专利名称：倍半萜酮类注射剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有倍半萜酮类的植物提取物的新注射剂型，更具体地说涉及这些制剂的脂质体剂型，纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型。本发明还涉及这些剂型的制备方法和用途。
背景技术：
近年来，在抗癌天然药物研究领域中的许多研究人员都致力于研究紫杉醇、榄香烯各种异构体、姜黄提取物、温郁金提取物等的抗癌活性和这些药物的各种制剂形式。
榄香烯是存在于某些植物中的一种倍半萜类化合物，拉丁名为Elemenum，英文名为Elemene，化学名是1-甲基-1-乙烯基-2，4-二异丙烯基环己烷，分子式C15H24。榄香烯有多种异构体，这些异构体中β-榄香烯，δ-榄香烯，γ-榄香烯已被证实有抗癌活性。榄香烯是可以从植物温郁金(Curcuma Wenyujin Y.H.Chen et C.ling)的根茎(俗称温莪术)的挥发油中提取的化合物，或是从植物香茅(Cymbopoqon citratus(DC.)Stapt)的油中提取的化合物，例如从香茅油中除掉柠檬醛、香茅醇之后余下的混合油状物，提取的化合物实际上是包含β-榄香烯的榄香烯异构体混合物。
上述植物温郁金与另外两种可作为天然药物使用的植物莪术和姜黄同属于姜科植物类群，产于中国的广东、四川、福建、广西、浙江等省。包含榄香烯的植物有温郁金、香茅、水菖蒲、土木香、人参等50多种，其中香茅是在中国分布广、资源充足的植物。目前，榄香烯类化合物主要从温郁金油和香茅油中提取。
有许多文献涉及直接采用天然药物制备防治癌症的草药制剂，例如中国专利公开CN1216256A公开了治疗肝癌的草药制剂，它包括含有白花蛇舌草、姜黄，虎杖和山豆根的提取物作为主要天然药物的可注射组合物(A)和含有白花蛇舌草、重楼、虎杖、山豆根、龙胆草、大黄、连翘、赤芍、姜黄和石菖蒲的提取物作为主要天然药物的口服组合物(B)。
在中国专利公开CN1302559中公开了姜黄素制剂，它是通过制备在水可混合的有机溶剂中或水和水可混合的有机溶剂的混合物中的姜黄素分子分散体，然后向该溶液添加保护胶体水溶液，姜黄素的疏水相形成毫微分散相。最终的制剂形式主要是水性分散体或干粉，在优选的情况下粒径小于10μm。
在CN1200266A中公开了通过二次分馏从香茅油中提取β-榄香烯的方法。
在中国专利公开CN1247756A中公开了用于治疗恶性肿瘤的姜郁注射液，其中姜黄与郁金的重量比为50-60∶50-40，该注射液是一种简单的混合物。
中国专利公开CN1076613A涉及榄香烯乳注射液及其制备方法，该注射液是一种乳状液，平均粒径一般不超过15微米，特别不超过2微米。
中国专利公开CN1244389A涉及榄香烯注射液及其制备方法，该注射液是一种简单混合物，不是脂质体。
中国专利公开CN1110134A涉及脂质体制备工艺及制剂，其中特别描述了榄香烯脂质体注射液制备方法和由该方法获得的榄香烯脂质体注射液，榄香烯的包封率达85％以上，但没有给出有关脂质体的平均粒径的数据。从制备方法可以判断该脂质体具有较大的平均粒径。
中国专利公开CN1221607A涉及利用CO2的临界或超临界方法来制备脂溶性药物脂质体的工艺和所制备的榄香烯脂质体注射液，虽然榄香烯的脂质体的包封率很高，但脂质体的平均粒径同样太大。
以上这些文献所公开的制剂在贮存稳定性和抗癌活性上都存在着不足。
另外，在一些专利文献中还公开了榄香烯的各种衍生物和榄香烯金属络合物。例如，在CN11531158A中公开了一种榄香烯金属络合物和它作为抗癌药物的使用。CN1153167A涉及榄香烯含氮衍生物及其作为抗癌药物的用途。CN1153168A涉及榄香烯羟基类衍生物及其作为抗癌药物的用途。
发明内容
本发明的目的是提供植物提取物注射剂，它用含倍半萜酮类的植物提取物、表面活性剂和含水介质作为原料制备，该含倍半萜酮类的植物提取物包括作为活性成分的至少5wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和至少5wt％的倍半萜烯类(2)，该倍半萜酮类活性成分(1)包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种，其特征在于该注射剂是一种水性分散体，分散相的平均粒径≤1微米，提取物与表面活性剂的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射剂中活性成分((1)+(2))的最终浓度为1～10mg/ml。更优选地，该含水介质是水。
本发明的另一目的是提供提取物的新注射剂型，更具体地说涉及该提取物的脂质体剂型，纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型或脂肪乳剂型。
本发明的另一个目的是提供这些注射剂型的制备方法。
本发明的再一个目的是提供这些新剂型的制剂用于制备治疗癌症或缺血性中风的药物注射剂的用途，这些注射剂型用于缓解肿瘤疼痛的用途，以及这些新剂型的制剂用于抑制和/或治疗肿瘤的用途。
本发明提供这些提取物的新注射剂型。以从川郁金、莪术、桂莪术、姜黄、温郁金等获取的精油(或称作挥发油)中提取的含有倍半萜酮类的提取物作为原料分别制备成其纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型。这些剂型的平均粒径一般小于或等于1微米，优选小于或等于200纳米，甚至小于或等于100纳米。
图1是实施例1的注射剂1的透射电镜照片。
本发明的详细说明现有技术领域中已经知道榄香烯某些异构体、姜黄提取物、温郁金提取物具备抑制肿瘤的作用，一些文献公开了这些天然药物的各种制剂形式(或剂型)，例如脂质体、乳剂、脂肪乳等制剂。但是，由于这些剂型的平均粒径普遍较大，注射到人或动物体内后会引起人或动物体内的各种反应，例如刺激性大，有时候发生溶血现象。
本发明人经过多年的研究工作，最初发现将倍半萜烯类化合物或从植物中提取的含倍半萜烯类的提取物制成平均粒径≤1微米或≤100纳米的各种注射剂型，其中包括脂质体剂型，纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米微球剂型，脂肪乳剂型等，可以克服现有技术的注射制剂中的诸多问题，尤其本发明的这些剂型在静脉注射应用中大大减少了刺激性，它们的稳定性得到进一步提高。本发明的新剂型显著提高了药物制剂的药效，但这些剂型的抑制癌细胞的机理目前还不是十分清楚。本发明人根据大量的试验结果作出以下推测由于本发明制剂具有小的平均粒径并且具有特殊的表面性质(例如亲水/亲脂平衡，表面电荷等)，使得这些制剂中的药物(或活性成分)对癌细胞有较强的亲和力，能够充分附着于癌细胞上，让活性成分直接作用于癌细胞，达到抑制或杀灭癌细胞的效果。另外，发现，纳米粒度的制剂起效快，防止癌细胞转移方面有一定效果。随后，本发明人发现倍半萜烯类的某些衍生物即某些特定的倍半萜酮类具有更高的抑制癌症的活性，这些倍半萜酮类包括吉马酮、姜黄酮、芳姜黄酮等，主要从川郁金、莪术、桂莪术、姜黄和温郁金植物的根茎中提取。尤其姜黄酮、芳姜黄酮的治疗癌症的效果比吉马酮更加突出。但是，经过动物实验，也发现某些倍半萜酮类却有很少或几乎没有抗肿瘤活性。
