DM聚合酶；加蒸馈水至终体积50μL。
[0023]PCR扩增条件：98°C预变性 30s;98°C变性 30s，55°C退火 15s，72°C延伸Imin(30 个循环）；72°C延伸lOmin。
[0024] 将PCR产物转化至枯草芽抱杆菌1A751 (泌y)感受态，在含有抗生素wc和D-丙 氨酸的平板上进行筛选，得到一株1A751 (泌7)-wc。
[00巧]导入pTSC质粒(南京农业大学，国新博±惠赠，NCBI accession no.抓864234)，在IPTG的诱导下表达重组酶化e，在重组酶化e的作用下，10x7/和lox旅?立点发生重组，抗 性基因677C被删除（图1)。
[0026] 最终获得D-丙氨酸缺陷型的枯草芽抱杆菌1Α751 (泌7)。
[0027] 实施例2 :食品级安全质粒pUB-P43-TsCE-dal的构建 表2食品级安全质粒pUB-P43-TsCE-dal的构建所需引物对
为增强表达，在CE酶基因的上游融合强启动子P43,构成P43-TSCE表达单元。利用引 物对P7/P9 扩增P43-TSCE片段。WpUB110(NCBI-Gene10:9507338)为出发载体，利用引 物对P8/P10,扩增载体骨架pUB。然后将P43-TSCE和pUB片段进行PCR，形成多聚体。
[0028]PCR反应体系：0. 2血PCR管中按顺序加入W下试剂：5μΙPhusionHFbuffer 巧X) ;2μΙlOmMdNTPmix(2. 5mMeach) ;2μΙP43-TsCE;2yLpUB;0. 5μΙPhusion hi曲-fidelityDM聚合酶；加蒸馈水至终体积50μL。
[0029]PCR扩增条件：98°C预变性 30s;98°C变性 30s，55°C退火 15s，72°C延伸Imin(30 个循环）；72°C延伸lOmin。
[0030] 将PCR所得形成的多聚体直接转化宿主1A751中，在含有Kan的平板上筛选，得到 质粒pUB-P43-TsCE。
[0031] 利用同样的方法，W枯草芽抱杆菌1A751染色体DM为模板，引物对P13/P14扩 增D-丙氨酸消旋酶基因（泌乃。W质粒pUB-P43-TsCE为模板，引物对P11/P12扩增载体 pUB-P43-TsCE(Kan,Blm)。将片段泌巧日pUB-P43-TsCE(Kan，Blm)相互PCR，转化宿 主1A751 (泌y)。在LB平板上筛选得到pUB-P43-TsCE-dal。（图2)。
[0032] 实施例3:重组菌的发酵 1.CE酶活测定方法：1血的反应体系中，加入800μL的用憐酸盐缓冲液（50mM，抑7. 0) 溶解的250mM乳糖，200μL的发酵液，65°C保溫15min，然后加肥1至终浓度200mMW终止 酶反应。
[0033] 2.用HPLC检测依匹乳糖的生成量，计算酶活。酶活单位（U):每分钟催化产生 lymol依匹乳糖所需要的酶的量。
[0034]3.用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37Γ，200rpm，培养 12~1地。W3%的接种量接种至发酵培养基中，37°C，200巧m，并定时取样，测定ODe。。，酶活数 据（图3)。
[0035] 种子培养基：膜蛋白腺（lOg/L)，酵母提取物巧g/L)，化Cl(10g/L)，W双蒸水配 制。
[003引发酵培养基：葡萄糖（15g/L)，酵母膏（15g/L)，化Cl (8g/L)，Μ拆〇4(lg/L)，Na2HP〇4(lg/L)，pH 7. 25, W双蒸水配制。
【主权项】
1. 一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽 孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌SK40. 001 (你ciWys仰SK40. 001，已保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2015582。2. 权利要求1所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶 的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的 D-丙氨酸消旋酶基因?Λ得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (W);将 来源于嗜热厌氧杆菌（TXeiTffoaftgeiOAacteri·saccAgiOXriic·JW/SL-YS485)的纤 维二糖-2-差向异构酶CE基因和P43启动子构建至质粒pUBllO中得到pUB-P43-TsCE; 用D-丙氨酸消旋酶基因代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选 标记的可复制质粒pUB-P43-TsCE-dal;并转化枯草芽孢杆菌1A751(W)中表达， 得lA751-pUB-P43-TsCE-dal，即获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二 糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌SK40. 001，即CCTCCNO:M2015582。3. 根据权利要求2所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构 酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于具体步骤为： (1) 在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因的上、下游各 选取800-900bp长度的片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收；选取 抗性基因片段作为筛选标记，将上、下游同源臂和 片段通过融合PCR将三段基因连接在一起；将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1Α751感受 态中，在含有壮观霉素的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草 芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因?Λ得到D-丙氨酸缺陷型的宿主 1Α751{dal)-spc； (2) 将pTSC质粒导入上述宿主lA751(W)-spc中，在含有红霉素的平板上筛选，在 IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，和位点发生重组，将 抗性基因删除，并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1Α751 (W); (3) 在CE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子P43,并与CE酶基因组成表达单元 P43-TsCE，然后构建至质粒pUBllO中，得到质粒pUB-P43-TsCE; (4) 敲除质粒pUB-P43-TsCE上的抗生素抗性基因Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶基因 W构建至表达载体pUB-P43-TsCE中，得到质粒pUB-P43-TsCE-dal; (5) 将重组质粒pUB-P43-TsCE-dal转入宿主1A751W)感受态中，在LB平板上 筛选，从而获得重组枯草芽孢杆菌lA751-pUB-P43-TsCE-dal，即SK40. 001，即CCTCCNO:M 2015582〇4. 根据权利要求2或3所述的基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差 向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：增强表达，在CE酶基因的上游添 加P43启动子，P43启动子的核苷酸序列如SEQIDNO. 1中1-300位所示。5. 根据权利要求2或3所述的基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差 向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：所述质粒pUB-P43-TsCE-dal其中 含有SEQIDNO. 1中301-1476位所示的CE酶基因，和SEQIDN0. 2所示的D-丙氨酸消旋 酶基因?Λ代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记。6. -种枯草芽孢杆菌宿主1A751 (W)，其特征在于其为敲除枯草芽孢杆菌1A751染 色体上的D-丙氨酸消旋酶基因W以及权利要求3所述的重组质粒pUB-P43-TsCE-dal转化的宿主。7.权利要求1所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的 重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：用于在化学、食品及制药领域，具体用于生产依匹 乳糖。
【专利摘要】基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌1A751为出发菌株，敲除其染色体上D-丙氨酸消旋酶基因(<i>dal</i>)得到D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(<i>dal</i><i>-</i>)；将来源于一种嗜热厌氧杆菌的纤维二糖-2-差向异构酶（CE酶）基因作亲本，在其上游融合P43启动子构建成P43-TsCE，将P43-TsCE构建至质粒pUB110中得pUB-P43-TsCE，将质粒pUB-P43-TsCE上的抗生素抗性基因卡那霉素和博来霉素用(<i>dal</i>)替代，构建成pUB-P43-TsCE-dal；将pUB-P43-TsCE-dal转化进宿主1A751(<i>dal</i><i>-</i>)中，得一株表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其保藏编号CCTCC？NO：M？2015582。发酵液总酶活达7U/mL，具有重要的工业应用价值。CCTCC NO：M 201558220150928
【IPC分类】C12N1/21, C12R1/125, C12N15/75, C12P19/24
【公开号】CN105368767
【申请号】CN201510779911
【发明人】沐万孟, 江波, 陈秋铭, 张涛
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月16日