D-丙氨酸缺陷型筛选表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶 的重组枯草芽抱杆菌及其构建方法和应用，具体设及一种CE酶在枯草芽抱杆菌中的食品 级表达，属于酶的基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 纤维二糖-2-差向异构酶（CE酶)可W催化多种醒糖C2位的差向异构化及异构化 反应，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可合成多种碳水化合物。目前，CE酶能催化乳糖 进行差向异构化反应生成依匹乳糖，利用单一底物乳糖生产依匹乳糖。
[0003]随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构 越来越受到人们的关注。新型的薦糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重 要的经济价值的当务之急。依匹乳糖最早是在杀菌后的乳糖溶液中发现的，它是乳糖的异 构体。实验证明依匹乳糖不能被小鼠的肠酶消化，B.bifidum、B.longum、B.breve、B. adolescentis、B.catenulatum运些益生菌都能在含依匹乳糖的培养液中增值。证明依 匹乳糖具有益生元效果。除此之外，依匹乳糖还能促进巧在小肠内的吸收，增加盲肠壁的重 量，提升短链脂肪酸和其他有机酸的含量，降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含 量。由此可知依匹乳糖作为保健食品的原料具有很好的前景。
[0004] 尽管依匹乳糖能够在高溫高压下被化学方法合成，但运会产生很多副产物，因此 该化学方法没有实际的应用价值。依匹乳糖还可W由P-硝基苯基半乳糖和甘露糖作为底 物，经β-半乳糖巧酶催化合成，但该反应同样有β-1，3和β-1，6副产物出现，而且成本 很高。所W用纤维二糖-2-差向异构酶催化得到依匹乳糖是目前生产依匹乳糖最可行的方 法。
[0005] 枯草芽抱杆菌（《acinussuAiWis)是芽抱杆菌的一个种，有长期制备发酵食品 的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局（抑A)和中国 农业部等部口批准为食品级安全菌株。历suA。知5表达系统没有明显的密码子偏 好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯 化等后续操作，并且遗传背景研究比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记 的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽抱杆菌及其构建方法和应用，可用于转化乳 糖生成依匹乳糖，对依匹乳糖的食品生产具有重要的意义。
[0007] 按照本发明提供的技术方案，一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二 糖-2-差向异构酶的重组枯草芽抱杆菌，其分类命名为枯草芽抱杆菌SK40. 001(《acinus 細公。7片?）SK40. 001，已保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号CCTCCNO:M2015582。
[0008] 所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯 草芽抱杆菌的构建方法，包括敲除枯草芽抱杆菌1A751(MonikaWolf,AttilaGeczi, OrtwinSimon,RainerBorriss;Microbiology1995Vol. 141No. 2P281-290)染色体 上的D-丙氨酸消旋酶基因?Λ得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽抱杆菌1A751 (泌y); 将来源于嗜热厌氧杆菌（巧erazoaftsereiAac妃τ/ω??saccAgroXTiici/a?JW/化-YS485)(化ao WL,DebloisS,WiegelJ;AppliedandEnvironmentalMicrobiology1995Vol.61 NO. 3P937-940)的纤维二糖-2-差向异构酶CE基因和P43启动子构建至质粒pUBllO(K ΜKeggins,PSLovett,EJDuvall;PNAS1978Vol. 75No. 3P1423-1427)中得到 pUB-P43-TsCE;用D-丙氨酸消旋酶基因泌y代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm 作为筛选标记的可复制质粒pUB-P43-TsCE-dal;并转化枯草芽抱杆菌1A751 (泌7)中表 达，得lA751-pUB-P43-TsCE-dal，即获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二 糖-2-差向异构酶的重组枯草芽抱杆菌SK40. 001，即CCTCCNO:M2015582。