所以，含有特定倍半萜酮类即吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮和任何类型的倍半萜烯类的植物提取物可以用于制备抑制肿瘤的注射剂。
同时，尽管本发明制剂具有小的平均粒径，但是所获得的各种剂型的制剂同时具有高的稳定性，它们在长时间的贮存中不会发生凝聚问题，使得可以较长时间进行贮存而不降低稳定性。
本发明提供植物提取物注射剂，它用植物提取物、表面活性剂和含水介质作为原料制备，该植物提取物包括作为活性成分的至少5wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和至少5wt％的倍半萜烯类(2)，该倍半萜酮类活性成分(1)包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种，其特征在于该注射剂是一种水性分散体，分散相的平均粒径≤1微米，提取物与表面活性剂的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射剂中活性成分((1)+(2))的最终浓度为1～10mg/ml。
本发明提供植物提取物注射剂的制备方法，它包括用植物提取物作为原料，添加表面活性剂，利用旋转蒸发仪成膜或CO2临界或超临界方法来混合均匀，添加注射用水，进行高压均质化处理和/或超声波处理，一直处理到获得分散相平均粒径≤l微米的稳定水性分散体为止，从而制得注射剂，其中该植物提取物包括作为活性成分的至少5wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和至少5wt％的倍半萜烯类(2)，该倍半萜酮类活性成分(1)包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种，提取物与表面活性剂的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射剂中活性成分((1)+(2))的最终浓度为1～10mg/ml。
对于这些提取物，要求它包括作为活性成分的约至少5wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和大约≥0wt％的倍半萜烯类(2)，该倍半萜酮类活性成分(1)包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种。理想地，该植物提取物包括作为活性成分的至少7wt％、优选至少10wt％、更优选至少15wt％、特别优选至少20wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和至少1wt％，理想地至少5wt％，更理想至少7wt％、优选至少10wt％、更优选至少15wt％、特别优选至少20wt％的倍半萜烯类(2)。
需要指出的是，在本发明中作为本发明的起始原料来制备各种剂型的制剂的各种提取物可以使用商购的产品，如含吉马酮、姜黄酮和/或芳姜黄酮的姜黄属植物提取物商购产品，以及按照现有技术中描述的方法或在这里所述的方法从姜黄属植物的挥发油(或精油)中提取的含有此类倍半萜酮类的提取物产品。如果在本申请中需要自己制备这些提取物，用于制备这些提取物的各种挥发油(或精油)可以使用商购产品，也可以使用通过普通的水蒸汽蒸馏法或CO2超临界提取法从植物(例如植物的根茎)中获得的挥发油。每一种提取物能够用作本发明的起始原料，而且这些提取物中任何两种或多种接任何比例的掺合物也能够用作本发明的起始原料，显然，用主要含有吉马酮、姜黄酮和/或芳姜黄酮的提取物与其它含倍半萜烯类的提取物的掺混物作为原料的情况也包括在本发明内，这些其它含倍半萜烯类的提取物包括从树兰花、香椿子、海风藤、丁香、没药、黄花杜鹃、葛缕子、百里香、欧芹、广藿香、茅苍术、蛇床子、啤酒花、檀香木、香柠檬、防风根、柏木、松节油、香茅、人参、温郁金、姜黄等获取的精油(或称作挥发油)中提取的主要含有倍半萜烯类(倍半萜烯类含量一般≥40wt％，更合适≥60wt％)的提取物，而且，如果这些植物提取物含有≥5wt％的活性成分(1)，则这些植物提取物直接可以用于制备本发明的注射剂。还需要指出的是，在本申请中“倍半萜酮”、“倍半萜酮类”和“活性成分(1)”可以互用，它们特定地包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种。
倍半萜烯类包括榄香烯(elemene)，姜黄烯(curcumene)，姜烯(zingiberene)，波旁烯(bourbonene)，蛇麻烯(humulene)，金合欢花烯(farnesene)，杜松烯(cadinene)，芹子烯(selinene)，马阿里烯(maaliene)，檀香烯(santalene)，广藿香烯(patchonlene)，石竹烯(也称作丁香烯，caryophyllene)，吉马烯(大香叶烯，germacrene)，毕澄茄油烯(cubebene)，柏木烯(cedrene)，长叶烯(l0ngifolene)，防风根烯(或红没药烯，bisabolene)，香柠檬烯(bergamotene)，古芸烯(gurjunene)，愈疮木烯(guaiene)，衣兰烯(ylangene)，异石竹烯(isocaryophyllene)，长蒎烯(longipinene)，白菖烯(calarene)，木罗烯(muurolene)，菖蒲二烯(acoradiene)，倍半水芹烯(β-sesquiphellandrene)等。它们的酮衍生物常常也具有抑癌活性，但活性高的衍生物却并不多。在其中仅仅某些倍半萜酮类如吉马酮具有有价值的活性，令人惊奇的是，其中某些倍半萜酮类如姜黄酮、芳姜黄酮的活性比倍半萜烯类高得多。
原则上，从植物中提取的含有≥5wt％，优选≥8wt％，更优选≥10wt％，再更优选≥15wt％、甚至更优选≥20wt％活性成分的所有提取物都可作为原料用于制备本发明的新剂型。在一些情况下，提取物含有≥40wt％，更理想≥50wt％，优选≥60wt％，特别优选≥65wt％，非常特别优选≥70wt％的活性成分。该含量是用25米左右长度毛细管柱气相色谱-质谱联用仪(Bio-RadFTS-65A，HP5890II，色谱柱BP-5)检测提取物所获得的。该活性成分包括活性成分(1)和倍半萜烯类(2)，该活性成分(1)包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种倍半萜酮类。这些倍半萜酮类是所有剂型的活性成分之一。含有70wt％、优选75wt％、更优选80wt％以上活性成分((1)+(2))的提取物是理想的，含有85wt％以上活性成分的提取物是优选的，含有90wt％以上活性成分的提取物是更优选的，含有95wt％以上活性成分的提取物是特别优选的。
