一种碳纳米球粒制剂及其制备方法和抗幽门螺杆菌感染实验方法
【专利摘要】本发明公开了一种碳纳米球粒制剂及其制备方法和抗幽门螺杆菌感染实验方法，碳纳米球粒制剂由碳纳米球粒和分散液混合构成，碳纳米球粒制剂的浓度为0.1％～1.0％，其中，分散液为去离子水，95％以上的碳纳米球粒的粒径为5～30nm。其具有成本低廉、制备容易、稳定性好、安全性高、抗幽门螺杆菌感染效果好的优点。碳纳米球粒制剂的制备方法具有实施容易、工艺简单、操作方便的特点。碳纳米球粒制剂抗幽门螺杆菌感染的实验方法具有实施方便、科学合理的特点。本发明的碳纳米球粒制剂可作为治疗幽门螺杆菌感染的新药开发，为开发抗幽门螺杆菌的药物开启了新的思路，也为抗幽门螺杆菌感染的防治提供了新策略。
【专利说明】
-种碳纳米球粒制剂及其制备方法和抗幽口螺杆菌感染实验 方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种碳纳米材料，尤其是设及一种碳纳米球粒制剂及其制备方法，W 及该碳纳米球粒制剂抗幽口螺杆菌感染的实验方法。
【背景技术】
[0002] 幽口螺杆菌化elicobacter p^ori，化)感染性相关疾病，如胃炎、胃溃瘍、十二指 肠溃瘍和胃癌严重危害着人类的身体健康。据世界卫生组织(WHO)资料统计，全球约有50% 的人口感染幽口螺杆菌，尤其是我国的幽口螺杆菌病情较为严峻，大约60%的人感染幽口 螺杆菌，WHO已将幽口螺杆菌归为胃癌的一类致癌因子。目前，治疗幽口螺杆菌感染通过采 用抗生素与胃酸抑制剂的联合疗法。但由于抗生素的耐药性越来越严重，致使用药剂量加 大、疗程延长，并伴随着药物不良反应加重、复发率依然居高不下的问题。因此，临床迫切需 要非抗生素的新疗法W及抗幽口螺杆菌感染的新策略、新材料。
[0003] 碳纳米材料是一类新型的纳米技术材料，有着多种用途。碳纳米材料中的碳纳米 管具有抗菌作用，而碳纳米材料中的碳纳米球粒(Carbon nanospheres，CNS)具有运输药物 和巧光示踪等作用。由于碳纳米球粒有着独特的结构和特性，其潜在的生物医学应用有待 开发。目前，还没有碳纳米球粒抗菌作用的研究报道，也没有碳纳米球粒抗幽口螺杆菌的研 究报道。幽口螺杆菌对机体的危害，一方面是幽口螺杆菌本身的作用，另一方面是其代谢产 物如尿素酶的作用。幽口螺杆菌能产生大量尿素酶，尿素酶在幽口螺杆菌感染中起定植和 毒力的作用，是致病因子，同时尿素酶也是治疗幽口螺杆菌的祀点。因此，碳纳米球粒或其 制剂如果既能直接抑制或杀灭幽口螺杆菌菌体本身，又能够抑制或破坏幽口螺杆菌的尿素 酶，那么该碳纳米球粒及其制剂就具有巨大的抗幽口螺杆菌应用前景。
[0004] 虽然已有将碳纳米材料中的纳米碳粉制成幽口螺杆菌治疗剂的研究，如申请号为 2014104902353和2014104898659的专利申请，但其两者选用的纳米碳粉粉体粒径95% W上 小于等于5nm;带负电荷，其治疗剂采用人体等渗溶液分散制备，其PH值被控制在7.8~9.1。 其主要存在W下几方面的问题：1)由于其95% W上纳米碳粉粉体粒径为小于等于5nm，因其 粒径太小容易穿透进入人体细胞，更容易产生毒性或加大毒性;2)因等渗溶液含大量阳离 子，带正电荷，其对富含负电荷的纳米碳粉粉体的长期稳定性会产生一定影响。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种碳纳米球粒制剂及其制备方法和抗幽口螺杆菌感染实 验方法，其中，碳纳米球粒制剂具有成本低廉、制备容易、稳定性好、安全性高的优点，制备 方法具有实施容易、工艺简单、操作方便的特点，实验方法具有实施方便、科学合理的特点。
[0006] 为解决现有技术中治疗幽口螺杆菌感染的传统疗法其存在的抗生素耐药性越来 越严重，致使用药剂量加大、疗程延长、药物不良反应加重和感染复发率居高不下的问题， 本发明提供的一种碳纳米球粒制剂，由碳纳米球粒和分散液混合构成，碳纳米球粒制剂的 浓度为ο .1%~1.0%，其中，分散液为去离子水，95 % w上的碳纳米球粒的粒径为5~30nm。
[0007] 进一步的，本发明一种碳纳米球粒制剂，其中，所述碳纳米球粒制剂的PH值为7.1 ~7.6。