[0009] 所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草 芽抱杆菌的构建方法，具体步骤为： (1) 在枯草芽抱杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因泌7的上、下游各 选取800-900bp长度的片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收；选取 7〇￥71-巧7|^7〇￥66抗性基因片段作为筛选标记，将上、下游同源臂和7〇￥71-巧7|^7〇￥66 片段通过融合PCR将Ξ段基因连接在一起；将PCR产物转入枯草芽抱杆菌1A751感受 态中，在含有壮观霉素WC的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草 芽抱杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因?Λ得到D-丙氨酸缺陷型的宿主 1Α751{dal)-spc； (2)将pTSC(《acj7y"6·Ge打eiic沉oc左仿打妃raccessionno.ECE204)质粒导入上述 宿主1A75U泌y)-spc中，在含有红霉素的平板上筛选，在IPTG(异丙基硫代半乳糖巧）的 诱导下，表达重组酶化e，在重组酶化e的作用下，知x71和7〇?66位点发生重组，将巧7C抗 性基因删除，并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽抱杆菌1Α751 (泌7); (3) 在CE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子Ρ43,并与CE酶基因组成表达单元 P43-TSCE，然后构建至质粒pUBllO中，得到质粒pUB-P43-TsCE; (4) 敲除质粒pUB-P43-TsCE上的抗生素抗性基因Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶基因 泌7构建至表达载体pUB-P43-TsCE中，得到质粒pUB-P43-TsCE-dal; (5) 将重组质粒pUB-P43-TsCE-dal转入宿主1A751(泌y)感受态中，在LB平板上 筛选，从而获得重组枯草芽抱杆菌lA751-pUB-P43-TsCE-dal，即SK40. 001，即CCTCCNO:M 2015582ο
[0010] 增强表达，在CE酶基因的上游添加Ρ43启动子，Ρ43启动子的核巧酸序列如SEQ IDNO. 1中1-300位所示。
[0011] 所述质粒pUB-P43-TsCE-dal其中含有沈QIDNO. 1中301-1476位所示的CE酶 基因，和SEQIDNO. 2所示的D-丙氨酸消旋酶基因?Λ代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan 和博来霉素Blm作为筛选标记。
[0012] 一种枯草芽抱杆菌宿主1Α751(?7)，其为敲除枯草芽抱杆菌1A751染色体上的 D-丙氨酸消旋酶基因泌及所述的重组质粒pUB-P43-TsCE-dal转化的宿主。
[0013] 所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草 芽抱杆菌的应用，用于在化学、食品及制药领域，具体用于生产依匹乳糖。
[0014] 本发明的有益效果：本发明提供一株表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽 抱杆菌lA751-pUB-P43-TsCE-dal，可W乳糖为底物，生产依匹乳糖。该重组菌在化学、食品 和制药领域中具有重要的应用价值。
[0015] 生物材料样品保藏：一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向 异构酶的重组枯草芽抱杆菌，其分类命名为枯草芽抱杆菌SK40. 001 (历suAiWis) SK40. 001，保藏于中国典型培养物保藏中屯、，地址中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年9 月28日，保藏编号为CCTCCN0:M2015582。
【附图说明】
[001引图1 :D-丙氨酸缺陷型枯草芽抱杆菌1A751 (泌7)的构建过程。
[0017] 图2:食品级安全质粒pUB-P43-TsCE-dal构图。3R巧指代自主复制蛋白基因，利 于增加基因拷贝数。
[0018] 图3 :重组枯草芽抱杆菌SK40. 001发酵及酶活曲线。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1:D-丙氨酸缺陷型的枯草芽抱杆菌1A751 (泌7)的构建 表1D-丙氨酸缺陷型的枯草芽抱杆菌1Α751(?7)的构建所用引物对
W质粒p7S6为模板，引物对Ρ3/Ρ4将知x71-w^知诚6抗生素抗性基因片段扩增并回 收。
[0020] 在枯草芽抱杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因泌7两侧选择800-90化P 长度的片段作为同源区域，将两端的同源区域分别用引物对P1/P2及P5/P6扩增并回收。 [002。 用引物对P1/P6将两端同源臂片段与抗生素知乃1-6·饼-知诚6通过PCR技术融合 在一起。
[0022] PCR反应体系：0.2血PCR管中按顺序加入W下试剂：上、下游引物（P1/P6)各 1.5μΙ；5μΙPhusionHFbuffer(5X) ；2μΙlOmMdNTPmix(2. 5mMeach) ；2μΙ± 游同源臂；0. 5μΙ记巧1-邱说6;2μΙ下游同源臂；0. 5μΙPhusionhi曲-fidelity