一种三七总皂苷柱层析过程的近红外光谱在线检测系统和方法与流程

本发明属于中药生产技术领域，具体涉及一种三七总皂苷柱层析过程的近红外光谱在线检测系统和方法。

背景技术：

三七为五加科植物植物panaxnotoginseng(burk)f.h.chen的干燥根和根茎，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，是一种重要的常见中药，在中国已有上百年的使用历史。其中，三七的皂苷类成分被认为是其中药药效物质，以三七总皂苷为原料的中药注射制剂，如血塞通和血栓通等，年销售额已近百亿，是中药注射剂界的“重磅炸弹”。

三七总皂苷为三七的主要有效成分，具有活血、心肌保护、抗脑出血/缺血损伤、抗炎、镇痛、抗衰老、抗氧化等药理作用。三七总皂苷中含量最多的皂苷为三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1和人参皂苷rd。

三七总皂苷的主要生产工艺包括提取、浓缩、水沉过滤、柱层析、炭吸附等。其中，柱层析纯化工艺包括大孔树脂柱层析纯化和大孔树脂柱层析脱色。大孔树脂柱层析纯化的工艺参数较多，影响因素复杂且控制难度大，柱层析产品的批次间质量一致性成为柱层析工艺环节的主要问题。典型的原因包括上样液质量波动、层析填料质量波动及性能下降、生产环境因素(如温度)不稳定等。固定的柱层析控制策略无法有效应对上述问题：一方面，无法实时判断上样是否穿透及穿透的百分比；另一方面，无法准确判断洗脱进程，无法灵活确定洗脱收集点和洗脱终点，如何确定柱层析流出液的收集策略成为了挑战。

因此，有必要借助合适的pat(过程分析技术)工具，实现三七总皂苷柱层析流出液有效成分的在线监测，快速、及时地获取过程信息，有助于柱层析过程实时控制，保证产品质量一致性。

作为一种软测量技术，近红外光谱(nearinfraredspectroscopy，nirs)能反映样本中有机分子含氢基团(如c-h、n-h、o-h等)的特征信息。近红外光谱技术可用于中药质量分析，样本无需或仅需简单处理，不消耗化学试剂，操作简单、快速，在中药质量控制领域具有巨大的应用潜力。将近红外光谱技术结合化学计量学技术，用于三七药材中主要药效物质的快速检测，对三七药材及三七总皂苷类制剂的质量控制具有重要意义。

目前，尚未有对柱层析过程样本，即柱层析流出液有效成分的在线检测系统及方法。柱层析流出液有效成分的在线检测系统亟需设计，检测方法亟需开发。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种三七总皂苷柱层析过程的近红外光谱在线检测系统，以及利用该系统实时检测三七总皂苷柱层析过程层析流出液皂苷浓度的方法，用以判断上样是否穿透以及确定洗脱收集点和洗脱终点。

本发明通过以下技术方案实现：

一种三七总皂苷柱层析过程的近红外光谱在线检测系统，包括：层析柱，与所述层析柱通过柱下管道相连的流通池，与所述流通池相连的取样阀及取样口，与所述流通池通过光纤连接的近红外光谱仪，取样记录按钮，与所述近红外光谱仪和取样记录按钮相连的计算机。

优选地，柱层析流出液先经过所述流通池再经过所述取样阀及取样口。

优选地，所述取样记录按钮位于取样阀及取样口附近。

本发明还提供了一种三七总皂苷柱层析过程的近红外光谱在线检测方法，包括：

(1)经层析柱洗脱的样本通过柱下管道进入流通池，近红外光谱仪通过光纤实时在线采集流通池中样本的近红外光谱，同时按下取样记录按钮，取样记录按钮记录取样时间及样品信息，并将采集和记录结果传输到所述计算机中；

(2)通过取样阀及取样口采集样本，并采用参考分析方法测定样本中皂苷浓度；

(3)对步骤(1)中采集的样本近红外光谱进行异常样本剔除和样本划分，然后选择合适的光谱波段和预处理方法，提取光谱特征信息；使用多变量数据分析方法构建近红外特征光谱与样本中皂苷浓度之间的定量校正模型，将模型输入至所述计算机中；

(4)模型的应用：根据步骤(1)实时在线采集待测样本的近红外光谱，根据步骤(3)建立的定量校正模型，实时输出待测样本中皂苷浓度。

所述样本为三七总皂苷柱层析过程的柱层析流出液。

优选地，步骤(1)前还包括对所述近红外光谱在线检测系统进行考察，基本的考察项目包括：光谱测量序列运行时间、检测时滞计算、光谱采集参数优化、流通池光窗气泡检测、取样对光谱稳定性的影响、光谱质量评价、流通池光窗清洁残留检测等。

