一种茎瘤芥根瘤内生细菌gj-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于内生菌技术领域，具体涉及一种茎瘤芥根瘤内生细菌sub tilis ) GJ-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用。
[0002]
【背景技术】
[0003]芸笞根肿菌{Plasmod1p hora brassicae fforon)属于原生生物界根肿菌门根肿菌纲根肿菌目根肿菌科，其主要危害白菜、油菜、榨菜、萝卜等十字花科植物，造成植物根部肿大，影响植物吸收，同时根肿菌侵染造成植物根系表皮破裂，土壤其他病原菌侵入，导致植物根系腐烂，植株矮小黄化甚至死亡，严重减产。芸薹根肿菌可在土壤中长期存活，一旦田间发病，难以消除，田块无法继续种植十字花科作物。近年来，随着我国十字花科作物种植面积的增加、种子和蔬菜广泛调运、连作年限增加等因素的影响，我国十字花科根肿病发生逐年加重，严重威胁十字花科作物的生产。
[0004]棒菜(莖瘤芥)CSrawica juncea var.tumidaTsen etLee)属十字花科芸薹属芥菜种叶芥亚种大叶芥变种的变种。“涪陵榨菜”已经成为我国重庆的特色农业，涪陵区榨菜的种植面积和产量均居全国第一位。自1994年在涪陵地区发现榨菜根肿病起，目前该病已成为榨菜的主要病害，田间发病率30-50%，发病田块很难再继续种植榨菜，造成榨菜种植面积下降，严重威胁榨菜的可持续发展(高明泉，彭洪江，王旭，等.涪陵榨菜根肿病的危害与产量损失测定.植物保护，2002，28(6): 31-33 ;肖崇刚，郭向华，韩海波，等.涪陵榨菜根肿病病菌鉴定及主要特性.西南农业大学学报，2002，24(4): 539-541)。涪陵地区榨菜种植连作年限达10-20年，单一作物长期连作会导致连作障碍，造成土壤酸化、土壤微生物生态系统失衡、土传病害增加等问题(.Zhang X, Pan Z, Zhou X, et al.Autotoxicity and Continuous Cropping Obstacles:A Review.Chinese Journal of Soil Science,2007, 4: 33-38)。目前，涪陵地区榨菜连作田土壤已经呈现酸化，根肿菌休眠孢子在酸性环境下更容易存活(Narisawak, Ohhi K T, Hashiba Τ.Suppress1 η of clubroot andverticilli um yellowsin Chinese cabbage in the field by the root endophyticfungus Heteroconi umchaetospir a.Plant Pathology, 2000, 49: 141-146)，这也导致根肿病逐年加重。作为土传病害，根肿病的发生与土壤微生物、植物根系分泌物和土壤理化性质密切相关。
[0005]
【发明内容】
针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是:如何提供一种能够抑制根肿病的内生细菌和根肿病防治剂，使其可应用于根肿病防治中，有效降低茎瘤芥的根肿病病情指数。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillus sub tilis) GJ-06，其分类命名为枯草芽抱杆菌 GJ-06 (Bacillus sub tilisGJ-伙?)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年11月9日，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2015665 ;所述茎瘤芥根瘤内生细菌{Bacillus subtil is) GJ-06 的 16SrDNA 序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0007]上述茎瘤芥根瘤内生细菌subtil is) GJ-06在根肿病防治中的应用。
[0008]一种根肿病防治剂，其组分包括上述莖瘤芥根瘤内生细菌{Bacillus sub tilis)GJ-06 ;其中，上述茎瘤芥根瘤内生细菌(也ciWys仰况iWs) GJ-06作为有效成分。
[0009]上述根肿病防治剂在根肿病防治中的应用。
[0010]相比现有技术，本发明具有如下有益效果:
1、本发明从茎瘤芥中分离出内生细菌，并通过试验研究发现，内生细菌GJ-06将茎瘤芥的根肿病病情指数从75.3降低到36.1，对茎瘤芥根肿病的抑制达到52%，可有效减缓田间根肿病发病程度，取得了意想不到的效果。
[0011]2、接种本发明GJ-06菌株的茎瘤芥发病时间较晚，茎瘤芥产量与健康菌株相当，经第二年田间试验表明，该菌可以稳定地抑制茎瘤芥根肿病，具有良好的稳定性。
[0012]3、本发明根肿病防治剂以茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06为有效成分，且通过研究发现当该根肿病防治剂中GJ-06的浓度为2X 10scfu -mL 1时，对茎瘤芥根肿病抑制效果更好，抑制率达到52%。
[0013]
【附图说明】
[0014]图1为内生细菌GJ-06的高倍显微镜图；
图2为内生细菌GJ-06的扫描电镜图；
图3为接种根肿病内生细菌GJ-06后茎瘤芥发病程度图。
[0015]
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。下述实施例中使用的化学药品如无特殊说明，即为普通市售产品。
[0017]实施例1
茎瘤芥根部内生细菌的分离:
将茎瘤芥(永安小叶)根肿病产生的根结和健康根表面消毒，放入无菌研钵中研磨成浆液，涂布于NA平板(牛肉浸膏3 g/L，蛋白胨2.5 g/L，葡萄糖5 g/L，琼脂16g/L。)上，37°C培养48 h后，挑取细菌菌落，纯化，备用。
[0018]将分离得的根瘤内生细菌，经菌落形态及革兰氏染色初步鉴定，共得到8株内生细菌，初步标号为 GJ-01、GJ-02、GJ-03、GJ-04、GJ-05、GJ-06、GJ-07、GJ-08，采用 NA 培养基液体发酵培养，培养条件37°C培养12 h，用于后续试验，以清水为对照(CK)。