用于提取吉马酮、姜黄酮、芳姜黄酮的姜黄属植物包括川郁金、莪术、桂莪术、姜黄和温郁金等。有关这些植物和所含的成分倍半萜酮类的描述参见《药学学报(ACTA PHARMACEUTICASINICA)》，“我国姜黄属植物的研究”，Vol.XVII，No.6(第17卷第6期)，1982年6月。在该文章中详细介绍了姜黄属五种植物根茎挥发油的成分和含量，该文献以全部内容引入本文供参考。
术语的解释在本发明中所述的粒径或粒度是指分散相的粒径或粒度。
在本申请中，提取物指从植物中获取的挥发油(或精油)经真空填料式精馏装置精馏出的组分或经分子蒸馏仪精制出的组分。经GC-MS检测，提取物通常含有60wt％以上、优选65wt％以上、更优选70wt％以上、特别优选75wt％以上、甚至更优选80wt％以上的活性成分。该活性成分包括活性成分(1)和倍半萜烯类(2)，活性成分(1)包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种。其中倍半萜酮类还应该包括全部的倍半萜酮异构体，如果有的话。
如果在剂型前加“纳米”修饰，则指该剂型的平均粒径≤200纳米，在理想的情况下平均粒径≤150纳米，更理想≤100纳米。注射剂和注射制剂可互换使用。
脂质体剂型，在本发明中是指分散或悬浮在含水介质中的由磷脂和胆固醇等组成的脂双层结构，该脂双层结构类似于细胞膜结构。
纳米脂质体剂型，在本发明中是指平均粒径低于或等于150纳米的脂质体。
前体脂质体剂型，在本发明中是指在脂质体的配方基础上再添加赋形剂，通过真空冷冻干燥(真空冻干)方法所制备的冻干粉。该冻干粉在临床应用之前通过添加注射用水，经过振摇或振荡，使之恢复成脂质体形态。
长循环脂质体剂型，简单地说，在本发明中是指在脂质体的配方基础上再增加聚乙二醇磷脂酰乙醇胺所制备的脂质体。它注射到体内后比普通的脂质体在体内发挥效用的时间更长，或在体内消除缓慢。
纳米微乳剂型，指平均粒径≤150纳米，在理想情况下≤100纳米的乳剂。
静脉乳剂型，在本发明中指平均粒径≤1微米的注射乳。
脂质纳米微球剂型，在本发明中是指平均粒径≤150纳米的脂肪乳。
脂肪乳剂型，在本发明中要求它的平均粒径≤1微米；另外在中国国家药典中也规定平均粒径≤1微米。
nm是指纳米，μ是指微米。在本申请中纯度是指按重量计的百分纯度，除非另有说明。
本申请中所使用的原料提取物没有特别的限制，只要该提取物是从天然植物中提取并且总活性成分纯度≥5wt％就可在本发明中使用，更理想的是，该纯度≥8wt％，更理想≥10wt％，优选≥15wt％，特别优选≥20wt％，非常特别优选≥30wt％。当然，更高活性成分纯度的提取物是理想的，因为纯度高，在制备注射剂时提取物用量相应减少。所以，在有些时候能够采用活性成分纯度≥40wt％，更理想≥50wt％，优选≥60wt％，特别优选≥65wt％，非常特别优选≥70wt％的提取物。
除非另有说明，否则在本发明中使用的其它成分如胆固醇、大豆磷脂、卵磷脂、甘油、亚油酸、聚乙二醇磷脂酰乙醇胺、脂族胺、大豆油等一般要求符合国家药用标准，溶剂也应该符合国家药用标准，这些主要出于健康方面的考虑；类似地，对于一些原料用“精制”修饰，表明该原料必须符合国家药用标准，例如精制大豆磷脂是注射剂可用的产品，精制大豆油是注射剂可用的产品。
除非另有说明，否则在本申请中色谱分析所使用的气相色谱-质谱联用仪是Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色谱柱(大约25米长)是BP-5。
本发明的各种剂型能够以静脉注射、局部给药方式用于治疗目的。
本发明的优选实施方案在下列的实施方案中作为原料主要使用含有倍半萜酮类的“川郁金提取物”、“莪术提取物”、“桂莪术提取物”、“姜黄提取物”和“温郁金提取物”，以及它们当中任何两种或多种按任何比例的掺混物，一般要求提取物的倍半萜酮类活性成分含量≥5wt％。也可以将倍半萜酮类活性成分含量≥60wt％、甚至≥70wt％的提取物直接作为原料，或该提取物与主要含有倍半萜烯类的提取物的掺混物(也称作提取物)作为原料，但要求该掺混物的倍半萜酮类活性成分含量≥5wt％。而且利用化学方法合成的各种倍半萜酮类都能够用于本发明中。
本发明提供了脂质体或纳米脂质体的制备方法，它包括将提取物与大豆磷脂、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特别优选1∶3.2∶1.5进行混合；添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以使混合物充分溶解，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)(例如利用注射用水补充至5000ml)，然后将物料作为一批料或分批置入常规的超声波细胞粉碎机中进行超声波处理；取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪、电子显微镜来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径例如≤1微米(脂质体)，或≤100纳米(纳米脂质体)后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，利用色谱仪(气相或液相)测得活性成分的最终浓度(活性成分的重量(mg)/总制剂体积(ml))为1～10mg/ml，优选为1～7.5mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，再更优选5～7.5mg/ml。
纳米脂质体的包封率检测用分子筛法检测，即，利用Sephadex G25层析系统，将提取物纳米脂质体制剂分成两个流份，即提取物纳米脂质体流份和游离的提取物流份，经气相色谱仪检测两个流份中含有的提取物含量。包封率计算公式＝提取物纳米脂质体流份的提取物含量÷(提取物纳米脂质体流份的提取物含量+游离的提取物含量)。显微镜或透射电镜验证是否为脂质体。
本发明提供前体脂质体的制备方法将提取物与精制大豆磷脂、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特别优选1∶3.2∶1.5进行混合，添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)以补充至例如5000ml，然后将物料作为一批料或分批置入超声波细胞粉碎机进行超声处理，取样利用带标尺的显微镜或Coulter仪来检验平均粒径，当平均粒径≤1微米后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，加入占总制剂量的1-2wt％的赋形剂(例如乳糖或平均分子量Mw为约4000-40000的低分子右旋糖苷)，100℃蒸汽流灭菌，无菌条件下冷冻干燥、灌封。在使用之前添加注射水以达到最终活性成分浓度(活性成分的重量(mg)/制剂体积(ml))为1～10mg/ml，优选为1～7.5mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。