所述流通池的光程为2mm，近红外光谱采集以空气为背景，光谱范围为12000～4000cm^-1，分辨率为8cm^-1，扫描次数为64次。

步骤(2)中，所述参考分析方法为高效液相色谱法(hplc)或/和超高效液相色谱法(uplc)。

所述皂苷包括三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1和人参皂苷rd及5种皂苷浓度的总和。

步骤(3)中，所述多变量数据分析方法为偏最小二乘(pls)回归法。

步骤(3)中，根据交叉检验结果，剔除显示异常的样本。

如何挑选具有代表性的样本建立模型是近红外分析技术的关键问题之一，有代表性的校正集样本不但可以减少建模的工作量，而且直接影响所建模型的适用性和准确性。步骤(3)中，常用的样本划分方法包括随机法、kennardstone(ks)法、spxy法等。

光谱波段范围直接影响到模型的模型性能和运算效率，通过波段筛选能够避免引入冗余信息。优选地，本发明选择光谱波数范围为9400～7500cm^-1、7500～6100cm^-1、6100～5450cm^-1、5450～4600cm^-1、4600～4250cm^-1任一波段或其组合波段参与建模。

步骤(3)中，所述预处理方法包括无光谱预处理、消除常数偏移量、减去一条直线、矢量归一化(snv)、最小-最大归一化、多元散射校正(msc)、一阶导数、二阶导数及其组合。

优选地，步骤(3)中还包括对所建立的定量校正模型的预测性能进行评价的步骤；评价指标包括决定系数r²、交叉验证均方根偏差rmsecv；进一步地，若r²接近于100％，rmsecv值越小，则所述定量校正模型适用于待测样品的检测；反之，则不适用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：实现三七总皂苷柱层析流出液有效成分的在线监测，实时测定流出液中三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rd浓度及以上5种皂苷浓度总和，快速、及时反映当前物料信息，有助于柱层析过程监测及可视化，提高生产过程的质量控制水平。

附图说明

图1为本发明三七总皂苷柱层析过程的近红外光谱在线检测系统示意图；

图2为三七总皂苷柱层析洗脱过程的在线近红外光谱图；

图3为皂苷浓度根据交叉验证得到近红外预测值和参考值之间的相关图；其中，a：三七皂苷r1，b：人参皂苷rg1，c：人参皂苷re，d：人参皂苷rb1，e：人参皂苷rd，f：5种皂苷总和(sum)；

图4为实验例1中六种皂苷模型预测值与实测值相关图；其中，a：三七皂苷r1，b：人参皂苷rg1，c：人参皂苷re，d：人参皂苷rb1，e：人参皂苷rd，f：5种皂苷总和(sum)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一种三七总皂苷柱层析过程的近红外光谱在线检测系统，如图1所示，包括：层析柱1，与所述层析柱1通过柱下管道2相连的流通池6，与所述流通池6相连的取样阀及取样口7，与所述流通池6通过光纤5连接的近红外光谱仪4，取样记录按钮8，与所述近红外光谱仪4和取样记录按钮8相连的计算机3。

柱层析流出液先经过所述流通池6再经过所述取样阀及取样口7。

所述取样记录按钮8位于取样阀及取样口7附近。

所述流通池6的光程为2mm，光谱采集以空气为背景，光谱范围为12000～4000cm^-1，分辨率为8cm^-1，扫描次数为64次。

在进行在线检测前，需要安装近红外光谱在线检测系统，同时考察安装的近红外光谱在线检测系统能否正常应用于三七总皂苷柱层析工艺环节，以达到实时采集准确、真实的光谱数据及输出结果达标的目的。基本的考察项目包括：光谱测量序列运行时间、检测时滞计算、光谱采集参数优化、流通池光窗气泡检测、取样对光谱稳定性的影响、光谱质量评价、流通池光窗清洁残留检测等。

一种三七总皂苷柱层析过程的近红外光谱在线检测方法，包括：

(1)经层析柱1洗脱的样本通过柱下管道2进入流通池6，近红外光谱仪4通过光纤5实时在线采集流通池6中样本的近红外光谱，同时按下取样记录按钮8，取样记录按钮8记录取样时间及样品信息，并将采集和记录结果传输到所述计算机3中；

本实施例中近红外光谱仪4使用brukermatrix-f型近红外光谱仪，光谱采集参数：光谱范围12000～4000cm^-1，分辨率8cm^-1，扫描次数64次，光谱采集间隔约50～60s。在线采集到的洗脱液原始近红外光谱如图2所示。洗脱过程关键工艺环节中，除开始点和结束点外，期间每0.5h取样一次，取样需按下取样记录按钮8，记录取样时间及样品信息。共获取7个批次的光谱数据与过程样本。

(2)通过取样阀及取样口7采集样本，并采用超高效液相色谱法(uplc)测定全部样本的三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rd浓度，以上述5种皂苷浓度及其浓度总和(sum)作为参考值。具体测定方法如下：

