES细胞进行显微注射，然后移植入代理母亲(小鼠)的子宫中，通过自然分娩而得到嵌合小鼠。
然后，将这些嵌合小鼠中的雄性小鼠与野生型雌性小鼠杂交，获得第二代(F1)小鼠。然后，第二代小鼠相互杂交，获得第三代(F2)小鼠。某些第三代(F2)小鼠是Kir6.2基因缺陷型纯合小鼠(Kir6.2-/-)，它是通过杂合(Kir6.2-/+)小鼠(这些小鼠仅在两个等位基因座的一个基因座上缺失Kir6.2基因)之间的杂交而产生的。这些杂合小鼠被选出以产生本发明的Kir6.2基因缺陷型纯合小鼠(Kir6.2-/-)。图2显示了Southern印迹分析结果。在此图中，泳道+/+表示野生型，+/-表示杂合子，-/-表示Kir6.2基因缺陷型纯合子。Southern印迹分析是这样进行的用EcoRⅠ和BglⅡ消化10微克抽提的基因组DNA，用位于Kir6.2基因中XhoⅠ位点下游约4kb处的约0.6kb Kir6.2基因片段(该片段并不包含在导向载体中)探针进行探测。
从Kir6.2基因缺陷型纯合小鼠和对照小鼠的胰腺、心脏和脑中进行组织采样，用GTC法制备RNA。以RNA为基础，用随机6聚引物制备单链DNA。以单链DNA为模板，在选自Kir6.2基因内的引物协助下进行PCR(RT-PCR)，证实了在Kir6.2基因缺陷型纯合小鼠中Kir6.2基因没有转录。
图3显示了对Kir6.2+/+和Kir6.2-/-小鼠的胰腺、心脏和脑分别进行RT-PCR分析的结果。从每种组织中抽提总共10微克RNA来制备cDNA。在Kir6.2+/+型组织中发现了Kir6.2转录物，但是在Kir6.2-/-型组织中没有发现。Kir6.2 RT-PCR产物的预计长度为245碱基对。
Kir6.2-/-小鼠可正常地生长，具有繁殖力，而且在总体外观或行为方面没有明显异常。这样获得的Kir6.2-/-小鼠可通过它们之间相互的杂交而维持。此外，Kir6.2基因缺陷型杂合小鼠(Kir6.2+/-)可以通过Kir6.2-/-小鼠和Kir6.2+/+小鼠的杂交而产生。<电生理学和胞内钙浓度的测定>
为了证实在Kir6.2基因缺陷型纯合小鼠中缺乏有功能的KATP通道，我们检查了正常(Kir6.2+/+)胰腺β-细胞和Kir6.2-/-细胞中全细胞膜电流、单个通道电流和胞内钙浓度。
用胶原酶消化法(Wollheim,C等人，Meth.In Enzymology,Fleischer,S&Fleischer B.编辑，(Academic Press Inc.,San Diego),vol.192,p.188-223(1990))，分离出胰岛，将分散的胰岛细胞培养于添加有10％FCS的DMEM培养基中，接着接种至含CEL Locate Coverslips(Eppendorf,Hamburg,Germany)的3.5厘米培养皿中，37℃孵育24-72小时，然后进行实验。
按照以前所述的方法(Miki T.等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),94,11969-11973(1997))，对单个胰腺β-细胞进行全细胞记录，单个通道记录，和胞内钙浓度测量。
参见图4，在-70mV的维持电压下，每隔2秒钟，将±10mV的交流电脉冲施加于胰腺β-细胞，持续时间为200毫秒。用无ATP的移液管溶液(pipette solution)对Kir6.2+/+胰腺β-细胞进行胞内透析(贯通)，这导致膜的K+传导性进行性增加。这种增加可被500μM甲苯磺丁脲迅速抑制，该特性是胰腺β-细胞中KATP通道所特有的。与之相反，在透析或用甲苯磺丁脲处理之后在Kir6.2-/-胰腺β-细胞中没有观察到K+传导性的增加。
在Kir6.2-/-胰腺β-细胞中KATP通道活性的完全丧失还得到了单通道分析的证实。在Kir6.2+/+胰腺β-细胞的40个斑点(patch)中有39个检测到单式KATP通道电流(39/40=97.5％)，而在Kir6.2-/-胰腺β-细胞中没有检测到电流(0/40=0％)。在Kir6.2-/-小鼠中KATP通道活性的缺乏还在骨骼肌中得到证实。这些结果表明，Kir6.2表达蛋白是KATP通道发挥功能所必需的亚基。图5显示了胰腺β-细胞的KATP通道传导性。为了消除细胞之间不同膜区域的影响，通过将记录的ATP-敏感性传导性除以各细胞的膜电容而使其归一化。
