骨架型黄体酮缓释微球及其制备方法和黄体酮缓释注射剂与流程

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种骨架型黄体酮缓释微球及其制备方法和黄体酮缓释注射剂。

背景技术：

习惯性流产指的是连续发生≥3次的自然流产，其发病诱因尚不完全明确，给病人心理带来巨大的伤害。复发性流产发病诱因繁多，并较为复杂，其主要有免疫因素、遗传以及内分泌紊乱等，因此给临床治疗带来一定的难度。根据相关实践研究表明，患有这种疾病的病人身体当中的黄体功能不全的为24％-68％。对于黄体缺陷的发生，研究者多认为是由于绝大多数试管婴儿周期中使用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasinghormoneagonist，gnrha)进行降调节，gnrha引起垂体抑制，使得垂体功能恢复相对推迟，导致妊娠早期黄体功能缺陷。临床应用试管婴儿等人工助孕技术30多年以来，黄体期药物支持治疗逐渐被公认为是有利于妊娠结局的一种干预手段。

黄体酮(progesterone，可简称prg)，又名孕酮，为白色或微黄色结晶粉末，熔点127～131℃，无臭，在空气中稳定，有右旋光性，不溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、二氧六环和浓硫酸。黄体酮的化学名称为：孕甾-4-烯-3,20-二酮，分子式：c21h30o2，分子量：314.47，结构式如下：

黄体酮能够使增值期内膜转化成为分泌期内膜，为受精卵植入、着床以及初期胚胎的营养支持提供便利条件。孕酮可以使细胞当中钠离子浓度明显升高，使肌纤维兴奋性明显下降，以及使肌纤维明显松弛，进而使宫缩明显减少，最终使胚胎在子宫当中继续进行生长发育；黄体激素对妊娠的积极作用主要体现在诱导子宫内膜向分泌期转变，增加内膜容受性以利于受精卵着床，以及作用于子宫局部，经一氧化氮等因子促使血管及平滑肌舒张而抑制宫缩。

临床上黄体酮应用剂型主要有口服胶囊、凝胶栓剂、肌注油溶制剂等，其中，黄体酮口服制剂给药方便快捷，患者易于接受，但是口服黄体酮会在胃肠道及肝脏迅速破坏，难以起到补充和治疗作用。由于黄体酮溶解度极低，且首过效应严重，口服生物利用度仅为10％。口服制剂往往通过增加表面活性剂浓度来提高黄体酮溶解度，不能从根本上解决黄体酮首过效应强、生物利用度低的问题；每天的给药剂量仍需很大才能达到疗效，导致副作用较大。因此，临床上普遍使用油溶液肌注，价格也相对低廉。

但是，现有的黄体酮注射剂为油溶液注射剂，需每天注射，长期注射(约12周)。油溶液注射时极易引起患者不适，如疼痛、局部红肿、过敏等症状，个别病理报道甚至指出肌肉注射黄体酮可诱发急性嗜酸性粒细胞肺炎。且油剂黄体酮半衰期长，通常要数周时间才能恢复。长期高频次注射也会导致注射部位产生硬结等其他症状，不利于注射部位组织健康。患者均为孕妇，每天注射黄体酮极为不便，且黄体酮注射存在油溶剂易引起肌肉板结、疼痛等问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请提供一种骨架型黄体酮缓释微球及其制备方法和黄体酮缓释注射剂，本发明提供的黄体酮缓释微球可用作肌肉注射剂，载药量高，体内外持续释放时间长，且注射刺激性小，患者顺应性好。

本发明提供一种骨架型黄体酮缓释微球，其由包括黄体酮和聚合物材料的物料制成，所述聚合物材料选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯和聚乙醇酸中的一种或多种；所述聚合物材料的分子量为4000～40000道尔顿；所述聚合物材料与黄体酮的质量比为9:1～1:1；

所述骨架型黄体酮缓释微球的粒径为1～10μm。

本发明提供一种骨架型黄体酮缓释微球的制备方法，包括以下步骤：

1)将包括黄体酮和聚合物材料的物料进行热熔挤出，得到挤出物；所述聚合物材料与黄体酮的质量比为9:1～1:1；所述聚合物材料选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯和聚乙醇酸中的一种或多种；所述聚合物材料的分子量为4000～40000道尔顿；