[0019]实施例2
内生细菌的鉴定:
以细菌通用引物16SrDNA序列为设计引物(16S-F: agagtttgatcctggctcag，16S-R:tacggctaccttgttacgactt)，利用 PCR 方法(95 °C , 5min ；95 °C，30s，55 °C，30s, 72 °C，lmin30s，32cycle ；72 °C，lOmin ；12 °C , forever)扩增 GJ-06 菌株的16SrDNA序列，将扩增的序列转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆测序，在NCBI比较分析确定其分类地位；结果显示GJ-06与细菌域、厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属细菌16SrDNA序列一致性为100%，表明该菌属于枯草芽孢杆菌。
[0020]对GJ-06菌株进行高倍显微镜(目镜十倍，物镜100倍，放大1000倍)和扫描电镜表征，分析其形态特征，确定内生细菌种类。结果如图1和图2所示，单个细胞0.7-0.8X2-3微米，无荽腥，周生鞭壬，能运动，芽孢0.6椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏。其结构特征也与枯草芽孢杆菌相符，因此，鉴定该菌为枯草芽孢杆菌。
[0021]实施例3
内生细菌对茎瘤芥根肿病的抗性分析:
选择根肿病病发病重的茎瘤芥地块进行，在移栽时，将茎瘤芥幼苗截根处理，
将100 mL实施例1培养后的八种菌株悬浮液(IX 109 cfu.mL ')分别加水至500 mL并混合均匀，进行浸根每个处理100棵，3次重复操作。以清水为空白对照，小区随机排列，管理同一般大田。分别在处理区和对照区调查田间病株率和病情指数，测算处理区菌株的防治效果。
[0022]将茎瘤芥根肿病严重度分级定为5级，其标准为(高明泉，2012):
0级:健株。
[0023]1级:侧根发病，肿瘤小而少，呈白色，对植株生长无或轻微影响，产量损失为0-5 %。
[0024]2级:肿瘤主要在主根中部、上、下侧根多，或侧根上肿瘤大而多，呈白色或米黄色，对植株生长有一定影响，但地上部分无明显症状，产量损失6-20%。
[0025]3级:主根肿瘤大且变黑，表面粗糙龟裂，有少量侧根，地上部分生长受阻，中心叶片变为深绿色，在阳光下出现轻度萎蔫，产量损失21-35%。
[0026]4级:主根肿瘤龟裂或腐烂变黑，几乎无侧根，地上部分生长严重受阻，株型矮小，叶色暗绿，菜头小且皮厚筋多，在阳光下，整株严重萎蔫，极易拔起，产量损失(不包括无实际收获价值的病株)在36%以上。
[0027]分别将8株内生细菌接种于大田栽种的茎瘤芥幼苗，收割前统计根肿病病情指数。结果如图3所示:接种根瘤内生细菌GJ-06的处理，根肿病的病情指数为36.1，显著低于其他菌株及对照(病情指数为75.3)的病情指数，使病情指数从75.3降到36.1，该菌株对茎瘤芥根肿病的防治达到52%，可有效减缓田间根肿病发病程度。同时接种GJ-06菌株的茎瘤芥发病时间较晚，茎瘤芥产量与健康菌株相当，经第二年田间试验表明，该菌可以稳定地抑制茎瘤芥根肿病。由此可见，GJ-06菌株对茎瘤芥根肿病具有良好的防治效果。
[0028]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.一种莖瘤芥根瘤内生细菌(Bacillus sub til is) GJ-06，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年11月9日，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2015665。2.根据权利要求1所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtil is) GJ-06,其特征在于，所述莖瘤芥根瘤内生细菌(■feciWiA? sub tills) GJ-06的16SrDNA序列如SEQ ID N0.1所示。3.权利要求1或2所述茎瘤芥根瘤内生细菌(Bacillussubtil在根肿病防治中的应用。4.一种根肿病防治剂，其特征在于，其组分包括权利要求1或2所述茎瘤芥根瘤内生细觀Bacillus subtil ism ;其中，权利要求1或2所述茎瘤芥根瘤内生细菌subtilis)QyQ^作为有效成分。5.根据权利要求4所述根肿病防治剂，其特征在于，所述茎瘤芥根瘤内生细菌{Bacillus subtil is) GJ-06 在防治剂中的浓度为 2X 108cfu.mL:06.权利要求5所述根肿病防治剂在根肿病防治中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06、含有该内生细菌的根肿病防治剂及应用，所述茎瘤芥根瘤内生细菌（<i>Bacillus？subtilis</i>）GJ-06保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年11月9日，菌种保藏号为CCTCC？NO：M？2015665；所述根肿病防治剂包括上述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06，上述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06作为有效成分；所述茎瘤芥根瘤内生细菌GJ-06和根肿病防治剂可在根肿病防治中应用。本发明内生细菌GJ-06将茎瘤芥的根肿病发病指数从75.3降低到36.1，对茎瘤芥的防治率达到52%，可有效减缓田间根肿病发病程度，取得了意想不到的效果。CCTCC NO：M201566520151109
【IPC分类】A01P3/00, C12R1/125, C12N1/20, A01N63/00
【公开号】CN105368754
【申请号】CN201510910792
【发明人】王殿东, 潘丽梅, 谭永忠, 王旭祎, 田雪亮, 曾甜, 姜清敏
【申请人】长江师范学院
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月10日