图6显示了Kir6.2+/+胰腺β-细胞和Kir6.2-/-胰腺β-细胞的静息膜电位和胞内Ca2+基础浓度([Ca2+]i)。静息膜电位在Kir6.2-/-胰腺β-细胞中明显高于正常的Kir6.2+/+胰腺β-细胞[Kir6.2-/-:-36.1±1.88mV(n=59)；Kir6.2+/+:-65.5±1.99mV(n=59):p＜0.001]。在2.8mM葡萄糖存在时，注意到反复发生动作电位的爆发(数据未示出)。在相同葡萄糖浓度下，在Kir6.2-/-胰腺β-细胞中胞内Ca2+基础浓度自发地波动，但其平均值在Kir6.2-/-胰腺β-细胞中明显升高[Kir6.2-/-:179±13.1nM(n=34)；Kir6.2+/+:70.9±4.31nM(n=16):p＜0.001]。与Kir6.2+/+胰腺β-细胞(在该细胞中高浓度的葡萄糖(16.7mM)诱导膜的去极化)相反，用16.7mM葡萄糖并不改变Kir6.2-/-胰腺β-细胞的膜电位(数据未示出)。这些结果表明，胰腺β-细胞的静息膜电位是由KATP通道所决定的。
因为葡萄糖和甲苯磺丁脲导致胰腺β-细胞中KATP通道的关闭，从而导致膜的去极化和钙流入，因此我们还检查了对不同的促分泌物刺激反应时β细胞中胞内Ca2+浓度的变化。所用的促分泌物是葡萄糖(16.7mM)、甲苯磺丁脲(100μM)、乙酰胆碱(100μM)和K+(30mM)。
图7显示了对于典型实施例，这些胰岛素促分泌剂分别对Kir6.2+/+和Kir6.2-/-胰腺β-细胞的胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的作用。在图中的水平标杆表示施用促分泌剂的时间。这些图显示，上述所有的促分泌剂在所示浓度下都使Kir6.2+/+胰腺β-细胞的胞内Ca2+浓度升高；与之相反，在和Kir6.2-/-胰腺β-细胞中尽管乙酰胆碱和K+使Ca2+浓度升高至与Kir6.2+/+胰腺β-细胞中相当的水平，但是葡萄糖和甲苯磺丁脲不引起Kir6.2-/-胰腺β-细胞中胞内Ca2+浓度的任何变化。
这些结果证实，在Kir6.2-/-胰腺β-细胞中，胞内钙从肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)-敏感性Ca2+储藏区(reservoir)移出，以及通过电压依赖型钙通道而流入Ca2+的情况是正常的，同时还表明，在正常胰腺β-细胞中葡萄糖和甲苯磺丁脲所引发的Ca2+升高需要关闭KATP通道。
<批量培养中胰岛素分泌的反应>
在体外，通过批量孵育成年小鼠的胰岛来测定对葡萄糖和甲苯磺丁脲的胰岛素分泌反应。
根据Okamoto等人的方法(Okamoto,Y.等人，糖尿病(Diabetes),41,1555-1561(1992))并稍作修改，进行批量孵育。简而言之，将胰岛(每管中10个胰岛)在37℃于HEPES-Krebs中预孵育60分钟，然后在400微升含不同胰岛素分泌刺激剂的缓冲液中孵育30分钟。
图8显示了在批量孵育的Kir6.2+/+和Kir6.2-/-胰岛中的胰岛素分泌情况。柱上方括号中的各个数字表示实验的次数。尽管在Kir6.2-/-胰腺β-细胞中胞内Ca2+的基础水平上升，但是批量孵育的Kir6.2-/-胰岛中胰岛素分泌的基础水平却与Kir6.2+/+细胞没有差别[Kir6.2+/+:0.42±0.05ng/10个胰岛/30分钟；Kir6.2-/-:0.35±0.04ng/10个胰岛/30分钟]。在Kir6.2+/+胰岛中，对于16.7mM葡萄糖的反应是导致胰岛素分泌增加了7.2倍，而且添加100μM甲苯磺丁脲，可使分泌进一步增加。与之相反，在Kir6.2-/-胰岛中16.7mM葡萄糖和加入100μM甲苯磺丁脲都不导致胰岛素分泌。与此相反的是，100μM乙酰胆碱和60mM K+两者都引发胰岛素分泌(数据未示出)。
这些结果表明，对于葡萄糖诱导的或甲苯磺丁脲诱导的胰岛素分泌而言，至关重要的是胞内Ca2+浓度的迅速上升而不是持续升高。
<在灌流实验中胰岛素分泌的反应>
接着，在体外通过对成年小鼠的胰岛进行灌注来测定胰岛素分泌对葡萄糖和甲苯磺丁脲的反应。
根据Wollheim等人的方法(Wollheim,C等人，Meth.In Enzymology,Fleischer,S&Fleischer B.编辑，(Academic Press Inc.,San Diego),vol.192,p.188-223(1990))，对胰岛进行灌流。简而言之，将150只胰岛置于装有Bio-Gel P-2(Bio-Rad,CA,USA)的柱中，然后用含118.4mM氯化钠、4.7mM氯化钾、1.2mM磷酸二氢钾、2.4mM氯化钙、1.2mM硫酸镁、20mM碳酸氢钠、2.8mM葡萄糖和10mM HEPES，并补充有0.2％(w/v)牛血清白蛋白的充气(gassed)HEPES-Krebs缓冲液在37℃，以0.5毫升/分钟恒定流速连续地灌流。在预孵育60分钟之后，添加不同的胰岛素分泌刺激剂。