2)将步骤1)得到的挤出物在低温下进行粉碎过筛，得到粉碎物；

3)将步骤2)得到的粉碎物进行湿法研磨，经干燥，得到骨架型黄体酮缓释微球。

为解决黄体酮临床应用剂型上的不足，本发明人经大量研究发明了可用于肌肉注射的黄体酮缓释微球，药物包埋于生物可降解、组织相容性良好的聚合物材料内，体内外均可持续缓释一周以上，安全性较强，刺激性小，提高患者顺应性。另外，本发明的目的还在于制备过程不使用任何有机溶剂，从而杜绝了有机溶剂残留的问题。

为实现上述目的，具体而言，本发明实施例包括以下步骤：

(1)将定量的黄体酮和聚合物材料均匀混合，混合后的物料置于双螺杆挤出机进行挤出；

(2)将步骤(1)得到的挤出物在低温下进行粉碎过筛；

(3)将步骤(2)得到的粉碎物置于湿法循环式球磨机中进行研磨处理，再将研磨液进行冷冻干燥，得到骨架型黄体酮缓释微球。

本发明以生物可降解的聚合物材料为载体原料，所述聚合物材料选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚乳酸(pla)、聚己内酯(pcl)和聚乙醇酸(pga)中的一种或多种，优选为生物可降解的聚合物plga，其在环保性和注射应用性等方面的效果最佳。考虑材料的降解周期，本发明首选降解时间短的plga作为载体，可使长效注射剂给药周期为一周一次。在本发明的一些实施例中，plga的乳酸和羟基乙酸的摩尔比例为50：50；在本发明的另一些实施例中，plga的乳酸和羟基乙酸的摩尔比例为75：25。

在本发明中，所述聚合物材料的分子量为4000～40000道尔顿；具体地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量可为10000-40000道尔顿；聚乳酸的分子量可为10000-20000道尔顿；聚己内酯的分子量可为4000-40000道尔顿；聚乙醇酸的分子量可为8000-20000道尔顿。在本发明的一些实施例中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000-20000道尔顿。

在本发明中，活性成分为黄体酮，载体可为生物可降解的聚合物plga。本发明实施例可采用经预处理的聚合物材料，通过热熔挤出技术，将包括黄体酮和聚合物材料的物料制备成条状药物，粉碎后经湿法研磨，冷冻干燥即得。在进行热熔混合时，聚合物材料与黄体酮投料质量比为0-100，即所述聚合物材料与黄体酮投料质量比为9:1～1:1。在本发明的一些实施例中，黄体酮与plga的质量比可为1：2、2：3、1：1。此外，本发明对黄体酮的晶型没有特殊限制。

在本发明中，所述物料优选还包括辅料，如注射用亲水性载体泊洛沙姆188和增塑剂中的一种或多种。其中，泊洛沙姆(poloxamer)为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，商品名为普兰尼克(pluronic)，属于高分子非离子表面活性剂。泊洛沙姆188也称f68，是一种水包油乳化剂。泊洛沙姆为注射级别药用辅料，可根据释放需求改变泊洛沙姆的用量从而调节释放情况。增塑剂的主要功能为提高载体的易使用性、弹性及膨胀性；通过增大载体链之间的自由空间，降低了载体的熔点，使热熔融挤出工艺可以在低温和低扭力矩下进行；增加了活性成分和载体的稳定性。常用的增塑剂有柠檬酸脂、脂肪酸酯类、peg类等。作为优选，所述增塑剂选自柠檬酸三乙酯、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)和甘油单硬脂酸酯中的一种或多种。

在本发明的一些实施例中，采用热熔挤出机进行热熔挤出，所用的热熔挤出机优选为同向双螺杆挤出机；挤出机各区段温度范围包括：1区80-100℃；2区90-110℃；3区115-130℃；4区110-120℃。本发明实施例各区段温度的设定可根据药物性质而定；在进行热熔混合时，双螺杆转速可设定为0-500rpm，优选为100rpm～300rpm。

本发明主要应用热熔挤出-研磨法，将药物黄体酮与生物可降解聚合物plga、pla、pcl、pga等均匀混合，于同向双螺杆热熔挤出机中进行熔融混合、挤出、粉碎后，再经湿法研磨进一步降低粒径，最后经冷冻干燥或喷雾干燥，制成骨架型黄体酮缓释微球，微粒粒径控制在1-10μm范围内。

在本发明的实施例中，挤出物冷却后进行低温粉碎，粉碎物再进行湿法研磨。在本发明的具体实施例中，研磨处理的转速可为2000rpm；研磨时间可为30min。作为优选，所述湿法研磨初步用氧化锆珠研磨，以降低粒径；再用聚乙烯珠进行深度打磨，使颗粒表面光滑，通针性好。