[0008] 进一步的，本发明一种碳纳米球粒制剂，其中，所述碳纳米球粒的粒径频数百分比 为:粒径为5~lOnm的碳纳米球粒占20~30%，粒径为10~15nm的碳纳米球粒占25~35%， 粒径为15~20nm的碳纳米球粒占15~25%，粒径为20~25nm的碳纳米球粒占6~10%，粒径 为25~3〇11111的碳纳米球粒占1~7%。
[0009] 本发明提供的一种碳纳米球粒制剂的制备方法，包括W下步骤：
[0010] -、W石墨締为原始材料加工制备碳纳米球粒；
[0011] 二、利用透射电镜筛选粒径符合要求的碳纳米球粒，其中，粒径为5~30nm的碳纳 米球粒占95 % W上;碳纳米球粒呈单个球形分散；
[0012] Ξ、根据浓度要求，分别称取经步骤二筛选后的碳纳米球粒和量取去离子水，备 用；
[0013] 四、将步骤Ξ得到的碳纳米球粒和去离子水混合分散；
[0014] 五、对经步骤四混合得到的混合液进行揽拌处理，其中，揽拌时间为10~20分钟， 揽拌速度为60~80r/min;
[0015] 六、对经步骤五揽拌处理后的混合液进行超声处理，其中，超声时间为15~20分 钟，超声强度为80~lOOw;
[0016] 屯、利用碳酸氨钢一碳酸钢缓冲液对经步骤六超声处理后的混合液进行调整PH值 处理，将混合液的PH值调整为7.1~7.6，得到最终的碳纳米球粒制剂。
[0017] 进一步的，本发明一种碳纳米球粒制剂的制备方法，其中，在步骤二中所述粒径为 5~30nm的碳纳米球粒占95%W上，其中，碳纳米球粒的粒径频数百分比为:粒径为5~1 Onm 的碳纳米球粒占20~30%，粒径为10~15皿的碳纳米球粒占25~35%，粒径为15~20nm的 碳纳米球粒占15~25%，粒径为20~25皿的碳纳米球粒占6~10%，粒径为25~30皿的碳纳 米球粒占1~7 %。
[0018] 进一步的，本发明一种碳纳米球粒制剂的制备方法，其中，在步骤六中所述对经步 骤五揽拌处理后的混合液进行超声处理，是在低溫水浴下进行超声处理的。
[0019] 进一步的，本发明一种碳纳米球粒制剂的制备方法，其中，在步骤六中所述超声时 间为15~20分钟，是指超声全程时间为15~20分钟，其中，单次超声时间为3秒，间隙时间为 3秒。
[0020] 本发明提供的一种碳纳米球粒制剂抗幽口螺杆菌感染的实验方法，包括W下步 骤：
[0021] I、通过体外快速尿素酶实验检测碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌尿素酶的抑制率；
[0022] Π 、利用透射电镜观察碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌的直接损伤作用；
[0023] 虹、根据步骤I和步骤Π 的结果分析确定碳纳米球粒制剂抗幽口螺杆菌感染的特 性。
[0024] 进一步的，本发明一种碳纳米球粒制剂抗幽口螺杆菌感染的实验方法，其中，在步 骤I中所述通过体外快速尿素酶实验检测碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌尿素酶的抑制率， 包括W下步骤：
[00巧]a、制备及稀释样本：用生理盐水将化licobacter pylori SSI菌液109CFU/ml稀释 1000倍至106CFU/ml，备用;将浓度分别为1.0%、0.5%、0.4%的^种碳纳米球粒制剂用去 离子水稀释100倍，备用，稀释后的Ξ种碳纳米球粒制剂的浓度分别为100ug/ml、50ug/ml、 40ug/ml;将尿素酶抑制剂乙酷氧朽酸先用去离子水溶解成1%，然后再用去离子水稀释100 倍，备用;稀释后的尿素酶抑制剂乙酷氧朽酸浓度为lOOug/ml;取去离子水，备用；其中，尿 素酶抑制剂乙酷氧目亏酸作为阳性对照，去离子水作为阴性对照；
[0026] b、上样:在96孔板的孔中加入lOul的106CFU/ml菌液，复Ξ孔;加完后，按照分组分 别迅速加入100ug/ml、50ug/ml、40ug/mlS种碳纳米球粒制剂、去离子水、lOOug/ml乙酷氧 月亏酸各90ul;
[0027] C、解育:上样后采用封口膜密封96孔板，并在4°C的恒溫箱中解育24小时；
[00%] d、显色:解育完后，在相应的孔中加入50ul的尿素试剂，并放于37°C的恒溫箱中解 育30分种显色；
[0029] e、读数:解育30分种后，在578nm波长处读数，并记录每组的0D值；