图9显示了在灌流的Kir6.2+/+和Kir6.2-/-胰岛中的胰岛素分泌对葡萄糖和甲苯磺丁脲的反应的时间进程。对于每次实验，分别从3-5只Kir6.2+/+和Kir6.2-/-动物中分离出胰岛。分别根据Kir6.2+/+和Kir6.2-/-动物的4和5次实验而获得平均值和标准差。图中的水平标杆表示施用各物质的时间。当存在2.8mM葡萄糖时，胰岛素分泌的基础水平没有明显差别[Kir6.2+/+:2.04±0.50pg/1个胰岛/分钟；Kir6.2-/-:1.92±0.41pg/1个胰岛/分钟]。在Kir6.2+/+胰岛的灌流中，在第一阶段对于16.7mM葡萄糖仅观察到痕量胰岛素分泌，而在第二阶段观察不到分泌。在16.7mM葡萄糖存在时100μM甲苯磺丁脲不刺激Kir6.2-/-的胰岛素分泌。在体内Kir6.2-/-胰岛仅表现出对葡萄糖很有限的胰岛素反应，这表明KATP通道在葡萄糖诱导的胰岛素分泌的第一和第二阶段都很关键。
<葡萄糖耐受性测试>
在禁食16小时后，将葡萄糖(1克/千克)注射入麻醉小鼠(10-16周龄)的腹腔内，然后测定血糖水平和血清胰岛素浓度。
图10显示葡萄糖耐受性测试的结果。上图显示血糖水平的变化，而下图显示血清胰岛素浓度的变化。对于Kir6.2+/+，禁食的血糖水平为132±6mg/dl(n=11)；而对于Kir6.2-/-为121±8mg/dl(n=11)。在葡萄糖负荷后60和120分钟，Kir6.2-/-的血糖水平稍高于Kir6.2+/+[分别为332±16mg/dl和279±8mg/dl(60分钟)(n=11)；268±14mg/dl和192±8mg/dl(120分钟)(n=11)；P＜0.01]。比较葡萄糖负荷之前和之后的情况，血清胰岛素浓度表明，对于Kir6.2+/+从0.34±0.09ng/ml变为2.05±0.17ng/ml(n=6；p＜0.001)，对于Kir6.2-/-从0.42±0.07ng/ml变为0.70±0.05ng/ml(n=6；p＜0.001)。
因此，出乎意料的是，尽管在葡萄糖诱导的胰岛素分泌方面存在缺陷，但是发现在Kir6.2-/-小鼠中葡萄糖耐受性仅受到轻微损害。此外，在Kir6.2-/-小鼠(12周)中随机测量的血糖水平与年龄匹配的正常鼠并没有差别[Kir6.2-/-:191±6.4mg/dl(n=33)；Kir6.2+/+:188±3.8mg/dl(n=29)]。
<胰岛素负荷测试>
因为对于Kir6.2-/-小鼠的结果可以解释为胰岛素的降葡萄糖效应的增强了，因此，为了检查该假设，我们用较低剂量的胰岛素(0.1单位/千克)进行注射，然后检查血糖水平的改变情况。图11显示胰岛素负荷测试的结果。在禁食16小时后，将胰岛素(0.1单位/千克)注射入麻醉的成年小鼠(10-16周龄)腹腔内。
在葡萄糖负荷后90分钟和120分钟，在Kir6.2+/+中的血糖水平明显低于Kit6.2+/+中的血糖水平[Kir6.2-/-为67.4±3.4％而Kir6.2+/+为84.7±3.9％(90分钟)；Kir6.2-/-为66.0±3.8％而Kir6.2+/+为83.7±2.8％(120分钟)；*p＜0.01]。如这些结果所示，与Kir6.2+/+小鼠相比，胰岛素的降葡萄糖效应在Kir6.2-/-小鼠中明显增强。
葡萄糖诱导型和磺酰脲诱导型胰岛素分泌是否依赖于KATP通道，这仍然存在争论(Cook,D.L.等人，“糖尿病”，37:495-498(1988)；Takasawa,S.等人，科学(Science),259:370-373(1993)；Gembal,M.等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.),91:871-880(1993)；Komatsu,M.等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),92:10728-10732(1995)；Eliasson,L.等人，科学(Science),271:812-815(1996))。如上所述，已发现在Kir6.2-/-中高浓度的葡萄糖并不刺激胰岛素分泌，而且即使在高浓度葡萄糖存在下甲苯磺丁脲也不引发胰岛素分泌。这强烈暗示，葡萄糖代谢本身对于葡萄糖诱导的或甲基磺丁脲诱导的胰岛素分泌是不够的。上述结果表明，葡萄糖诱导型和磺酰脲诱导型胰岛素分泌都需要KATP通道关闭而导致的胞内Ca2+浓度的快速上升。
