突变型蓝绿藻及提升蓝绿藻的光合生长及生质生产的方法
【专利说明】
[OOCM] 相关申请案
[0002] 依据35U.S.C. § 119,本申请案享有美国临时申请案的优先权（申请日：2014年8 月7号；【申请号】62/034, 337)，其中所有内容皆引入本文W参酌。
技术领域
[0003] 本发明关于一种突变型蓝绿藻W及藉由使用该蓝绿藻提升蓝绿藻的光合生长及/ 或生质生产的方法。
【背景技术】
[0004] 光系统II(PhotosystemII，PSII)为一种在植物与蓝绿藻的类囊体膜内的大的膜 蛋白复合物[1-4]。其利用光能量在腔侧上氧化水W及在该类囊体膜的基质侧上减少色素 体酿（plastoquinone，P曲[1-4]。然而，在光过量的情况下，光系统II(PSII)为光合装置 的光诱导损伤的主要目标[5,6]。为了避免运个问题，光合生物体已发展出数种不同且复 杂的光保护机制W确定其在光过量的情况下可W生存[5, 6]。在高等的植物中，过量的光 能量在PSII光捕捉天线（li曲t-harvestingantenna,LHCII)中被消耗为热，而减少达到 反应中屯、的激发能量的量且保护PSII免于光损害。运个过程（也称为非光化学巧光泽焰 (no吨hotochemicalfluorescencequenching,NP曲）设及叶黄素循环的活化W及LHCII 的构型改变，其透过在PSII的腔内Δ抑的形成来控制拉6]。相较之下，蓝绿藻使用藻胆 体作为天线W捕捉太阳光。许多蓝绿藻发展出一种独特的蓝绿光诱导的NPQ机制W应对 高光逆境巧-10]。当暴露在高强度的白光或蓝光下，可溶性澄色类胡萝l·素蛋白（orange carotenoidprotein, 0CP)将会历经光转换成活化的红色形式。该红色形式的0CP可与藻 胆体的别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC)核屯、交互作用且诱发在该藻胆体上消耗过多 激发能量为热的NPQ效应，从而保护PSII反应中屯、对抗光损伤（7-17)。在运个过程中，0CP 作为光传感器、讯号传播子W及能量泽焰剂。当蓝光或白光的强度降低，在红色形式的0CP 与该藻胆体的APC核屯、之间的连结在巧光恢复蛋白（fluorescencerecoveryprotein， FR巧的帮助下被释放。FRP与该红色形式的OCP的C端区域交互作用且加速其转换成澄色 形式且自该藻胆体分离W停止该NPQ过程（14)。与在高等植物W及藻类中的光保护机制相 反，到目前为止并无证据显示在蓝绿藻中的0CP调节的光保护机制中有PSII的回馈调节。
[0005] 从来自细长嗜热性聚球藻（Thermosynechococcuselonga1:us)运种蓝绿藻的 PSII的2.9 A分辨率X射线晶体结构模型显示一种新发现的PQ分子（QC)及其扩散渠道 [3, 18]。头部基团的QC分子位于一个由脂类的尾部、地及一个Car分子包围的非常疏水的 空腔中；QC分子的尾部座落在一疏水性通道中，由细胞色素（巧tochrome，切t)b559aW及 0次单位（分别由PS祀化及psbF基因编码）的跨膜螺旋化及PsbJ所围绕，PsbJ朝向类 囊体膜的内部空间开放巧，1引。提出由PQ(或P卵2)占领运个QC位置是为了从池中的地 位置上交换PQ/P卵2 [3, 1引或为了调节氧化还原电位与细胞色素b559的反应巧，18-20,不 同的看法亦参阅参考文献21]。此外，该QC位置还被提议作为细胞色素b559的P卵2氧化 酶活性的催化位置巧2-29]。然而，在来自火神嗜热性聚球藻化vulcanus)的PSII的近期 1.身A分辨率晶体结构模型中则未观察到占领该QC位置巧]。QC的功能仍然未定。
[0006]PCT专利申请案W0 2012/092033描述了通过中断至少一种类胡萝h素的生产 及/或减少至少一种类胡萝l·素结合蛋白的表现来中断NPQ过程，W在光合微生物中增强 生质生产，并推测还原NPQ可造成有较高光子的比例为产生生质的光化学与生化途径提 供能量。然而，已有报告显示，蓝绿藻的光活性澄色类胡萝l·素蛋白除了具有能量泽焰功 能外，在类囊体膜中的单线氧泽焰剂中具有新的功能（Sedoud等人，植物细胞期刊（2014 年）26, 1781-1791)。因此，通过于蓝绿藻内中断至少一种类胡萝h素的生产及/或减少 至少一种类胡萝l·素结合蛋白的表现来中断NPQ过程可能导致易感光抑制，运是光合能力 中的光诱导的降低，归因于澄色类胡萝l·素蛋白的双光保护功能的中断（植物细胞期刊 (2006 年））。
【发明内容】