如采用普通球磨机或冷冻粉碎机进行物料的粉碎，粉碎粒径较大，且粒子呈不规则形状。而本发明采用湿法研磨后续处理，分别经氧化锆珠和聚乙烯珠进行研磨处理，粒径可降至3-5μm，在小粒径下控制药物释放，注射刺激性小，通针性良好。

湿法研磨结束后，本发明实施例可将研磨液经冷冻干燥或喷雾干燥等常规的干燥方式，制成肌肉注射用的黄体酮缓释微球。具体的，冻干工艺可包括：-40℃预冻四小时，抽真空，-40℃维持两个小时，两个小时升至-20℃维持三个小时，一个小时升至-10℃维持两个小时，两个小时升至0℃维持两个小时，两个小时升至20℃维持两个小时。

本发明所述的骨架型黄体酮缓释微球的粒径为1～10μm，优选为3～5μm。本发明所述的注射用的黄体酮缓释微球粒度分布均匀，载药量高。在本发明的一些实施例中，所述黄体酮缓释微球的载药量为20％～45％，优选为29％～45％。在本发明的一些实施例中，所述的黄体酮缓释微球的比表面积为1100～1200m²/kg。

本发明实施例所采用的热熔挤出技术，是利用原料药同包裹辅料经由不同的热熔单元，进行熔融混合，得到均匀分布原料药的plga条状挤出物，再对挤出物进行研磨，得到颗粒状微球。并且，本发明可通过控制熔融温度和研磨条件等来调整药物分布状态和粒径大小。热熔挤出法相对于传统乳化法制备载体包封微粒而言，具有操作步骤简化、过程时间短、避免使用有机溶剂和水、药物在载体中均匀分散等明显优势，亦可实现持续化操作，利于工艺放大生产。

本发明还提供一种黄体酮缓释注射剂，其包括黄体酮微球和注射用溶剂；所述黄体酮微球为上文所述的骨架型黄体酮缓释微球。

本发明的黄体酮缓释制剂采用生物可降解高分子材料包裹药物制成注射用微球制剂给药后，药物通过在微球内的扩散和聚合物骨架的溶蚀控制释放，达到长效平稳缓释的目的。并且，体内可维持有效血药浓度，因而可以提高患者的依从性，提高疗效。此外，本发明制备过程不使用有机溶剂，避免有机溶剂残留问题，有机杂质含量低，注射安全性高。

本发明提供的黄体酮缓释注射剂采用肌肉注射，其包括上文所述的骨架型黄体酮缓释微球；另附注射用溶剂。

在本发明中，注射用溶剂可以使药物悬浮，从而使给药均匀、顺利。所述注射用溶剂即注射用微球复溶剂，可包括注射用水、ph值调节剂、渗透压调节剂和稳定剂，如包含羧甲基纤维素钠(cmc-na)、甘露醇中的一种或其混合物。在本发明的具体实施例中，所述注射用溶剂的成分包括无水柠檬酸、无水磷酸氢二钠、聚山梨酯20、cmc-na、氯化钠以及注射用水。

本发明实施例可将上述步骤得到的研磨混悬液分装冻干，另附注射用溶剂即得；装量为2-3ml/支，即所述黄体酮缓释注射剂的装量可为2ml/支，也可为3ml/支等。在本发明的一些实施例中，每支注射剂中黄体酮含量为140mg；本发明设计人用剂量为140mg/周，140mg/支(以黄体酮计)。

在本发明中，该制剂粒度分布均匀，载药量高，体内外持续释放一周以上，累计释放90％以上，且释放均一稳定，可较长时间维持有效血药浓度，给药一次可维持一周治疗之久，注射刺激性小，患者顺应性好。

根据研究人员进行的临床调查，目前临床上治疗习惯性流产和辅助生殖剂量为肌注20mg/day和60mg/day。而本发明制剂设计剂量为140mg/周，一周给药一次。在给药剂量和频率上均少于临床普通制剂，而本品在后续药动和药效学学研究结果显示，本品生物利用度和治疗效果与市售制剂相当；而给药剂量和频率的减少可降低副作用的发生率，提高患者依从性。

附图说明

图1为本发明实施例黄体酮缓释制剂与现有产品的血药浓度曲线图；

图2为实施例1制备出的黄体酮缓释微球的粒度测定结果；

图3为本发明实施例制备出的黄体酮缓释微球的dsc曲线；

图4为实施例2-4制备出的黄体酮缓释微球的体外释放曲线。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的骨架型黄体酮缓释微球及其制备方法和黄体酮缓释注射剂进行具体地描述。

