一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂，主要含有DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CTL细胞、质量浓度为1.2?1.5％的人血白蛋白、胸腺五肽与生理盐水；其中，上述细胞总数量为1.5×108?3×108个/ml；本发明提供细胞制剂中复合DC细胞、CIK细胞、NK细胞与CTL细胞，多种细胞相互作用，该细胞制剂用于肿瘤辅助治疗，可使治疗后患者的生活质量明显提高，患者的生存期也大大延伸；细胞制剂中含有人血白蛋白、胸腺五肽与生理盐水，可以保护细胞，通过维持渗透压，确保细胞的活性。
【专利说明】
一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂
技术领域
[0001]本发明属于细胞制剂技术领域，涉及一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂。
【背景技术】
[0002]现代肿瘤综合治疗包括:直接针对肿瘤组织的治疗和与之相配合的辅助治疗。前者有:手术治疗、化学治疗、放射治疗、介入治疗、基因治疗及微波、射频、冷冻治疗等。那么，肿瘤辅助治疗就是针对上述直接切除肿瘤组织或破坏肿瘤细胞而言的治疗。从广义上讲肿瘤辅助治疗的内容很多，如肿瘤手术前后的辅助化疗、化疗时止吐治疗、化疗时保护肝肾功能、保护骨髓组织的治疗、放射治疗时增敏治疗、肿瘤病人各种并发症的治疗、肿瘤病人各种护理治疗、免疫治疗、中药治疗、中医扶正固本治疗、心理治疗、晚期癌症的镇痛治疗、气功治疗等等，这些都可以看成是肿瘤辅助治疗的范畴。
[0003]肿瘤是一种全身性的慢性疾病，病人治疗要有长远而全面的考虑，病情的不同阶段有不同的治疗方法，循征医学认为治疗肿瘤既要消灭肿瘤组织，又要最大限度保护好整个机体组织。虽然肿瘤辅助治疗有时处于次要地位，但是肿瘤辅助治疗决不是可有可无的治疗，一定时期的肿瘤辅助治疗还是非常重要的治疗，肿瘤治疗和肿瘤辅助治疗只是相对而言的，两者是辨证统一的关系，相辅相成的关系。
[0004]现有技术中应用的肿瘤生物治疗多为一类免疫细胞制剂，如CIK细胞，NK细胞，这些细胞制剂其对于肿瘤的治疗有一定效果。但目前针对于肿瘤辅助治疗的细胞制剂还不能满足市场需要。
【发明内容】
[0005]为了弥补目前细胞制剂在肿瘤辅助治疗方面的不足，本发明提供一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0007]—种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂，含有DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CTL细胞、质量浓度为1.2-1.5 %的人血白蛋白、胸腺五肽与生理盐水;其中，上述细胞总数量为1.5 X 18-3 X 18 个/ml;
[0008]该细胞制剂由下述步骤制得:
[0009]I)制备DC细胞:用含有rhGM-CSF和rhIL-4的RPM1-1640培养液培养分离的外周血单个核细胞，收集非贴壁细胞，并加入γ -干扰素培养，然后移入经CD3McAb包被过的培养瓶中，加入rhIL-2继续培养两周，收集细胞；
[0010]2)制备NK细胞:取步骤I)中收集到的非贴壁细胞，接种于培养瓶内使用GT-T561培养基重悬细胞，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37 °C,5% CO2培养箱中培养两周，收集细胞；
[0011 ] 3)制备CIK细胞:取步骤I)收集的悬浮液，分别加入A頂-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37°C,5%CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50%的培养基，将每瓶CIK细胞的一半量移出，作为CTL培养，剩余半量继续培养两周，收集细胞；
[0012]4)制备CTL细胞:向步骤3)移出的一半量CIK细胞，加入DC疫苗，使CIK和DC比例控制为4: I，继续培养3天获取CT细胞；
[0013]5)将DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CTL细胞分别进行洗涤、离心得到细胞悬液;将过滤后的细胞悬液混合，并加入质量浓度为1.2-1.5%的人血白蛋白、胸腺五肽与生理盐水，得到细胞制剂。
[0014]所述的培养液中rhGM-CSF和rhIL-4的终浓度均为500-1000U/ml。
[0015]所述的培养液中rhIL-2的终浓度为500-1000IU/ml。
[0016]所述的自体血浆上清的体积为培养液体积的10%。
[0017]所述的所述的离心的条件为2000rpm，离心15min。