[0030] f、计算抑制率:抑制率=【1 -(0顿起-0D拍)/(0故服-0D拍)】X 100 %。
[0031] 进一步的，本发明一种碳纳米球粒制剂抗幽口螺杆菌感染的实验方法，其中，在步 骤Π 中所述利用透射电镜观察碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌的直接损伤作用，包括W下步 骤：
[0032] g、菌液制备：用生理盐水将幽口螺杆菌NTCC11637菌液10化FU/ml稀释10倍至 10化即/ml,备用；
[0033] h、上样：取12只1ml试管，在每管中加入360ul的10化即/ml幽口螺杆菌NTCC11637 菌液，复Ξ孔;加完后，按照分组分别迅速加入0.4%、0.1%的碳纳米球粒制剂、去离子水、 0.1 %克拉霉素各40ul，混匀;其中，去离子水作为阴性对照，克拉霉素作为阳性对照；
[0034] i、反应:上样后采用封口膜密封孔板，先在37Γ的恒溫摇床摇菌培养10分种，然后 取出并迅速放入37°C的恒溫箱中培养30分种；
[0035] j、染色:取lOOul反应液置于透射电镜铜网上，并用1.0%憐鹤酸负染色；
[0036] k、观察:在透射电镜下观察幽口螺杆菌的形态特点，并判断碳纳米球粒制剂对幽 口螺杆菌直接损伤结果。
[0037] 本发明一种碳纳米球粒制剂及其制备方法和抗幽口螺杆菌感染实验方法与现有 技术相比，具有W下优点：（1)本发明提供的碳纳米球粒制剂采用非抗生素的碳纳米球粒为 制剂原料，而且将95% W上的球粒粒径控制在5~30nm，避免了因粒径过小对机体产生毒性 或增大毒性的问题，提供了安全性。（2)采用去离子水作为分散液，充分利用碳纳米球粒表 面的多孔，增强了吸水性，使碳纳米球粒在去离子水中的分散率达99.5% W上，且因去离子 水不含其他金属阳离子，使带负电荷的碳纳米球粒不受受阳离子影响，在水中呈单个球形 分散，避免了球粒团聚的问题，保证了碳纳米球粒制剂的高度稳定性。（3)本发明通过将碳 纳米球粒制剂的PH值控制在7.1~7.6，减小或排除了碳纳米球粒制剂中PH(抗酸性)对幽口 螺杆菌生长的影响，更能突出体现碳纳米球粒本身对幽口螺杆菌的抗菌作用。（4)本发明的 碳纳米球粒制剂具有成本低廉、制备容易、稳定性好、安全性高的优点，其制备方法具有实 施容易、工艺简单、操作方便的优点，实验方法具有实施方便、科学合理的优点。（5)实验表 明，本发明的碳纳米球粒制剂具有突出而强大的抗幽口螺杆菌效果，对幽口螺杆菌尿素酶 活性抑制率高，所需剂量小;碳纳米球粒对幽口螺杆菌有直接损伤效应，对幽口螺杆菌鞭毛 和细胞膜细胞壁损伤明显。（6)本发明的碳纳米球粒制剂可作为治疗幽口螺杆菌感染的新 药开发，为开发抗幽口螺杆菌的药物开启了新的思路，也将为抗幽口螺杆菌感染的防治提 供新的策略。
[0038] 下面结合附图所示【具体实施方式】对本发明一种碳纳米球粒制剂及其制备方法和 抗幽口螺杆菌感染实验方法作进一步详细说明：
【附图说明】
[0039] 图1为通过透射电镜(TEM)观察碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌的直接损伤实验中， 400ug/ml高剂量碳纳米球粒制剂组的幽口螺杆菌形态图；
[0040] 图2为通过透射电镜(TEM)观察碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌的直接损伤实验中， lOOug/ml低剂量碳纳米球粒制剂组的幽口螺杆菌形态图；
[0041] 图3为通过透射电镜(TEM)观察碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌的直接损伤实验中， lOOug/ml克拉霉素组的幽口螺杆菌形态图；
[0042] 图4为通过透射电镜(TEM)观察碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌的直接损伤实验中， 去离子水组的幽口螺杆菌形态图。
【具体实施方式】
[0043] 首先需要说明的是，本发明既提供了一种碳纳米球粒制剂，又提供了其制备方法， 同时还提供了碳纳米球粒制剂抗幽口螺杆菌感染的实验方法。