以下实施例中，所用的黄体酮为晶型ⅱ、厂家：湖北葛店人福药业有限责任公司，批号：htt151102。

实施例1

将黄体酮与plga(50：50(乳酸和羟基乙酸的摩尔比例)，10000道尔顿，以下实施例表示同实施例1)，以1：2的质量比进行物理混合，加入辅料并混合均匀。将混合均匀的物料投入双螺杆挤出机中进行热熔挤出，双螺杆转速为160rpm，各区温度设为1区，80℃；2区，90℃；3区，115℃；4区，110℃。挤出物冷却后进行低温粉碎，将小型粉碎机中加入适量干冰保证低温环境，进行挤出物的粉碎；粉碎物于湿法循环式球磨机中进行研磨处理，初步用氧化锆珠研磨，再用聚乙烯珠进行深度打磨。将研磨液分装至西林瓶中进行冷冻干燥，得到骨架型黄体酮缓释微球。

其中，冷冻干燥工艺包括：-40℃预冻四小时，抽真空，-40℃维持两个小时，两个小时升至-20℃维持三个小时，一个小时升至-10℃维持两个小时，两个小时升至0℃维持两个小时，两个小时升至20℃维持两个小时。

实施例1中的处方及相关工艺参见表1：

表1实施例1中的处方及相关工艺参数

实施例2-4不同分子量plga制备黄体酮缓释微球

将黄体酮分别与分子量为13000、20000、30000道尔顿的plga(50：50)以1：2的质量比进行物理混合，加入辅料并混合均匀。将混合均匀的物料投入双螺杆挤出机中进行热熔挤出，双螺杆转速为160rpm，各区温度设为1区，80℃；2区，90℃；3区，115℃；4区，110℃。挤出物冷却后进行低温粉碎，粉碎物于湿法循环式球磨机中进行研磨处理，初步用氧化锆珠研磨，再用聚乙烯珠进行深度打磨。将研磨液分装至西林瓶中进行冷冻干燥，得到骨架型黄体酮缓释微球。实施例2-4中的处方及相关工艺参见表2：

表2实施例2-4中的处方及相关工艺参数

实施例5-7不同理论载药量黄体酮缓释微球

将黄体酮与plga(50：50；10000)分别以1：2、2：3、1：1的质量比进行物理混合，加入辅料并混合均匀。将混合均匀的物料投入双螺杆挤出机中进行热熔挤出，双螺杆转速为160rpm，各区温度设为1区，80℃；2区，90℃；3区，115℃；4区，110℃。挤出物冷却后进行低温粉碎，粉碎物于湿法循环式球磨机中进行研磨处理，初步用氧化锆珠研磨，再用聚乙烯珠进行深度打磨。将研磨液分装至西林瓶中进行冷冻干燥，得到骨架型黄体酮缓释微球。实施例5-7中的处方及相关工艺参见表3：

表3实施例5-7中的处方及相关工艺参数

实施例8-10不同亲水性载体用量

将黄体酮与plga(50：50；13000)以1：2的质量比进行物理混合，分别加入5％、10％、15％的泊洛沙姆(5％、10％、15％为泊洛沙姆占黄体酮与plga总重(30g)的质量百分比)，混合均匀。将混合均匀的物料投入双螺杆挤出机中进行热熔挤出，双螺杆转速为160rpm，各区温度设为1区，80℃；2区，90℃；3区，115℃；4区，110℃。挤出物冷却后进行低温粉碎，粉碎物于湿法循环式球磨机中进行研磨处理，初步用氧化锆珠研磨，再用聚乙烯珠进行深度打磨。将研磨液分装至西林瓶中进行冷冻干燥，得到骨架型黄体酮缓释微球。实施例8-10中的处方及相关工艺参见表4：

表4实施例8-10中的处方及相关工艺参数

洛沙姆为注射级别药用辅料，可根据释放需求改变泊洛沙姆的用量从而调节释放情况。本发明实施例中亲水性载体泊洛沙姆用量在0-20％，最优方案为10％，药物释放调节效果较好。

实施例11-13不同增塑剂对挤出的影响

将黄体酮与plga(50：50；13000)分别以1：2的质量比进行物理混合，加入各处方种类的增塑剂，加入其他辅料并混合均匀。将混合均匀的物料投入双螺杆挤出机中进行热熔挤出，双螺杆转速为160rpm，各区温度设为1区，80℃；2区，90℃；3区，115℃；4区，110℃。挤出物冷却后进行低温粉碎，粉碎物于湿法循环式球磨机中进行研磨处理，初步用氧化锆珠研磨，再用聚乙烯珠进行深度打磨。将研磨液分装至西林瓶中进行冷冻干燥，得到骨架型黄体酮缓释微球。实施例11-13中的处方及相关工艺参见表5：