本研究表明，破坏KATP通道可增加体内胰岛素所诱导的葡萄糖耗用。使人感兴趣的是，除了刺激胰岛素分泌之外，已表明磺酰脲可增强骨骼肌(Simpson,I.A.等人，生物化学年报(Ann.Rev.Biochem.),55:1059-1089(1986))，葡萄糖耗用的主要部位(Wang,P.H.等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.),84:62-67(1989))中胰岛素所刺激的葡萄糖转移，这也暗示骨骼肌KATP通道调节了胰岛素刺激的葡萄糖转移。
人体中SUR1或Kir6.2的突变可导致婴儿持续性高血胰岛素低血糖症(PHHI)，这种病的特征是失调的胰岛素分泌(Thomas,P.M.等人，科学(Science),268:426-429(1995)；Kane,C.等人，“自然医学”(Nature Med.),2:1344-1347(1996)；Nichols,C.G.等人，科学(Science),272:1785-1787(1996)；Dunne,M.I.等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.),336:703-706(1997)；Nestorowicz,A.等人，“糖尿病”，46:1743-1748(1997))。我们的数据显示在新生Kir6.2-/-动物中有暂时的低血糖。因为SUR1是β-细胞KATP通道的特异性亚基而且Kir6.2是β-细胞和骨骼肌KATP通道两者的亚基，因此SUR1和Kir6.2突变的后果会在胰岛素作用方面出现差异。
如上所述，在胰腺β-细胞中的KATP通道是葡萄糖诱导型和磺酰脲诱导型胰岛素分泌所必需的。此外，在骨骼肌中KATP通道调控了胰岛素的作用，其机理有待阐明。
序列表(2)SEQ ID NO:1:
(ⅰ)序列特征(A)长度1173碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO:1:ATGCTGTCCC GAAAGGGCAT TATCCCTGAG GAATATGTGC TGACCCGGCT GGCAGAGGAC 60CCTGCAGAGC CCAGGTACCG TACTCGAGAG AGGAGGGCCC GCTTCGTGTC CAAGAAAGGC120AACTGCAACG TCGCCCACAA GAACATTCGA GAGCAGGGCC GCTTCCTGCA GGATGTGTTC180ACCACGCTGG TGGACCTCAA ATGGCCACAC ACTCTGCTCA TTTTCACCAT GTCCTTCCTG240TGCAGCTGGC TGCTCTTTGC CATGGTCTGG TGGCTCATCG CCTTCGCCCA CGGTGACCTG300GCCCCCGGAG AGGGCACCAA TGTGCCCTGC GTCACAAGCA TCCACTCCTT TTCATCTGCC360TTCCTTTTCT CCATCGAGGT CCAGGTGACC ATTGGTTTCG GCGGGCGCAT GGTGACAGAG420GAATGTCCCC TGGCCATCCT CATTCTCATT GTGCAGAATA TCGTCGGGCT GATGATCAAC480GCCATCATGC TGGGCTGCAT CTTCATGAAA ACGGCCCAGG CCCATCGGCG GGCAGAAACC540CTCATCTTCA GCAAGCATGC TGTGATCACC CTGCGCCATG GCCGCCTGTG CTTCATGCTG600CGCGTAGGGG ACCTCCGAAA GAGCATGATC ATTAGCGCCA CCATCCACAT GCAGGTGGTG660CGCAAGACCA CCAGCCCCGA GGGCGAAGTT GTGCCTCTCC ACCAGGTAGA CATCCCCATG720GAGAATGGCG TGGGTGGTAA CGGCATCTTC CTGGTGGCCC CACTCATCAT CTACCACGTC780ATCGACTCCA ACAGCCCGCT CTACGACCTG GCTCCTAGTG ACCTGCACCA CCACCAGGAC840CTGGAGATCA TTGTCATCTT GGAAGGCGTG GTAGAAACCA CGGGCATCAC CACCCAGGCC900CGCACCTCCT ACCTAGCTGA CGAGATTCTA TGGGGGCAGC GCTTTGTCCC CATTGTGGCC960GAGGAGGACG GCCGCTATTC TGTGGACTAC TCCAAATTTG GTAACACCAT TAAAGTGCCC 1020ACACCACTCT GCACAGCCCG CCAGCTTGAT GAGGACCGCA GTCTGCTGGA TGCCCTGACC 1080CTCGCCTCGT CGCGGGGGCC CCTGCGCAAG CGCAGTGTGG CTGTGGCGAA GGCCAAGCCC 1140AAGTTTAGCA TCTCTCCAGA TTCCTTGTCC TGA117权利要求
