专利名称：一种层析用硅胶及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种层析用硅胶及其制法；本发明还涉及超氧化物歧化酶(SOD)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)的提纯方法。
超氧化物歧化酶SOD(superoxide dismufase)j存在于备注血液中的一种酶，能歧化分解超氧自由基O2-以保护机体，目前已作为系列化药物，用于防治癌、辐射、病及抗衰老，一些高级护肤品中也加入SOD，SOD可由牛身、猪血和人身的红细胞提取。人绒毛膜促性腺激素，HCG(human chorionic gonadofropin)是存在于孕妇尿中的一种激素，用于孕娠和某些肿瘤的诊断，不孕症的治疗和避孕等。HCG可从孕妇尿中提取。
目前SOD和HCG的提取国内都采用DEAE纤维素(DEAE-Cellulose 32)，一般均用进口产品，价格昂贵，须回由反复使用，因此SOD和HCG的生产流程长，生产成本高。市售的层析硅胶都不能代替DEAE纤维素，用于SOD和HCG的分离提纯。
本发明的目的在于提供一种能替代DEAE纤维素用作SOD、HCG分离提纯吸附剂的，成本较低的层析用硅胶。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明的层析硅胶是在硅酸溶液中加入尿素和甲醛溶液，加咸在油状有机介质中县乳聚合得到硅胶与聚脲醛的″共聚物″，冲洗除去有机介质后，灼烧除去聚脲醛，得到孔径为55-90A的均匀球状颗粒硅胶。
本发明的层析硅胶的制法是在硅酸水溶液中，加入尿素，溶解后加入甲醛溶液，搅拦均匀，加入咸溶液，混匀后将此溶液立即倒入高速搅拌的、溶有非离子型表面活性剂的油状有机介质中，进行县涂聚合、沉淀出球状粒硅胶，冲洗除去有机介质，低温烘干，高温灼烧。得到具有规则层状微晶结构的、孔径为55-90A的层析用硅胶。
硅酸溶液与尿素和甲醛溶液用量的比例是150ml硅酸溶液(比重1.05-1.07)加入1-6克尿素，1.68-10.1ml36％甲醛溶液。
悬浮聚合，优选的油状有机介质是石蜡油。所用的非离子型表面活性剂，可以是甘油单硬脂酸酯，span60，丙二醇油酸酯等。
沉淀出的球状颗粒硅胶，用水冲洗，除去有机介质，在50-80℃烘干，然后在600-700℃灼烧1.5-3小时。
本发明的层析用硅胶，可替代DEAE纤维素提纯80D和HCG。即将本发明的层析用硅胶装柱，SOD或HCG经柱导析，由于杂蛋白被较强地吸附在层析硅胶上，而SOD或HCG光被洗脱下来达到纯化的目的，活力回收率分别达到90％以上和80％以上。
本发明的层析用硅胶制作比较简易，与DEAE纤维素相比成本比较低，因此用于提纯SOD或HCG可以不需要回收，减少了提纯SOD或HCG的工艺流程，降低了SOD和HCG的成本。
以下实施例进一步说明本发明。
实施例1.用水玻璃制取硅酸水溶液。
工业水玻璃加水，使其比重为1.07，每升此溶液加工业浓氨水30ml，搅拌5分钟以上，然后放置2天以上，这时水玻璃中的泥沙、重金属杂质等逐渐沉淀下来，倾泌出上层清液。
将阳离子交换树脂用水洗多次后，装入离子交换柱，用1.5MH2so4淋洗，等流出液PH为2左右为止，此时树脂已转化为H+型，再用水洗至中性。
取上述净化过的水玻璃溶液流过H+型阳离子交换柱，等流出液的PH＜5时开始收集，直至PH＝3为止，即得硅酸水溶液，其比重为1. 05-1.07。
实施例2.本发明的层析用硅胶的制取取实施例1的方法得到的硅酸水溶液150毫升，加入工业尿素2.85克，溶解后再加入36％甲醛水溶液4.8毫升，搅拌30分钟后，加入10％碳酸氢铵(化学纯)水溶液30毫升，混合后将此溶液迅速倒入高速搅拌的200毫升石蜡油中(石蜡油中溶有某油单硬酯酸酯400毫克，)继续搅拌40分钟，此时沉淀出圆珠形小颗粒状的硅胶，滤出硅胶，洗去石蜡油，在60℃烘干，然后在600℃灼烧1.5小时，得到本发明的层析用硅胶，其孔径为60-70A。
实施例3.本发明的层析用硅胶的制取取实施例1的方法得到的硅酸水溶液150毫升，加入工业尿素5.7克，溶解后再加入36％甲醛水溶液9.6毫升，其它步骤同实施例2.制得本发明的层析用硅胶，其孔径为55-65A。
实施例4.本发明的层析用硅胶的制取取实施例1的方法得到的硅酸水溶液150毫升，加入工业尿素1.42克，溶解后再加入36％甲醛水溶液2.4毫升，其它步骤同实施例2， 但石蜡油中含丙二醇油酸酯450豪克作为表面活性剂，制得本发明的层析用硅胶，其孔径为55-65A。
实施例5.本发明的层析用硅胶的制取步骤用量同实施例2.但最后在80℃烘干，700℃灼烧3小时，制得本发明的层析用硅胶，其孔径为70-90A。
实施例6.用本发明的层析用硅胶纯化SOD将实施例2所得本发明的层析用硅胶用蒸馏水洗涤，再用磷酸盐缓冲液洗涤后装入5毫升玻璃析管中。将透析后的粗SOD溶液通过层析柱，分部接收，每管约3毫升，第一管接收通过层析柱的SOD原液，然后用磷酸盐缓冲液淋洗，最后用浓度为0-200mmol/l的氯化钠溶液梯度洗脱，每管接收液分别取出适当体积以测活力和蛋白量，其结果见表1。