包封率的检测用分子筛法检测方法，即根据所要配制的最终制剂浓度(mg/ml)，将一定量的提取物前体脂质体制剂先添加余量体积的水振摇均匀，此时又变成了脂质体，利用Sephadex G25层析系统分成两个流份，即提取物脂质体流份和游离的提取物流份，经气相色谱仪检测两个流份中含有的提取物量。包封率计算公式＝提取物脂质体流份的提取物含量÷(提取物脂质体流份的提取物含量+游离的提取物量)。显微镜或透射电镜证实是否为前体脂质体。
本发明提供长循环提取物纳米脂质体的制备方法，该方法包括将提取物与精制大豆磷脂、聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺、胆固醇以重量比0.5-1.5∶1.5-3.5∶0.3-1.2∶0.8-2.0，优选以重量比0.8-1.2∶1.8-3.0∶0.4-1.0∶1.2-1.8，更优选以重量比0.9-1.1∶2.4-2.8∶0.6-1.0∶1.2-1.6，特别优选以重量比1∶2.6-2.7∶0.7-0.9∶1.3-1.5进行混合，添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)以补充至例如5000ml，然后将物料作为一批或分批置入常规的超声波细胞粉碎机进行超声波处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径(例如≤100纳米)后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，(气相或液相)色谱法测得活性成分的最终浓度(活性成分的重量(mg)/总制剂体积(ml))为1～10mg/ml，优选为1～7.5mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。对于聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺，其中“2000”指聚乙二醇链段的平均分子量(道尔顿)。
该注射剂的包封率的检测与前面的脂质体注射剂的包封率检测方法相同。
本发明提供带负电荷及带正电荷的提取物纳米微乳的制备方法制备方法1带负电荷的纳米微乳的制备将提取物与精制大豆磷脂、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特别优选1∶3.2∶1.5进行混合，添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)以补充例如5000ml，然后置入常规的超声波细胞粉碎机进行超声波处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径(例如≤100纳米)后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，活性成分的最终浓度(活性成分的重量(mg)/总制剂体积(ml))为1～10mg/ml，优选为1～7.5mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，再更优选为5～7.5mg/ml。显微镜、透射电镜检测，证实是否是纳米微乳。
制备方法2带正电荷的纳米微乳的制备将提取物、精制卵磷脂、C14-C22直链或支链脂族胺、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-3.5∶0.2-0.6∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.5-3.0∶0.3-0.5∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶2.7-2.9∶0.3-0.5∶1.4-1.6，特别优选1∶2.8∶0.4∶1.5进行混合，添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，然后添加余量的注射用水(根据所要配制的浓度计算出该余量)以补充至例如5000ml，然后置入常规的超声波细胞粉碎机进行超声处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径(例如≤100纳米)后，调节PH，使PH值为7.5～9.0，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，活性成分的最终浓度为1～10mg/ml，优选为1～7.5mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，再更优选为5～7.5mg/ml。显微镜、透射电镜检测，证实是否为纳米微乳。
本发明还提供提取物脂质纳米球的制备方法，该方法包括取提取物与大豆磷脂一起加入大豆油中，升温控制成油相(保持为油相)，将该油相加入到含10-50wt％甘油的水溶液中。其具体重量比例为提取物占最终配制剂总量的0.08～0.8wt％，大豆磷脂0.8～2.5wt％，大豆油8-12wt％，甘油1.8-2.8wt％，注射用水加至5000ml；优选的重量比例为提取物占最终配制剂总量的0.1wt％～0.5wt％，大豆磷脂1.2wt％～2.0wt％，大豆油10wt％，甘油2.25～2.5wt％，注射用水加至5000ml。然后高速搅拌，调节PH为4.5～6.5，再经过普通的高压均质机(例如M110-E/H型(日本MIZUHO产))处理，然后进行前面所述的超声波处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，在其脂质球的平均粒径达到规定值例如≤100nm之后，再经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃～120℃灭菌。(气相或液相)色谱法测得活性成分的最终浓度为1～10mg/ml，优选为1～7.5mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，更通常为2～5mg/ml，更理想为2.0～3.0mg/ml。根据需要可以在该最终制剂中加入适量胆固醇、亚油酸等。