1．一种纯合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳动物，其特征在于，两个等位基因座上都缺失了ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因。
2．如权利要求1所述的纯合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳动物，其特征在于，该哺乳动物是小鼠。
3．一种杂合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳动物，其特征在于，两个等位基因座上只有一个基因座缺失了ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因。
4．如权利要求3所述的杂合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳动物，其特征在于，该哺乳动物是小鼠。
5．如权利要求1所述的哺乳动物的组织。
6．如权利要求5所述的组织，其特征在于，它选自下组胰腺组织、骨骼肌组织、心肌组织、垂体腺组织和血管内皮组织。
7．如权利要求3所述的哺乳动物的组织。
8．如权利要求7所述的组织，其特征在于，它选自下组胰腺组织、骨骼肌组织、心肌组织、垂体腺组织和血管内皮组织。
9．如权利要求1所述的哺乳动物的细胞。
10．如权利要求9所述的细胞，其特征在于，它选自下组郎格罕氏β-细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、垂体腺细胞和血管内皮细胞。
11．如权利要求3所述的哺乳动物的细胞。
12．如权利要求11所述的细胞，其特征在于，它选自下组郎格罕氏β-细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、垂体腺细胞和血管内皮细胞。
13．一种纯合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳动物的ES细胞系，其特征在于，它衍生自纯合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳动物，其中两个等位的基因座上都缺失了ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因。
14．一种产生纯合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳动物的方法，其中在两个等位的基因座上都缺失了ATP-敏感性钾通道Kir6.2基因，其特征在于，该方法包括步骤用cDNA探针，从该非人动物基因组文库中分离出含Kir6.2基因的克隆，通过在该Kir6.2基因中插入可供选择的标记基因，破坏该分离出的克隆的DNA序列中的Kir6.2基因，构建导向载体，该载体含有包含该被破坏Kir6.2基因的DNA序列，将该导向载体引入培养的ES细胞中，从而发生同源重组，分离和鉴别出已发生同源重组的克隆，从怀孕动物获得胚泡，并将分离和鉴别出的克隆的细胞注入胚泡，将该胚泡移植入代理母亲动物的子宫内，获得嵌合动物，将该嵌合动物与野生型动物杂交获得F1动物，将该F1动物相互杂交，获得F2动物，和选择纯合的Kir6.2基因缺陷型动物。
全文摘要
提供了Kir6.2基因缺陷型的非人哺乳动物(尤其是小鼠)，及其组织和细胞，其中在一个或两个等位基因座上缺失了ATP－敏感性钾通道Kit6.2基因，它是胰腺β－细胞分泌胰岛素所必需的K
文档编号C07K14/705GK1238385SQ9910861
公开日1999年12月15日 申请日期1999年6月9日 优先权日1998年6月10日
发明者清野进, 三木隆司, 宫崎纯一 申请人:日本化学研究株式会社, 清野进