用实施例2-4制得的层析用硅胶提纯SOD，分部接收液的活力回收率和蛋白回收率见表2。
实施例7.用本发明的层析用硅胶纯化HCG将孕妇尿用尼龙网纱过滤，每升孕妇尿加入苯甲酸钠25-30克，完全溶解后加入冰醋酸约15毫升，当PH达4.5-4.0时，尿内蛋白质(包括HCG)附着在苯甲酸上一起沉淀析出，继续搅拌15分钟后静置2小时，抽滤、压干，将滤饼加到100-150毫升预冷的丙酮中，使苯甲酸溶解而蛋白质呈絮状沉淀，离心或过滤，用丙酮洗涤后干燥，一般每升孕妇尿得干品0.4-0.5克。
将此粗HCG用0.004M磷酸盐缓冲液溶解(PH7.0)，将本发明的层析用硅胶用水洗后装柱，装柱量为2克，用0.005M磷酸盐缓冲液淋洗达平衡后，将含HCG80000单位的HCG粗品溶液缓缓通过吸附柱，孕蛋白被吸附，HCG通过，流出液用截留分子量30000的超滤膜超滤，至体积为1/3，以除去磷酸盐并提高HCG浓度，用2倍体积-20℃无水乙醇沉淀，离心分出沉淀，真空干燥，得HCG纯品。用放射免疫测定法(radioimmunoassay RIA)分析，其结果列于表3。表1.管号 接收体积 A280 蛋白浓度 蛋白质 抑制率 总活力比重 活力百分数(ml)(mg)(mg) (％) (1000U) (1000U/mg) (％)13.000.2380.401.20047.69.3607.800 10.1223.001.0281.685.04041.861.500 12.202 66.5633.160.1610.270.81040.78.57110.581 9.2843.000.0750.130.39030.25.29413.574 5.7353.100.0450.070.217 - -- -63.100.0350.060.186 - -- -73.000.0240.050.150 - -- -83.000.0200.040.120 - -- -93.000.0030.000.000 - -- -粗SOD溶液3.00ml，蛋白总重量11.760mg，总活力92.40(1000U)，比活7.857(1000U/gm)表2层析硅胶纯化SOD时分部接收液的活力回收率和蛋白回收率前4管活力百分数(％)原液 回收 活力 原始总回收 前4管总活力 总活力 回收率 蛋白质 蛋白质 蛋白回1 2 3 4 (1000U) (1000U) (％) (mg)(mg) 收率(％)例2硅胶 10.12 66.56 9.28 5.73 92.400 84.725 91.7 11.760 8.113 63.3例3硅胶 9.42 70.86 10.35 5.10 23.352 22.290 95.5 14.713 11 004 81.9例4硅胶 7.48 46.38 35.22 7.52 23.424 22.619 96.6 30.744 22.477 63.6表3 用层析硅胶纯化HCG的结果上柱 得纯 得纯 得纯回收率HCG量HCG重HCG比活 HCG量iu (mg) (iu/mg) (iu) (％)例2硅胶 80000105.0618 6489081.1例3硅胶 8000090.5 612 5538669.2例4硅胶 8000057.3 864 4950761.9例5硅胶 8000044.6 550 2453030.权利要求
1.一种层析硅胶，具有规则的层状微晶结构，其特征是在硅酸溶液中加入尿素和甲醛溶液，加碱在油状有机介质中县乳聚合，然后灼烧除去聚脲醛，得到的孔径为55-90A的均匀球状颗粒硅胶。
2.根据权利要求1所述的层析用硅胶的制法，其特征是在硅酸水溶液中，加入尿素，溶解后加入甲醛溶液，搅拌均匀，加入碱溶液，将此溶液立即倒入高速搅拌的、溶有非离子型表面活性剂的油状有机介质中，进行县涂聚合，沉淀出球状粒硅胶，冲洗除去有机介质，低温烘干，高温灼烧，得到具有规则层状微晶结构的、孔径为55-90A的层析用硅胶。
3.根据权利要求1所述的层析用硅胶的制法，其特征是有机介质是石蜡油，非离子型表面活性剂是某油单硬脂酸酯，span60，丙二醇油酸酯。
4.根据权利要求1所述的层析用硅胶的制法，其特征是在50-80℃烘干，在600-700℃灼烧。
5.根据权利要求1所述的层析用硅胶的用途，其特征是用于分离提屯氧化物歧化酶。
6.根据权利要求1所述的层析用硅胶的用途，其特征是用于分离提纯人绒毛膜促性腺激素。
全文摘要
一种层析用硅胶，它是在硅酸溶液中加入尿素和甲醛溶液，加碱在油状有机介质中县乳聚合得到硅胶与聚脲醛的“共聚物”，冲洗除去有机介质后，灼烧除去聚脲醛，得到孔径为55-90A的均匀球状颗粒硅胶。此硅胶可替代DEAE纤维素超氧化物歧化酶和人绒毛膜促性腺激素，有很好的提纯效果和活力回收率。
文档编号C01B33/16GK1163796SQ96116910
公开日1997年11月5日 申请日期1996年4月30日 优先权日1996年4月30日
发明者罗勤慧, 沈孟长 申请人:南京大学