本发明提供提取物静脉注射乳的制备方法，该方法包括将提取物、精制大豆磷脂、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特别优选1∶3.2∶1.5，与余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)进行混合，用常规的高压均质机(例如M110-E/H型(日本MIZUHO产))乳化，取样利用带标尺的显微镜或Coulter仪来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径例如≤1微米后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经1.2μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，经100℃～120℃灭菌，得到提取物静脉乳，(气相或液相)色谱法测得活性成分的最终浓度为1～10mg/ml，优选为1～7.5mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。
本发明提供提取物脂肪乳的制备方法，该方法包括取提取物与大豆磷脂加入大豆油中，升温控制成油相(保持为油相)，将该油相加入到含10-50wt％甘油的水溶液中。其具体重量比为提取物占最终配制剂总量的0.08～0.8wt％，大豆磷脂0.8～2.5wt％，大豆油8-12wt％，甘油1.8-2.8wt％，注射用水加至5000ml；优选的重量比例为提取物占最终配制剂总量的0.1wt％～0.5wt％，大豆磷脂1.2wt％～2.0wt％，大豆油10wt％，甘油2.25～2.5wt％，注射用水加至5000ml。然后高速搅拌，调节PH为4.5～6.5，再经过普通的高压均质机(例如M110-E/H型(日本MIZUHO产))处理，使其粒径小于1μ，再经1.2μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃～120℃灭菌。活性成分的最终浓度为1～10mg/ml，优选为1～7.5mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，更理想为2.0～3.0mg/ml或为5～7.5mg/ml。根据需要可以在该最终制剂中加入适量胆固醇、亚油酸等。
根据需要，本发明的制剂可以用不同尺寸例如1.2μ、1.0μ、0.9μ、0.8μ、0.7μ、0.6μ、0.5μ等的微孔滤膜进行过滤，可以截取平均粒径≤0.8μ、≤0.7μ、≤0.6μ、≤0.5μ、≤0.45μ、≤0.4μ、≤0.3μ等的分散相。
下面的制备例和实施例用于举例说明本发明，但不应认为限制本发明的范围。本发明的保护范围由权利要求来定义。
按普通的水蒸汽蒸馏或CO2超临界方法从川郁金、莪术、桂莪术、姜黄和温郁金的根茎获取挥发油。下面的制备例采用这些挥发油。
制备例1川郁金挥发油的分子蒸馏制备含倍半萜酮的提取物以1000ml川郁金挥发油(含有约15wt％的吉马酮)为原料，经广州汉维机电公司MD-S80型分子蒸馏仪精制，其工艺条件蒸馏温度38～46℃，蒸馏压力75～92Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，物料流速15～30毫升/小时，得到馏出物，仅收集馏余物，积累到足够量(约500ml)，继续进行分子蒸馏。蒸馏温度48～62℃，蒸馏压力35～75Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，该馏分流速15～30毫升/小时，分别收集馏出物(约150ml)与馏余物(约340ml)，将得到的二次馏余物继续进行分子蒸馏。蒸馏温度48～70℃，蒸馏压力10～50Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，该馏分流速15～30毫升/小时，收集馏出物(约100ml)，放掉馏余物，将最后两次的溜出物合并(约250ml)再添加到分子蒸馏仪中继续重复蒸馏一直到利用大约25米长毛细管柱气相色谱-质谱联用仪(Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色谱柱BP-5，大约25米长)检测提取物的吉马酮含量≥70wt％为止，最终获得提取物约150ml。用气相色谱法制定供检测用指纹图谱。用上述气相色谱-质谱联用仪测得该产物是含有约73wt％吉马酮和20wt％倍半萜烯类的川郁金提取物(提取物A)。
制备例2从莪术挥发油制备提取物按照与制备例1相同的方法，用1000ml莪术挥发油(含有约3wt％姜黄酮，约2.88wt％芳姜黄酮和约6.16wt％吉马酮)代替1000ml川郁金挥发油，获得110ml的吉马酮+姜黄酮+芳姜黄酮总含量≥70wt％的提取物。该产物是含有约75wt％上述三种倍半萜酮类和约19wt％倍半萜烯类的莪术提取物(简称提取物B)。
制备例3从桂莪术挥发油制备提取物按照与制备例1相同的方法，用1000ml桂莪术挥发油(含有约2.85wt％姜黄酮，约3.13wt％芳姜黄酮和约7.00wt％吉马酮)代替1000ml川郁金挥发油，获得110ml的吉马酮+姜黄酮+芳姜黄酮总含量≥70wt％的提取物。该产物是含有约75wt％上述三种倍半萜酮类和约19wt％倍半萜烯类的桂莪术提取物(简称提取物C)。
制备例4从姜黄挥发油制备提取物按照与制备例1相同的方法，用1000ml姜黄挥发油(含有约24.00wt％姜黄酮，约18.00wt％芳姜黄酮和约11.6wt％吉马酮)代替1000ml川郁金挥发油，获得310ml的吉马酮+姜黄酮+芳姜黄酮总含量≥70wt％的提取物。该产物是含有约75wt％上述三种倍半萜酮类和约18wt％倍半萜烯类的姜黄提取物(简称提取物D)。
制备例5从温郁金挥发油制备提取物按照与制备例1相同的方法，用1000ml温郁金挥发油(含有约6.4wt％姜黄酮，和约24.3wt％吉马酮)代替1000ml川郁金挥发油，获得200ml的吉马酮+姜黄酮总含量≥70wt％的提取物。该产物是含有约74wt％上述两种倍半萜酮类和约19wt％倍半萜烯类的温郁金提取物(简称提取物E)。
制备例6姜黄提取物的制备方法I姜黄挥发油的分子蒸馏以1000ml姜黄挥发油(倍半萜烯类含量≥16wt％)为原料，经广州汉维机电公司MD-S80型分子蒸馏仪精制，其工艺条件蒸馏温度35～45℃，蒸馏压力70～90Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，物料流速15～30毫升/小时，得到馏出物，仅收集馏余物，积累到足够量(约450ml)，继续进行分子蒸馏。蒸馏温度45～60℃，蒸馏压力30～70Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，该馏分流速15～30毫升/小时，分别收集150ml馏出物与约300ml馏余物，将得到的二次馏余物积累到足够量(750ml)，继续进行分子蒸馏。蒸馏温度30～70℃，蒸馏压力10～50Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，该馏分流速15～30毫升/小时，收集馏出物(320ml)，放掉馏余物，将溜出物再添加到分子蒸馏仪中继续重复蒸馏一直到用气相色谱仪(即大约25米长毛细管气相色谱-质谱联用仪Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色谱柱BP-5)检测时总倍半萜烯含量≥75wt％为止，获得150ml提取物。该提取物经上述气相色谱仪检测，含有75.5wt％的倍半萜烯类、7wt％的倍半萜酮类(吉马酮+姜黄酮+芳姜黄酮之和)和约3.2wt％的姜黄素。用气相色谱法制定供检测用指纹图谱。该产物称作姜黄提取物A。