[0018]本发明的有益效果:本发明提供的用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂中复合DC细胞、CIK细胞、NK细胞与CTL细胞，多种细胞相互作用，可使治疗后患者的生活质量明显提高，患者的生存期也大大延伸；细胞制剂中含有人血白蛋白、胸腺五肽与生理盐水，可以保护细胞，通过维持渗透压，确保细胞的活性。
【具体实施方式】
[0019]下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0020]实施例1
[0021 ] I)制备DC细胞:用含有浓度均为1000U/ml rhGM-CSF和rhIL_4的RPM1-1640培养液培养分离的外周血单个核细胞，收集非贴壁细胞，并加入γ -干扰素培养，然后移入经CD3McAb包被过的培养瓶中，加入浓度为500IU/ml rhIL_2继续培养两周，收集细胞；
[0022]2)制备NK细胞:取步骤I)中收集到的非贴壁细胞，接种于培养瓶内使用GT-T561培养基重悬细胞，向培养瓶的培养液中添加浓度为1000IU/ml rhlL-2和体积为培养液体积的10 %自体血浆上清，置于37 °C，5 % CO2培养箱中培养两周，收集细胞；
[0023]3)制备CIK细胞:取步骤I)收集的悬浮液，分别加入AM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37°C,5%⑶2细胞培养箱中培养，次日，补充50%的培养基，将每瓶CIK细胞的一半量移出，作为CTL培养，剩余半量继续培养两周，收集细胞；
[0024]4)制备CTL细胞:向步骤3)移出的一半量CIK细胞，加入DC疫苗，使CIK和DC比例控制为4: I，继续培养3天获取CT细胞；
[0025]5)将DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CTL细胞分别进行洗涤、2000rpm，离心15min得到细胞悬液;将过滤后的混合，配置细胞总数量为1.5 X 18个/ml的细胞悬液，并向上述细胞悬液中加入0.5 %人血白蛋白2.0g，胸腺五肽5mg，250ml生理盐水，制备成肿瘤特异性杀伤细胞制剂，得到细胞制剂。
[0026]DC治疗对肿瘤治疗的原理
[0027]1、DC细胞可以高表达MHC-1类和MHC-Π类分子，MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC-1类限制性CTL反应和MHC- Π类限制性的CD4+Thl反应。同时，DC还通过其高表达的共刺激分子(CD80/B7-l、CD86/B7-2、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。
[0028]2、DC与T细胞结合可大量分泌IL-12、IL-18激活T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Thl型免疫应答，利于肿瘤清除;激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；
[0029]3、DC分泌趋化因子专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集，增强了T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在，可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN- γ )及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述CCK进一步以正反馈旁分泌的方式活化DC，上调IL-12及⑶80、CD86的表达；同时DC也直接向⑶8+Τ细胞呈递抗原肽，在活化的⑶4+Τ细胞辅助下使⑶8+T细胞活化，CD4+和⑶8+T细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤，增强机体抗肿瘤免疫应答。
[0030]CIK治疗对肿瘤治疗的原理
[0031]1、CIK细胞能以不同的机制识别肿瘤细胞通过直接的细胞质颗粒穿透封闭的肿瘤细胞膜进行胞吐.实现对肿瘤细胞的裂解；
[0032]2、通过诱导肿瘤细胞凋亡杀伤肿瘤细胞；
[0033]3、(:11(细胞分泌11^-2、几-6、研1丫等多种抗肿瘤的细胞因子；
[0034]4、CIK细胞回输后可以激活机体免疫系统，提高机体的免疫功能。
[0035]实施例1
[0036]I)制备DC细胞:用含有浓度均为500U/ml rhGM-CSF和rhIL_4的RPM1-1640培养液培养分离的外周血单个核细胞，收集非贴壁细胞，并加入γ -干扰素培养，然后移入经CD3McAb包被过的培养瓶中，加入浓度为1000IU/ml rhIL_2继续培养两周，收集细胞；
[0037]2)制备NK细胞:取步骤I)中收集到的非贴壁细胞，接种于培养瓶内使用GT-T561培养基重悬细胞，向培养瓶的培养液中添加浓度为500IU/ml rhIL-2和体积为培养液体积的10 %自体血浆上清，置于37 °C，5 % CO2培养箱中培养两周，收集细胞；
