生物分子选自由碳水化合物、脂肪酸、蛋白质、胺基酸、胜 肤、色素、祗类、类胡萝l·素、维生素，或其他高价值生物分子所组成之群组。
[0065] 于某些具体实施例中，该突变型蓝绿藻细胞是培养于正常条件下，例如溫度范围 自25至45°C，在白光或日光下，在一光反应器或池塘中。
[0066] 本发明的方法在用于各种应用的生质生产上具有价值，例如生物能源应用与生物 燃料的商业生产（如，脂质、酒精或氨气）、粮食、饲料W及其他有价值的商业产品。
[0067] 本发明进一步藉由下列实施例所阐述，其系提供作为示范之目的而非用于限制。 本领域之技艺者应当，根据本发明之掲露，理解在所掲露之特定的具体实施例中可W产生 许多变化，且仍可得到相同或类似的结果而不背离本发明之精神与范围。
[006引实施例
[0069] 在我们的研究中，我们构筑了数个集胞藻（Synecho巧stis)PCC6803的细胞色素 bew和PsbJ突变细胞，其在所提议的PSII内的Q。传输通道的开口附近带有突变。数个突 变细胞表现出对0CP调节的非光化学巧光泽焰有严重的抑制效果W及显着加速巧光产量 的黑暗恢复。我们的数据表明，在细胞色素b559与PsbJ上的突变可改变APC核屯、复合物 与0CP的相互作用，并导致上述效果。此外，DCMU与DBMIB处理对在野生型细胞中的0CP调 节的光保护作用没有显着的影响。我们的研究结果表明，0CP调节的光保护作用并不直接 由色素体酿池（plastoquinonepool)的氧化还原状态调节。此外，相较于在正常生长条件 下的野生型细胞，数个突变细胞显示出提高的光合生长和生质生产。我们的研究结果表明， 在蓝绿藻中OCP调节的光保护作用的调节具有提高的生质生产的潜力，生质生产具有实际 应用W提高在蓝绿藻中的生质和生物燃料的生产。
[0070] 1.材料与方法
[0071] 1. 1集胞藻（Synecho巧stissp.PCC6803)细胞的生长与制备
[007引野生型与突变集胞藻细胞在BG-11培养基中光自营生长。培养物在30°C、带有约 30ymol光子m2si强度的生长光条件下繁殖。培养物连续通入无菌加湿空气。收获在指 数增长（0073。0. 7-1. 2)期的培养液，并用于生化与功能分析。
[007引1. 2细胞色素bs59与PsbJ突变的构筑
[0074] 细胞色素b559与PsbJ的胺基酸残基的点突变系根据参考文献的寡核巧酸衍 生的诱导突变来引入质体PA巧5犯恤巧0，31 ]。该突变是由突变质体转型至该集胞藻 (Synecho巧stissp. )PCC6803细胞的宿主菌株（Aps祀化J)所构筑而成。突变体在含有抗 生素Em(0.lyg/mL)的固体培养基中被筛选，直到突变基因完全被分离。WPCR验证在运 些突变细胞中的突变基因是否完全分离。
[00巧]1. 3光合作用氧气释放的测量
[0076] 氧气释放的稳定状态速率W适合水套细胞培养箱（water-jacketedcell)的 Clark-型氧电极（YSI型号5331氧气探针）测量。浓缩的细胞被稀释到置于25°C揽拌的水 套细胞培养箱中的生长培养基中。2mM的铁氯化钟与2mM2, 6-二氯对苯酿值CB曲在加入细 胞前立即被加入，W作为BG11培养基的人工电子受体。藉由二个光纤照明值olan-Jenner modelMI150)由水套细胞培养箱的二测提供饱和照明。
[0077] 1. 4在295K下测量叶绿素a巧光