方法II姜黄挥发油的填料式真空精馏将3000ml的姜黄挥发油(倍半萜烯类含量≥16wt％)经填料式真空精馏装置精馏，填料式真空精馏装置由装姜黄挥发油的容积为5000ml的釜、填料精馏塔(理论塔板数≥30)、回流器、真空泵构成，由上海化工研究院新型填料技术开发中心设计，填料为狄克松填料(Q网环填料)，真空度为1-3mmHg，收集82℃/3mmHg以上的馏分，利用大约25米长毛细管气相色谱-质谱联用仪(仪器Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色谱柱BP-5)检测提取物的总倍半萜烯含量≥75wt％。具体地说，经上述气相色谱仪检测，该提取物含有75.4wt％的倍半萜烯类、7.1wt％的倍半萜酮类(吉马酮+姜黄酮+芳姜黄酮之和)和约3.25wt％姜黄素。总共获得约450ml的提取物。用气相色谱法制定供检测用指纹图谱。该产物称作姜黄提取物B。
制备例7提取物掺混物首先从海风藤挥发油获得海风藤提取物，即按照与制备例6方法I相同的方法，用1000ml海风藤挥发油(倍半萜烯含量约＞15wt％)代替1000ml姜黄挥发油，获得125ml的总倍半萜烯含量约为85wt％的提取物，该产物称作海风藤提取物。
然后用制备例4的提取物(它是含有约75wt％上述三种倍半萜酮类和约19wt％倍半萜烯类的提取物D)和海风藤提取物按照1∶9(w/w)比掺混，此掺混物简称提取物F，含有＞7.5wt％上述三种倍半萜酮类。
下面的实施例采用上述提取物制备各种注射剂型。
实施例1提取物A的纳米脂质体注射剂的制备将制备例1的提取物A(6.5g，吉马酮含量约73±2wt％)与精制大豆磷脂、胆固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合作为起始原料，添加乙醚，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除乙醚成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度即5mg/ml来计算该余量)补充至1升(L)，然后均分成3批置入山东济宁超声电子仪器厂出产的超声波细胞粉碎机(型号JCS-204)超声处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，当平均粒径≤100纳米后，用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜(上海新亚净化器件厂生产，规格0.8μ)过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，所获得的注射剂产品简称注射剂1。取样用这里所述的约25米长毛细管气相色谱-质谱联用仪测得吉马酮(吉马酮的重量(mg)/制剂体积(ml))的最终浓度为5±0.10mg/ml。
用分子筛法检测包封率，即，利用Sephadex G25层析系统将提取物纳米脂质体制剂分成两个流份，即提取物纳米脂质体流份和游离的提取物流份，经气相色谱仪检测两个流份中含有的提取物含量。包封率超过85％。包封率计算公式＝提取物纳米脂质体流份的提取物含量÷[提取物纳米脂质体流份的提取物含量+游离的提取物量]。显微镜、透射电镜检测，证实是纳米脂质体。
在附图1中给出该注射剂的透射电镜照片(标尺50nm)。
实施例2提取物A的前体脂质体的制备按照与实施例1中相同的方法和原料配比，重复进行实施例1的程序，只是超声波处理后要求分散相的粒径≤1微米以及在过滤之后和在装瓶之前，加入占所获得的制剂总重量的1-2％的乳糖，然后利用100℃蒸汽流灭菌，无菌条件下冷冻干燥、灌封(分装)。用Coulter仪检测证实制剂是前体脂质体。该注射剂产品简称注射剂2。包封率高于85％。该制剂在注射应用之前添加注射水以达到最终活性成分(吉马酮)浓度为5±0.10mg/ml，。
实施例3提取物B的前体脂质体的制备重复上述实施例2，只是用制备例2的提取物B(倍半萜酮类活性成分含量约75±2wt％)代替制备例1的提取物A，用平均分子量Mw为约40000的低分子右旋糖苷代替乳糖。该注射剂简称注射剂3。用Coulter仪检测证实制剂是前体脂质体。包封率高于85％。该制剂在注射应用之前添加注射水以达到最终活性成分浓度(三种倍半萜酮类总共的重量(mg)/制剂体积(ml))为5±0.10mg/ml。
实施例4提取物C的长循环纳米脂质体的制备重复实施例1的操作程序，只是起始原料由以下组分组成提取物C(6.5g，倍半萜酮类活性成分含量约75±2wt％)∶大豆磷脂∶聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺∶胆固醇＝1∶2.6∶0.8∶1.4(重量比)。该注射剂简称注射剂4。取样检验平均粒径≤100nm。制剂中三种倍半萜酮类总共的最终浓度为5±0.10mg/ml。包封率高于85％。
实施例5带负电荷及带正电荷的提取物D的纳米微乳的制备5a带负电荷的提取物D纳米微乳的制备重复实施例1的程序，只是用制备例4的提取物D(6.5g，倍半萜酮类活性成分含量约75±2wt％)代替提取物A，而且不测定包封率。取样测得三种倍半萜酮类总共的最终浓度为5±0.10mg/ml，分散相平均粒径≤100nm。用Coulter仪证实是纳米微乳。该注射剂产品简称5a。
5b带正电荷的提取物D纳米微乳的制备重复实施例1的程序，只是起始原料由以下组成组成提取物D(6.5g，倍半萜酮类活性成分含量约75±2wt％)∶卵磷脂∶正十八烷基胺∶胆固醇＝1∶2.8∶0.4∶1.5(重量比)，不测定包封率。取样测得三种倍半萜酮类总共的最终浓度为5±0.10mg/ml，分散相平均粒径≤100nm。用Coulter仪证实是纳米微乳。该注射剂简称5b。
实施例6提取物E的脂质纳米球制剂的制备取制备例5的提取物E(2.7g，倍半萜酮类活性成分含量约74±2wt％)与大豆磷脂一起加入大豆油中，升温控制成油相(即保持为油相)，将该油相加入到含甘油的水溶液(含有20wt％甘油)中。其具体重量比为提取物占最终制剂总重量的0.27％，大豆磷脂1.6％，大豆油10％，甘油2.5％，余量为注射用水(补充至1L)，然后高速搅拌，用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH为4.5～6.5，再经M110-E/H型(日本MIZUHO产)高压均质机处理，然后按照实施例1中相同方法进行超声波处理，使其脂质球的平均粒径≤100nm，再经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃～120℃灭菌。取样测得两种倍半萜酮类总共的最终浓度为2±0.04mg/ml。所获得的注射剂简称注射剂6。根据需要可以在原料中包括适量的胆固醇、亚油酸等。