色谱条件：色谱柱acquitybehc18(1.7μm，2.1×50mm)，以流动相a：乙腈，流动相b：水，按以下梯度洗脱：0min(19％a)，3min(19％a)，3.5min(29％a)，5min(35％a)，8min(40％a)，9min(90％a)，11.9min(90％a)，12min(19％a)；流速为0.7ml/min；检测波长203nm；柱温30℃；进样量1μl。

标准品溶液的制备：精密称定已知含量的三七总皂苷粉末2951.30mg，置于250ml容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得“标1”。准确移取“标1”20ml于100ml容量瓶中，以甲醇稀释并定容，得“标2”。准确移取“标2”20ml于100ml容量瓶中，以甲醇稀释并定容，得“标3”。

标准曲线的制备：将标准品溶液分别按上述色谱条件进样分析，以各指标浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

供试品溶液的测定：样品恢复至室温，准确移取一定体积样品至10ml容量瓶，以甲醇定容，摇匀，经微孔滤膜过滤，进样分析。以标准曲线法计算各样品上述指标的浓度。

(3)对步骤(1)中采集的样本近红外光谱进行异常样本剔除和样本划分，然后选择合适的光谱波段和预处理方法，提取光谱特征信息；使用偏最小二乘(pls)回归法构建近红外特征光谱与样本中皂苷浓度之间的定量校正模型，将模型输入至所述计算机3中；

模型参数自动优化后，以使rmsecv最小的模型参数交叉检验，剔除交叉检验的结果中opus软件提示异常的样本，重新进行参数优化，直至无异常样本。此外，比较不剔除异常样本的模型预测性能，选择预测性能最佳的模型。

本实施例中以6批洗脱过程数据作为校正集，以第7个批次的过程样本为验证集。

pls算法及预处理方法、建模波段的优选均通过opus软件(version7.5build，brukeroptikgmbh)实现。以6批洗脱过程数据作为校正集，将步骤(1)中采集的光谱数据和步骤(2)中测定的皂苷浓度数据导入opus软件(层析过程光谱结合取样时间选择，每个样品对应1张光谱)，设置数据类型为“校正”、“测试光谱”或“排除”，以交叉检验(冻结样品的数目为1)所得rmsecv值作为模型参数选择依据，各个指标依次进行优化。

为了除去近红外光谱中的噪音和干扰，采用9400～7500cm^-1、7500～6100cm^-1、6100～5450cm^-1、5450～4600cm^-1、4600～4250cm^-1任一波段或其组合波段参与建模。分别比较了无光谱预处理、消除常数偏移量、减去一条直线、矢量归一化(snv)、最小-最大归一化、多元散射校正(msc)、一阶导数、二阶导数、一阶导数+减去一条直线、一阶导数+矢量归一化和一阶导数+多元散射校正这11种光谱预处理方法。

以5种皂苷浓度总和定量模型为例，分别以每种光谱预处理方法优化波段，所建模型性能参数见表1。可见，对于不同的光谱预处理方法，优选的波段不尽相同。经过不同光谱预处理方法和波段组合，模型的性能显著提高，rmsecv值可降至0.733mg/ml。综上，对于5种皂苷浓度总和的定量校正模型，选择的光谱预处理方法为一阶导数+矢量归一化(snv)，选择的波段为9403.5-7498.1cm^-1和6101.9-5446.2cm^-1。其余5个指标的模型参数优化过程与此相同。

表1不同光谱预处理方法及相应优化波段所得5种皂苷浓度总和(sum)模型结果比较

经过异常样本剔除、样本划分及预处理方法和建模波段的优化后，最终选用模型的各项参数及性能见表2，模型校正集r²均大于0.88，rmsecv值较小，表明模型性能良好。图3为皂苷浓度根据交叉验证得到近红外预测值和参考值之间的相关图，相关图同样表明所建回归模型具有较好的拟合效果及预测能力。

表2模型参数及性能

将步骤(3)中建立的定量校正模型对第7批柱层析洗脱过程样本进行预测，图4为模型预测值与实测值的关系图。结果表明，各指标预测值与实测值变化趋势一致，能够对三七总皂苷柱层析洗脱过程皂苷浓度快速分析，满足工业生产过程分析的要求。

(4)模型的应用

三七总皂苷柱层析洗脱过程中，使用与校正集光谱相同的光谱采集参数在线连续采集柱层析洗脱液的近红外光谱，将光谱输入至步骤(3)所建定量校正模型，检测系统实时输出洗脱液中三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rb1、人参皂苷rd浓度及以上5种皂苷浓度总和，从而快速、及时反映当前物料信息。同时，检测系统将上述指标随层析时间的变化趋势可视化，有助于监测柱层析洗脱过程，为过程控制提供基础。