[0038]3)制备CIK细胞:取步骤I)收集的悬浮液，分别加入A頂-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37°C,5%CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50%的培养基，将每瓶CIK细胞的一半量移出，作为CTL培养，剩余半量继续培养两周，收集细胞；
[0039]4)制备CTL细胞:向步骤3)移出的一半量CIK细胞，加入DC疫苗，使CIK和DC比例控制为4: I，继续培养3天获取CT细胞；
[0040]5)将DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CTL细胞分别进行洗涤、2000rpm，离心15min得到细胞悬液;将过滤后的混合，配置细胞总数量为3 X 18个/ml的细胞悬液，并向上述细胞悬液中加入0.8 %人血白蛋白2.0g，胸腺五肽5mg，250ml生理盐水，制备成肿瘤特异性杀伤细胞制剂，得到细胞制剂。
[0041 ]本发明提供的用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂中复合DC细胞、CIK细胞、NK细胞与CTL细胞，多种细胞相互作用，可使治疗后患者的生活质量明显提高，患者的生存期也大大延伸;细胞制剂中含有人血白蛋白、胸腺五肽与生理盐水，可以保护细胞，通过维持渗透压，确保细胞的活性。
[0042]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0043]以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的【具体实施方式】。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
【主权项】
1.一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂，其特征在于，该细胞制剂含有DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CTL细胞、质量浓度为1.2-1.5%的人血白蛋白、胸腺五肽与生理盐水;其中，上述细胞总数量为1.5 X 108-3 X 18个/ml ； 该细胞制剂由下述步骤制得: 1)制备DC细胞:用含有rhGM-CSF和rhIL-4的RPM1-1640培养液培养分离的外周血单个核细胞，收集非贴壁细胞，并加入γ -干扰素培养，然后移入经⑶3McAb包被过的培养瓶中，加入rhIL-2继续培养两周，收集细胞； 2)制备NK细胞:取步骤I)中收集到的非贴壁细胞，接种于培养瓶内使用GT-T561培养基重悬细胞，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37 °C,5% CO2培养箱中培养两周，收集细胞； 3)制备CIK细胞:取步骤I)收集的悬浮液，分别加入A頂-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37 °C,5% CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50 %的培养基，将每瓶CIK细胞的一半量移出，作为CTL培养，剩余半量继续培养两周，收集细胞； 4)制备CTL细胞:向步骤3)移出的一半量CIK细胞，加入DC疫苗，使CIK和DC比例控制为4:1，继续培养3天获取CT细胞； 5)将DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CTL细胞分别进行洗涤、离心得到细胞悬液;将过滤后的细胞悬液混合，并加入质量浓度为1.2-1.5%的人血白蛋白、胸腺五肽与生理盐水，得到细胞制剂。2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂，其特征在于，所述的培养液中rhGM-CSF和rhIL-4的终浓度均为500-1000U/ml。3.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂，其特征在于，所述的培养液中rhIL-2的终浓度为500-1000IU/ml。4.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂，其特征在于，所述的自体血浆上清的体积为培养液体积的10%。5.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤辅助治疗的细胞制剂，其特征在于，所述的所述的离心的条件为2000rpm，离心15min。
【文档编号】A61P35/00GK105998069SQ201610570581
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】张正亮
【申请人】安徽惠恩生物科技股份有限公司