实施例7提取物D的静脉注射乳的制备将制备例4的提取物D(6.5g，倍半萜酮类活性成分含量约7 5±2wt％)、精制大豆磷脂、胆固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合，用注射用水加至1L，用M110-E/H型(日本MIZUHO产)高压均质机乳化，一直用Coulter仪检验粒径小于1μ为止。然后，用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH，使PH值为4.5～6.5，经1.2μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，经100℃～120℃灭菌，得到提取物D静脉乳，取样测得上述三种倍半萜酮类总共的最终浓度为5±0.10mg/ml。该注射剂简称7。
实施例8提取物D脂肪乳的制备取制备例4的提取物D(2.7g，上述三种倍半萜酮类含量约75±2wt％)与大豆磷脂加入大豆油中，升温控制成油相，将该油相加入到含甘油的水溶液(含20wt％甘油)中。其具体重量比为提取物D占总制剂重量的0.27％，大豆磷脂1.2％，大豆油10％，甘油2.5％，用注射用水加至1L。然后高速搅拌，用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH为4.5～6.5，再经M110-E/H型(日本MIZUHO产)高压均质机处理，一直到用Coulter仪检验粒径≤1μ为止，再经1.2μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃～120℃灭菌。测得上述三种倍半萜酮类总共的最终浓度为2±0.04mg/ml。所获得的注射剂简称8。根据需要可以在原料中包括适量胆固醇、亚油酸等。
实施例9提取物D的纳米脂质体注射剂的制备重复实施例1的操作程序，只是用制备例4的提取物D(6.5g，上述三种倍半萜酮类含量约75±2wt％)代替制备例1的提取物A，所获得的注射剂产品的分散相平均粒径≤100nm，简称注射剂9。取样用这里所述的约25米长毛细管气相色谱-质谱联用仪测得倍半萜酮类活性成分(上述三种倍半萜酮类的重量(mg)/制剂体积(ml))的最终浓度为5±0.10mg/ml。
实施例10姜黄提取物A的纳米脂质体注射剂的制备重复实施例1的操作程序，只是用制备例6的姜黄提取物A(6.5g)代替制备例1的提取物A，所获得的注射剂产品的分散相平均粒径≤100nm，简称注射剂10。测得活性成分(上述三种倍半萜酮类+倍半萜烯类的重量(mg)/制剂体积(ml))的最终浓度为5.6±0.10mg/ml。
实施例11提取物F的纳米脂质体注射剂的制备重复实施例1的操作程序，只是用制备例7的提取物F(6.5g)代替制备例1的提取物A，所获得的注射剂产品的分散相平均粒径≤100nm，简称注射剂11。测得活性成分(上述三种倍半萜酮类+倍半萜烯类的重量(mg)/制剂体积(ml))的最终浓度为5.6±0.10mg/ml。
实施例12CO2超临界法制备提取物D纳米脂质体将占胆固醇重量的10wt％的三氯甲烷加入胆固醇(0.8125g)中使之浸润，将大豆磷脂和制备例4的提取物D(0.65g，上述三种倍半萜酮类含量约75±2wt％)加入其中进行混合(提取物D大豆磷脂∶胆固醇＝重量比1.2∶3.2∶1.5)，将所获得的混合物放入CO2超临界提取仪(广州汉维机电公司生产，型号SFE100ml)的萃取器中，通入CO2(压力50-80kg)，体系温度50℃，进行临界或超临界分散，使混合物均匀混合，然后缓慢减压释放CO2，让CO2将三氯甲烷带出，取出萃取器，在萃取器中加入余量的注射用水达到100mL，用搅拌器搅拌，将所形成的分散体用上述超声波设备进行处理，一直到脂质体的分散相平均粒径≤100纳米为止(得到纳米脂质体)。然后将脂质体用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜(上海新亚净化器件厂生产，规格0.8μ)过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，所获得的注射剂简称注射剂12，分散相平均粒径≤100nm。取样用气相色谱法测得上述三种倍半萜酮类总共的最终浓度为5±0.10mg/ml。包封率高于88％。
药效学试验药物制剂的体内抗肿瘤效果的评价方法已在以上列举的某些专利文献中有描述(例如参见CN1153168A)。
在本发明中，注射剂对B16小鼠黑色素瘤实验肺转移以及对颅内接种的小鼠脑神经胶质瘤G-422的抗肿瘤疗效采用上海医药工业研究院药理室(本申请的大部分的实验结果委托他们完成)的抗肿瘤实验方法来评价，该方法是目前在中国国内抗肿瘤药物领域中公认的方法(国家药品监督管理局规定的方法)，方法具体如下进行无菌条件下取体外培养对数生长期的B16小鼠黑色素瘤培养细胞，制备成2.5×105/ml细胞悬液，从C57BL/6小鼠尾静脉接种0.2ml/每鼠(5×104个细胞)，24小时后按实验方案给药；试验三周后处死各组动物，剖取各组动物肺脏，计测每鼠肺脏所转移的集落数，以各组肿瘤平均集落数，按下列公式计算肿瘤抑制率肿瘤抑制率％＝[(对照组平均集落数-给药组平均集落数)/对照组平均集落数]×100另取生长旺盛的G422小鼠脑神经胶质瘤，无菌条件下均浆法制备成3～4×107/ml细胞悬液，于昆明小鼠颅内接种0.05ml/鼠，分组，接种24小时后开始静脉给药治疗。观察荷瘤小鼠30天内的生存期，求得各组的平均生存天数，与对照组比较计算抗肿瘤的生命延长率生命延长率＝[(对照组平均生存天数-给药组平均生存天数)/对照组平均生存天数]×100瘤源G-422小鼠脑神经胶质瘤、小鼠B16黑色素瘤细胞均由上海医药工业研究院药理室传代维持。
实验动物C57BL/6及昆明种小鼠由上海中科院实验动物中心提供，合格证号沪动合格证第107号。体重18-20克。雌雄均可，每批实验使用同一性别。每组10只。
给药方案静脉给药，每天1次，连续10天。对照组给予空白乳剂，它是对应于各注射剂的不含活性成分的注射剂。
表1.小鼠黑色素瘤B16实验肺转移疗效
表2.注射剂对小鼠胶质瘤G-422(颅内接种)的疗效
另外，各种剂型的注射剂对荷Lewis肺癌的小鼠NK细胞与对照组比活性提高21％～23％。各种剂型的注射剂对荷Lewis肺癌的小鼠淋巴细胞增殖活性影响、刺激指标提高了1.5～1.45。
总之，从上述表中数据可以看出，各种制剂经小鼠黑色素瘤B16实验模型和小鼠脑瘤G422模型药理学试验有效。对免疫功能影响试验，荷Lewis肺癌的小鼠NK细胞与对照组比提高21％～23％。淋巴细胞增值活性影响、刺激指标提高了1.5～1.45.