[0078]W-双脉冲幅度调制（pulse-ampli1:ude-modulation，PAM)巧光仪（瓦尔茨，德 国）在295K下测量叶绿素a巧光。根据参考文献，W叶绿素为基础的细胞的相对PSII含 量由可变叶绿素a巧光的总产量（Fmgy-F。）估算而得，该产量系在DCMU和径胺的存在下测得 巧1-33]。图说中描述了时间依赖性闪光诱导瞬态的PSII巧光产量的测量实验条件，W及 响应一给予野生型及突变细胞的饱和闪光的从Qa到QB的电子转移的动力学。
[0079] 1.5MP与Μ膜的制备
[0080]ΜΡ与Μ类囊体膜根据文献而分离[10]。
[0081] 1. 6凝胶电泳分析与西方墨点分析
[008引ΜΡ与Μ部分相当于2μg的叶绿素WSDS-PA(iE在12%聚丙締酷胺/2Μ尿素凝胶 上于Tris/MES系统化ashino等人，2001年）中分离。对于0CP蛋白的检测，使用对0CP专 一的兔抗血清作为一级抗体（由AdjeleWilson提供），而与过氧化物酶结合的山羊抗兔抗 体则用来作为二级抗体（Sigma公司）。使用WesternLi曲tningPlus-E化(Perki址Imer 公司）来显现条带。
[0083] 1.7生质的决定
[0084] 培养物在30°CW及来自白色巧光灯30μπιο1μΕm2si的光量下光自营生长。于 126小时后收获100ml液体培养物并W离屯、浓缩到5ml。该5ml样品在侣盘上于105°C下进 行烘箱干燥24小时，冷却至室溫，并测量干重。
[00财1. 8野生型及突变型细胞中生质组成的FT-IR测定
[0086] 将野生型及突变型细胞的30ml培养物予W浓缩并重新悬浮至约50微升。取4微 升的悬浮液涂布于ConcentratIR?多重反射ATR附件的娃ATR采样板（Harrick,USA)，然 后在室溫下风干。使用红外线光谱仪度rukerVertex70,German)纪录脂质、蛋白质及醋 类分别于2800 - 3000cm-l, 1500 - 1700cm-l及1000 - 1200cm-l的特征波锋。野生型及突 变型细胞的生质组成依据文献（Pistoriousetal.，2009)记载予W分析。
[0087] 结果
[0088] 2. 1突变细胞的生长与光合特性
[0089] 在所提议的Qc传输通道的开口附近的细胞色素b5W与PsbJ的数个位置直接突变 被构筑于实验模型蓝绿藻集胞藻（Synechocystis)PCC6803中。光饱和氧气释放出活性W 及本研究中所讨论的该突变株的预估PSII含量都列于表1中。所有运些突变的细胞与野 生型细胞一样光自营生长。此外，最大氧气释放速率与运些突变细胞的预估PSII含量皆类 似于野生型细胞（表1)。
[0090] 表1野生型与突变细胞的一般特性
[0091]
[0092] 2. 2在295K下测量叶绿素a巧光
[009引 图1显示在缺乏DCMU下，响应给予野生型、A16FJ、V32F0、S23Aa与S28A0突变 细胞的饱和单线周转闪光的Qa的诱导与衰变。在缺乏DCMU下巧光衰变主要是因为由Qa到 Qe与QB的电子转移巧4]。我们的结果表明，在运些突变细胞中由QA到Qe与Qe的电子转 移速率的动力学非常相似于野生型细胞的；除了在S23Aa细胞的巧光衰变动力学中存在 非常缓慢相的些微增加之外，其可能是因为在Qa与PSII电子供体之间电荷重组。表1中 列出的其它突变细胞皆显示由Qa到Qe与QB的正常电子转移与野生型细胞一样（数据未 显示）。此外，在DCMU的存在下，响应给予野生型及突变细胞的饱和闪光的QA与PSII电 子供体之间的电荷重组的动力学，与由叶绿素a巧光所测量的非常相似（数据未显示）。运 些结果表明，在运些突变细胞的PSII内Μη团簇与Qa通常完好。