表5实施例11-13中的处方及相关工艺参数

增塑剂的主要功能为提高载体的易使用性、弹性及膨胀性；通过增大载体链之间的自由空间，降低了载体的熔点，使热熔融挤出工艺可以在低温和低扭力矩下进行；增加了活性成分和载体的稳定性。本发明实施例中，增塑剂的使用可降低载体的相变温度，使其在低于药物的熔点挤出，可保证药物在固体分散体中以晶体形式存在，释放减慢。

实施例14

本发明的黄体酮缓释微球的药物动力学分析

根据实施例9方法所制备的2.52mg(以黄体酮计)的缓释制剂，对sd大鼠(体重大约200g)的后腿股二头肌进行肌肉注射，并以市售的黄体酮注射液(厂家：浙江仙琚制药股份有限公司，批号：h33020828)为对照试验。本发明缓释制剂中的注射用溶剂即常规的注射用微球复溶剂，成分(药用级)包括无水柠檬酸、无水磷酸氢二钠、聚山梨酯20、cmc-na、氯化钠以及注射用水(本注射用溶剂成分参考市售利培酮(恒德)说明书)。

对受试大鼠定期眼后静脉丛取血，通过建立lc-ms法测定血浆中黄体酮的药物浓度。给药0-180h的血药浓度参见图1，图1为本发明实施例黄体酮缓释制剂与现有产品的血药浓度曲线图。从图1可以看出，本发明长效注射剂大鼠体内突释量低于黄体酮注射剂，血药浓度较平稳，未有明显波动，可达到一周以上的缓释效果。

实施例15

黄体酮缓释制剂特性测试

1、粒径和粒径分布。将上述实施例1制备出的黄体酮缓释微球用蒸馏水及0.1％cmc-na(0.1g/100ml，药用级)配成混悬液，应用百特激光粒度仪进行粒度测定，实施例1制备出的黄体酮缓释微球的粒度测定结果见图2和表6，图2为实施例1制备出的黄体酮缓释微球的粒度测定结果。由以上结果可知，微球d50为3.00μm，span2.523，粒径分布较均一；表明该制剂粒度分布均匀，微粒粒径控制在1-10μm范围内，通针性好。

表6实施例1制备出的黄体酮缓释微球的粒度测定数据

2、载药量和包封率。精密量取上述实施例制备出的黄体酮缓释微球10mg置25ml容量瓶中，加入1ml乙腈振荡溶解，用乙腈定容至刻度，混匀，用0.45μm微孔滤膜过滤即可。用hplc法测定载药量和包封率，计算公式如下，结果参见表7。由以下结果可知，本发明制剂载药量高。

表7实施例5-7载药量、包封率测定结果

3、药物在载体中的分散状态

将黄体酮原料药、plga空白辅料、黄体酮-plga载药微球、物理混合物(40％)分别做dsc分析。取样品适量，置于差示扫描量热仪的铝盘中，以氧化铝为参比物，在氮气流中，从30℃起，以10℃/min的速率升温至350℃，得dsc曲线，如图3所示；亦可获得样品的熔融焓，通过和对照对比，应用相应分析软件可计算出微球中药物的结晶度。图3中，a)为prg曲线，b)为plga曲线，c)为prg-plga载药微球曲线，d)为物理混合物(40％)曲线。由图3可见，黄体酮在热熔挤出-研磨法制备微球仍以晶体形式存在，因此具有缓释效果。

实施例16释放行为

关于体外释放度方法的建立，本发明考虑体内外相关性，采用模拟半固体制剂的franz扩散池法测定体外释放，制剂和释放介质由半透膜分离开，药物释放经过跨膜过程，最大限度模拟体内肌肉注射的释放机制。释放介质为0.5％sds水溶液，透皮扩散池恒温水浴37℃，300rpm搅拌。

实施例2、3、4的对比测定结果参见图4和表8，图4为实施例2-4制备出的黄体酮缓释微球的体外释放曲线，体外释放结果如下表8。其中，所使用plga材料分子量不同，三个实施例释放周期均为一周，累计释放90％以上；差别在于突释量(24h)和一周完全释放量(7d)。

表8实施例2-4制备出的黄体酮缓释微球的体外释放结果

综上所述，本发明的黄体酮控释微球中，黄体酮可在一周内释放完，且释放过程平稳，无明显突释现象，保证了临床上一周给药一次的治疗方案。