所以，注射剂能够用于抑制和/或治疗肿瘤。另外，经过试验，该制剂还能够用于抑制癌细胞转移，用于缓解肿瘤疼痛，用于预防或治疗缺血性中风。
权利要求
1.植物提取物注射剂，它用含倍半萜酮类的植物提取物、表面活性剂和含水介质作为原料制备，该含倍半萜酮类的植物提取物包括作为活性成分的至少约5wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和约≥0wt％的倍半萜烯类(2)，该倍半萜酮类活性成分(1)包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种，其特征在于该注射剂是一种水性分散体，分散相的平均粒径≤1微米，提取物与表面活性剂的重量比大约是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射剂中活性成分((1)+(2))的最终浓度为1～10mg/ml。
2.根据权利要求1的提取物注射剂，其中活性成分包括至少约7wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和约≥1wt％的倍半萜烯类(2)，注射剂的剂型包括脂质体剂型，纳米脂质体剂型，长循环脂质体剂型或长循环纳米脂质体剂型，其中这些注射剂的活性成分的浓度是2～7.5mg/ml，这些制剂的包封率≥80％。
3.根据权利要求1的提取物注射剂，注射剂的剂型包括纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型或脂肪乳剂型；其中注射剂的活性成分的浓度是1-7.5mg/ml。
4.根据权利要求2的提取物注射剂，进一步包括前体脂质体剂型，它是通过先制备脂质体，添加赋形剂，然后冻干而制得，包封率≥80％，该前体脂质体制剂在注射之前添加注射水以达到最终活性成分浓度(活性成分的重量(mg)/制剂体积(ml))为2～8mg/ml。
5.根据权利要求2和3的注射剂，其中纳米脂质体剂型、长循环纳米脂质体剂型、纳米微乳剂型或脂质纳米球剂型的注射剂的分散相平均粒径≤100纳米，当剂型为前体脂质体、脂质体或长循环纳米脂质体时包封率≥85％；和其中表面活性剂是磷脂和/或胆固醇。
6.根据权利要求3和5的注射剂，脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型的注射剂的活性成分的浓度为1.0-3.0mg/ml。
7.根据权利要求1的注射剂，其中活性成分包括至少约7wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和约≥1wt％的倍半萜烯类(2)。
8.根据权利要求1-6中任何一项的注射剂，它是静脉注射剂。
9.根据权利要求1和4的注射剂，其中提取物含有≥20wt的活性成分，和其中含倍半萜酮类的植物的提取物包括川郁金、莪术、桂莪术、姜黄和温郁金植物各自的提取物，或这些提取物中两种或多种按任何比例的掺合物。
10.根据权利要求1和3的注射制剂，其中注射剂进一步含有选自植物油和动物油的油或作为等渗透剂的甘油。
11.根据权利要求1和3的注射制剂，其中当表面活性剂是卵磷脂时，注射剂进一步含有C14-C22直链或支链脂族胺。。
12.植物提取物注射剂的制备方法，它包括用含倍半萜酮类的植物提取物作为原料，添加表面活性剂，利用旋转蒸发仪成膜或CO2临界或超临界方法来混合均匀，添加注射用水，进行高压均质化处理和/或超声波处理，一直处理到获得分散相平均粒径≤1微米的稳定水性分散体为止，从而制得注射剂，其中该含倍半萜酮类的植物提取物包括作为活性成分的约至少5wt％的倍半萜酮类活性成分(1)和大约≥0wt％的倍半萜烯类(2)，该倍半萜酮类活性成分(1)包括吉马酮、姜黄酮和芳姜黄酮中的一种、两种或三种，提取物与表面活性剂的重量比大约是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射剂中活性成分((1)+(2))的最终浓度为1～10mg/ml。
13.根据权利要求12的制备方法，其中注射剂的剂型包括脂质体剂型，纳米脂质体剂型，长循环脂质体剂型或长循环纳米脂质体剂型，其中这些注射剂的活性成分的浓度是1.0-7.5mg/ml，这些制剂的包封率≥80％。
14.根据权利要求12的制备方法，其中注射剂的剂型包括纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型或脂肪乳剂型；其中这些注射剂的活性成分的浓度是2.0-7.5mg/ml。
15.根据权利要求12的制备方法，进一步包括在制备脂质体之后，添加赋形剂，然后冻干，从而制备前体脂质体剂型的制剂。
16.根据权利要求12的制备方法，其中提取物含有≥20wt的活性成分，和其中含倍半萜酮类的植物的提取物包括川郁金、莪术、桂莪术、姜黄和温郁金植物各自的提取物，或这些提取物中两种或多种按任何比例的掺合物。
17.根据权利要求12和14的制备方法，其中与表面活性剂一起还添加选自植物油和动物油的油或作为等渗透剂的甘油。
18.权利要求1-11中任何一项的提取物注射剂用于抑制和/或治疗肿瘤，用于抑制癌细胞转移，用于缓解肿瘤疼痛，用于预防或治疗缺血性中风的用途。
19.权利要求1-11中任何一项的提取物注射剂用于制备抑制或治疗癌症的药物的用途。
20.由权利要求12-17中任何一项的方法制备的注射剂。
全文摘要
本发明涉及含有吉马酮、姜黄酮和/或芳姜黄酮的植物提取物的新剂型，更具体地说涉及它们的纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型。
文档编号A61K9/127GK1471908SQ02125900
公开日2004年2月4日 申请日期2002年8月1日 优先权日2002年8月1日
发明者李德山, 陈泽平 申请人:大连医大安鹏生物医药技术有限公司