[0094] 2. 3在红色光化光的存在与缺乏下PSII巧光的产量
[0095] 图2所示为在红色光化光存在与缺少的情况下，野生型与突变细胞的时间依赖型 闪光诱导瞬变的PSII巧光产量。相较于暗适应的野生型细胞，在暗适应的突变细胞中F。值 略微较高且最大PSII巧光产量（FyFm,|"胃）正常。此外，相较于野生型细胞，在红色光化光 存在下，运些突变细胞显示不同的时间依赖型闪光诱导瞬变的PSII巧光产量（见图2)。在 野生型细胞中的稳定态巧光产率（Fs)通常显示出初始增加，然后在光化光线照射期间逐渐 降低到一个稳定的含量。相较之下，在光化光线照射期间，在运些突变细胞中的Fs含量相 对平坦。运结果可W归因于相较于野生型细胞，在光化光线照射期间，突变细胞的伴随状态 转变的巧光产量中的微妙变化（[35, 36]W及其中的参考文献）。此外，在红色光化光照明 (80-90μΕm2si)后，最大PSII巧光产量的振幅（Fm')与那些黑暗中的突变细胞的Fm可 相比。我们的研究结果表明，运些突变细胞在我们的实验条件下对于光抑制没有显现出任 何显着的效果。
[0096] 2. 4蓝光诱导突变细胞上的NPQ的效果
[0097] 在运些突变细胞中最显着的表现型是图3中蓝光诱导的NPQ的抑制效果。当野生 型细胞W中间强度（约60μΕm2si)的蓝色光化光照射时，起初其巧光产量略有增加（可 能是因为状态转换效果），然后因为蓝光NPQ效果而逐渐下降（见图3A)。相较之下，当 A16FJ、V32F0、S23AaW及S28A0突变细胞W中间强度（约60μΕm2si)的蓝色光化光照 射时，其巧光产量比野生型细胞（因为状态转换效果）显现出明显的增加至较高的含量，但 并未显现出任何蓝光诱导NPQ的显着效果（见图3B、图3C、图3D、图3E)。当野生型细胞W 400μΕm2s1蓝色光化光照射时，在其巧光产量中强烈的泽焰被诱导，且在蓝色光化光照射 期间，稳定态巧光（Fs)的含量下降到低于F。水平（图3F)。一旦关闭蓝色光化光，Fm'与F。' 慢慢恢复到黑暗中的初始含量。相较之下，运些突变细胞在相同的实验条件下只显现出巧 光产量的些微减少（图3G、图3H、图31、图3J)。另外，当蓝色光化光被关闭时，在运些突变 细胞中的NPQ恢复几乎在6分钟内完成，而在野生型细胞中的NPQ恢复则显着较慢。我们 的研究结果表明，在运些突变细胞中，蓝光诱导的NPQ的效果受到严重抑制，且NPQ的黑暗 恢复则显着地加速。A16RJ、A20FJ与S28V0突变细胞也表现出对蓝光诱导的NPQ严重的抑 制效果，如同上述提到的运些突变细胞（数据未显示）。相较之下，其他突变细胞（A16SJ、 A16LJ与G19FJ)在表1中显示出如同野生型细胞的正常蓝光诱导的NPQ效果。
[0098] 2. 5西方墨点分析
[0099] 为了确定运些突变细胞是否具有如野生型细胞的0CP正常含量，在图4中对野生 型与突变类囊体膜的0CP含量进行西方墨点分析。我们的研究结果表明，A16FJ、V32F0与 S28V0突变株的类囊体膜仍然具有如野生型细胞的0CP正常含量。因此，我们的结果得出 运样的结论，在运些突变细胞中的0CP诱导的NPQ的抑制效果不是因为缺乏0CP而造成的。