[0007] 在本发明中，意外地发现，一些新颖构筑的突变型蓝绿藻细胞，其在细胞 色素b559α或β次单位或PsbJ上具有点突变，在中度蓝光条件下显示状态转 换（statetransition)的提升作用W及在强度蓝光条件下显示非光化学巧光泽焰 (nonphotochemicalfluorescencequenching,NP曲的减弱作用，而不影响澄色类胡萝h 素蛋白（0CP)的表现。其进一步显现出，与野生型细胞在正常生长条件下比较，一些该突变 型蓝绿藻表现出提升的光合生长与生质生产，其因此可能在用于各种应用的生质生产上具 有价值，例如生质能源应用W及生物燃料、粮食、饲料W及其他有价值的商业产品的商业生 产。
[0008] -般而言，本发明提供了在细胞色素b559a或β次单位或PsbJ上具有突变的突 变型蓝绿藻细胞，特别是在PSII中该建议的化转移通道的开口附近，其相较于野生型细胞 时，表现出提升的光合生长与生质生产。
[0009] 具体而言，于一方面，本发明提供一种突变型蓝绿藻，其表现突变型细胞色素多胜 肤，该突变型细胞色素多胜肤包含选自由下列所组成的群组的突变：
[0010] (a)在对应于具有SEQIDNO: 1的细胞色素b559α多胜肤中的位置23W丙胺酸 (alanine,Α)予W胺基酸取代；
[0011] 化）在对应于具有SEQIDN0:2的细胞色素b5590多胜肤中的位置28W丙胺 酸（A)或鄉胺酸（valine,V)予W胺基酸取代，或在对应于具有SEQIDN0:2的细胞色素 b559 0多胜肤中的位置32W苯丙胺酸（地en^alanine，巧予W胺基酸取代；W及
[0012] (C)在对应于具有SEQIDNO: 3的细胞色素PsbJ多胜肤中的位置16W苯丙胺酸 (巧或精胺酸（arginine,时予W胺基酸取代，或在对应于具有SEQIDN0:3的细胞色素 PsbJ多胜肤中的位置20W苯丙胺酸（巧予W胺基酸取代。
[0013] 特定而言，本发明的突变型蓝绿藻，与不具有任何该突变的野生型蓝绿藻在相同 条件下相比时，显现出一或多种有益的特征，包括（1)抑制的非光化学巧光泽焰（NP曲，（2) 加速的非光化学巧光泽焰（NP曲的黑暗恢复，（3)正常量的澄色类胡萝h素蛋白（0CP)，及 /或（4)提升的光合生长率及/或生质生产。
[0014]于某些具体实施例中，该突变选自由S23Aa、S28A0、S28Ve、V32F0、A16FJ、 A16RJW及A20FJ所组成之群组。
[0015] 于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻包含编码SEQIDN0:4的突变型细胞色素 b559a多胜肤的基因（PS祀）。
[0016] 于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻包含编码SEQIDNO:5、6或7的突变型细 胞色素b559 0多胜肤的基因（psb巧。
[0017] 于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻包含编码SEQIDNO:8、9或10的突变型细 胞色素PsbJ多胜肤的基因（PsbJ)。
[0018] 于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻可自一属的种中被制造，包括但不限 于丽丝藻属（Agmenellum)、项圈藻属（An油aenopsis)、鱼腥藻属（An油aena)、组囊 藻属（Anacystis)、节螺藻属（Art虹ospira)、束丝藻属（Aphanizomenon)、星厘藻属 (Asterocapsa)、博氏藻属度orzia)、眉藻属（Calot虹ix)、管抱藻属（Qiamaesiphon)、 拟绿胶蓝藻属（化lorogloeopsis)、色球藻属（化roococcus)、拟甲色球藻属 (Qiroococcidiopsis)、发毛针藻属（Crinalium)、色球藻目之一属（切anobacterium)、鳄 藻属（Crocos地aera)、色球藻目之一属（切anobium)、宽球藻目之一属（切anocystis)、蓝 螺藻属（切anospira)、蓝杆藻属（切anothece)、柱抱藻属（切lin化ospermopsis)、筒抱藻 属（切lin化ospermum)、蓝纤维藻属值actylococcopsis)、包皮藻属（Dermoca巧ella)、 飞氏藻属（Fischerella)、夫列藻属（Rremyella)、真枝藻目之一属（Geitleria)、无类 囊体蓝藻属（Gloeobacter)、颤藻目之一属（Geitlerinema)、粘球藻属（Gloeocapsa)、 粘杆藻属（Gloeothece)、光环螺旋藻属化alospirulina)、真枝藻属（lyengariella)、 瘦銷丝藻属化巧tolyngbya)、銷丝藻属化yngbya)、湖生蓝丝藻属化i皿ot虹ix)、微銷 藻属（Microcoleus)、粘囊藻属（Myxosarcina)、微胞藻属（Micro巧stis)、节球藻属 (Nodularia)、念珠藻属（Nostoc)、拟珠藻属（Nostochopsis)、颤藻属（Oscillatoria)、 席藻属（Phormidium)、厚皮藻属（Pleurocapsa)、浮游蓝丝藻属（Planktot虹ix)、绿球藻 属（Prochlorococ州S)、原绿藻属（Prochloron)、原绿发藻属（Prochlorot虹ix)、假鱼 腥藻属（Pseudan油aena)、胶须藻属（^Rivularia)、裂须藻属（Schizot虹ix)、螺旋藻属 (Spirulina)、双岐藻属（S巧tonema)、直毛藻属（Stanieria)、颤藻目之一属（Starria)、 束藻属（Symploca)、真枝藻属（Stigonema)、聚球藻属（Synechococcus)、集胞藻属 (Synecho巧stis)、嗜热性聚球藻属（Thermosynechococ州S)、束毛藻属（Trichodesmium)、 单岐藻属（Tolypot虹ix)、常丝藻属（Tychonema)，W及异球藻属狂enococcus)。
[0019] 于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻为选自由集胞藻属（Synechocystis)、 聚球藻属（Synechococ州S)、节螺藻属（Art虹ospira)、念珠藻属（Nostoc)、鱼腥藻属 (An油aena)、嗜热性聚球藻属（Thermosynechococcus)W及蓝杆藻属（切anothece)所组成 的群组的属。
[0020] 于另一方面，本发明提供一种生质或生物分子的生产方法，包含在光照条件下在 适合的培养基中培养如本文所描述的突变型蓝绿藻，W及自该培养中收获生质或生物分 子。
[0021] 于某些具体实施例中，该生物分子选自由碳水化合物、脂肪酸、蛋白质、胺基酸、胜 肤、色素、祗类、类胡萝l·素、维生素，或其他高价值生物分子所组成之群组。
[0022] 本发明之一或多个具体实施例的细节阐述于下列说明中。本发明之其他特征或优 点将会自w下数个具体实施例的详细描述中w及自所附之申请专利范围中变得明显。
【附图说明】
[0023] 前面的摘要，W及W下本发明之详细描述，当结合所附之图式一起阅读时，将会更 好理解。为了说明本发明之目的，显示于图式的具体实施例系为目前较佳者。然而，应当理 解的是，本发明不限于所示之精确的安排及手段。
[0024] 在图式中：
[0025] 图1中显示藉由叶绿素a巧光测量得到反应饱和闪光的来自Qa电子转移至Qe与 Qb的动力学，对于（A)野生型（黑色线）、A16FJ(蓝色线），W及V32F0突变细胞（绿色 线）；度）野生型（黑色线）、S23Aα(蓝色线），W及S28Aβ细胞色素bs59突变细胞（红色 线）。条件：20μg的叶绿素在2mL的BG-11培养基中。样品在黑暗下静置1分钟。正规化 化与Fm的程度。
[0026] 图2A-图沈中显示在红色光化的光线存在与缺乏下，时间依赖型的闪光诱导的 (A)野生型、度)A16FJ、（C)V32F0、（D)S23AaW及巧)S28A0突变细胞的巧光产量。红色 光化的光线的强度为约80-90μEm2s1。
[0027] 图3A-图3J中显示在蓝色光化的光线存在与缺乏下，时间依赖型的闪光诱导的野 生型（A，巧、A16FJ度，G)、V32F0 (C，H)、S23Aa值，I)W及S28A0突变细胞化J)的巧光产 量。蓝色光化的光线的强度为（A)至似~65μΕm2s及（F)至（J)~400μΕm2s1。 其他条件与图2中的相同。
[0028] 图4中显示为野生型与突变类囊体膜的0CP含量的西方墨点分析。
[002引 图5A-图抓中显示在强蓝光化的光线存在与缺乏下，DCMU、DBMIBW及红光对时 间依赖型的闪光诱导的野生型细胞的巧光产量的影响。（A)添加lOmMDCMU，度）添加lOmM DBMIB，（C)无添加，（D)加上红色光化的光线。蓝色光化的光线的强度为~250μΕm2si。 (D)组中红色光化的光线的强度为~50-60μΕm2s1。其他条件与图2A-图沈中的相同。
[0030] 图6显示野生型与突变细胞在30°C在周围空气中W及来自巧光灯30μmolμE m2s1的环境下光合生长曲线。误差线表示二生物学重复的标准偏差。当误差线不能被看 到时，误差为比符号的尺寸小。
[0031]图7中显示集胞藻属（Synecho巧stis)PCC6803、蓝杆藻属（切anothece)PCC7822、 鱼腥藻属（An油aena)ATCC29413，W及纯顶节藻属（Art虹opiraplatensis)的（a)细胞色 素b559a多胜肤，（b)细胞色素b559 0多胜肤，W及（C)细胞色素PsbJ多胜肤的胺基酸 序列的比对。
【具体实施方