[0100] 2. 6在集胞藻6803中DCMU与DBMIB在0CP调节的NPQ上的效果
[010。 图5所示为在DCMU的存在下（图A)、DBMIB的存在下（图B)、未添加（图C)带 有蓝色光化光，W及未添加蓝色及红色光化光（图D)下，在集胞藻6803的野生型细胞内 0CP调节的NPQ。在光化光照射的期间，DCMU的存在会诱导在集胞藻6803细胞中的PQ池的 氧化。相较之下，在光照期间，DBMIB的存在会使集胞藻6803细胞的PQ池更为还原（见图 5B)。另外，蓝色加红色光化光（见图5D)的照明也会使集胞藻6803细胞的PQ池比蓝色光 化光的单独照明时更加还原（见图5C)。我们的研究结果在图5表明，DCMU与DBMIB处理 W及蓝色加红色光化光照明，对野生型细胞中的OCP调节的光保护没有显着的改变。我们 的研究结果表明，PQ池的氧化还原状态的改变并未显着地改变在集胞藻6803细胞中的OCP 调节的光保护。
[0102] 2. 7突变细胞的光合生长速率与生质分析
[0103] 图6显示野生型与突变细胞的光合生长曲线。我们的研究结果表明，相较于 野生型细胞，A16FJ与V32F0突变细胞显示出显着较高的光合生长速率。在野生型、 A16FJ与V32F0突变细胞中光合生长速率的倍增时间分别为17. 2 + 0. 2、15. 7 + 0. 1、 15. 7 + 0. 2(见表2)。此外，在A16FJ与V32F0突变细胞的5天培养物中的生质浓度（分别 为 0. 280 + 0. 020W及 0. 303 + 0. 017)比野生型细胞（0. 213 + 0.Ollmg/ml)显着较高（见 表2)。因此，我们的结果表明，相较于野生型细胞，在A16FJ与V32F0突变细胞中光合生长 速率与生质生产显着增加。
[0104] 表2在野生型与突变细胞中的光合生长速率与生质生产 [01051
[0106] 培养物在30°C在周围空气中W及来自白色巧光灯30μπιο1μΕm2si的环境下生 长。在指数生长期测量细胞的光合生长速率。在约生长126小时后，测量培养物的生质浓 度。误差线表示Ξ个独立实验的标准误差。此外，我们的FT-IR分析显示相较于野生型细 胞在正常生长条件下，脂质、蛋白质及糖类含量于A16FJ与V32Fβ突变细胞含量较高。
[0107] 3.讨论
[0108] 3. 1细胞色素b559与PsbJ上的突变改变在蓝绿藻中蓝光诱导的NPQ
[0109] 我们的研究结果表明，在数个细胞色素bssg与PsbJ突变细胞中，蓝光诱导的NPQ被 显着地抑制。先前的研究已经证明，在体外的OCP的活化的红色形式与藻胆体相互作用，并 诱导蓝绿藻中的NPQdOCP的相互作用部位被提出为碱性圆柱的中央别藻蓝蛋白（APC)盘之 一[16，17]。此外，我们的西方墨点分析结果进一步表明，在A16FJ、V32F0化及S28Va突 变类囊体膜中0CP的量，与野生型类囊体膜相似。因此，在运些突变细胞中0CP诱导的NPQ 的抑制，并不是因为0CP的缺乏所造成。此外，DCMU、DBMIB与蓝色加红色光化光处理并不 会显着改变在集胞藻6803中0CP诱导的NPQ。我们的研究结果与先前的研究结果一致，运 表明在蓝绿藻中0CP诱导的NPQ不受跨类囊体的抑值或PQ池的氧化还原状态的改变所影 响，但却依赖光的福射与质量[10]。
[0110] 此外，一些突变细胞，例如A16FJ、V32F0、G19FJ、A20FJ，在表1中显示正常光合水 氧化作用，W及自Qa至Qe与Qe的电子转移的动力学。因为运些