[0044] 作为【具体实施方式】，碳纳米球粒制剂由碳纳米球粒和分散液混合构成，并使其浓 度控制在0.1 %~1.0%。其中，分散液为去离子水，95% W上的碳纳米球粒的粒径为5~ 3化m。为减小或排除了碳纳米球粒制剂中PH(抗酸性)对幽口螺杆菌生长的影响，更能突出 体现碳纳米球粒本身对幽口螺杆菌的抗菌作用，本【具体实施方式】让碳纳米球粒制剂的PH值 为7.1~7.6。
[0045] 作为优化方案，本【具体实施方式】使碳纳米球粒的粒径频数百分比采用W下数值： 让粒径为5~10皿的碳纳米球粒占20~30 %，让粒径为10~15皿的碳纳米球粒占25~35 %， 让粒径为15~20nm的碳纳米球粒占15~25%，让粒径为20~25nm的碳纳米球粒占6~10%， 让粒径为25~30nm的碳纳米球粒占1~7%。
[0046] 本发明提供的碳纳米球粒制剂采用非抗生素的碳纳米球粒为制剂原料，而且将 95% W上的球粒粒径控制在5~30nm，避免了因粒径过小对机体产生毒性或增大毒性的问 题，提供了安全性。并通过采用去离子水作为分散液，充分利用碳纳米球粒表面的多孔增强 了吸水性，使碳纳米球粒在去离子水中的分散率达99.5% W上，且因去离子水不含其他金 属阳离子，使带负电荷的碳纳米球粒不受受阳离子影响，在水中呈单个球形分散，避免了球 粒团聚的问题，保证了碳纳米球粒制剂的高度稳定性。同时，本发明提供的碳纳米球粒制剂 具有成本低廉、制备容易、稳定性好、安全性高的优点。实验表明，本发明提供的碳纳米球粒 制剂具有突出而强大的抗幽口螺杆菌效果，对幽口螺杆菌尿素酶活性抑制率高、所需剂量 小。碳纳米球粒对幽口螺杆菌有直接损伤效应，对幽口螺杆菌鞭毛和细胞膜细胞壁损伤明 显。本发明的碳纳米球粒制剂可作为治疗幽口螺杆菌感染的新药开发，为开发抗幽口螺杆 菌的药物开启了新的思路，也将为抗幽口螺杆菌感染的防治提供新的策略。
[0047]作为【具体实施方式】，碳纳米球粒制剂的制备方法，包括W下步骤：
[004引 一、W石墨締为原始材料加工制备碳纳米球粒；
[0049] 二、利用透射电镜筛选粒径符合要求的碳纳米球粒，其中，粒径为5~30nm的碳纳 米球粒占95 % W上;碳纳米球粒呈单个球形分散；
[0050] Ξ、根据浓度要求，分别称取经步骤二筛选后的碳纳米球粒和量取去离子水，备 用；
[0051 ]四、将步骤Ξ得到的碳纳米球粒和去离子水混合分散；
[0052] 五、对经步骤四混合得到的混合液进行揽拌处理，其中，揽拌时间为10~20分钟， 揽拌速度为60~80r/min;
[0053] 六、对经步骤五揽拌处理后的混合液进行超声处理，其中，超声时间为15~20分 钟，超声强度为80~lOOw;
[0054] 屯、利用碳酸氨钢一碳酸钢缓冲液对经步骤六超声处理后的混合液进行调PH值处 理，将混合液的PH值调整为7.1~7.6，得到最终的碳纳米球粒制剂。
[0055] 在上述步骤二中，所述粒径为5~30nm的碳纳米球粒占95% W上，其中，碳纳米球 粒的粒径频数百分比为:粒径为5~lOnm的碳纳米球粒占20~30%，粒径为10~15nm的碳纳 米球粒占25~35%，粒径为15~20nm的碳纳米球粒占15~25%，粒径为20~25皿的碳纳米 球粒占6~10%，粒径为25~30nm的碳纳米球粒占1~7%。
[0056] 在上述步骤六中，所述对经步骤五揽拌处理后的混合液进行超声处理，是在低溫 水浴下进行超声处理的。
[0057] 在上述步骤六中，所述超声时间为15~20分钟，是指超声全程时间为15~20分钟， 其中，单次超声时间为3秒，间隙时间为3秒。
[005引实施例1:制备碳纳米球粒和去离子水。
[0059] W石墨締为原始材料加工制备碳纳米球粒，在透射电镜下筛选粒径为5~30nm的 碳纳米球粒，备用。应保证粒径为5~30nm的碳纳米球粒占总量的95 % W上。
[0060] 制备去离子水，备用。
[0061 ] 实施例2:制备1.0%的碳纳米球粒制剂。
[0062] 根据1.0 %的浓度要求，取定量的碳纳米球粒和去离子水混合分散，并揽拌20分 钟，其中揽拌速度为80r/min。
[0063] 对揽拌后的混合液进行超声处理，其中超声全程时间设为20分钟，单次超声时间 设为3秒，间隙时间设为3秒，超声强度设为lOOw(低溫水浴下超声）。
[0064] 对超声后的混合液采用碳酸氨钢一碳酸钢缓冲液进行调PH值处理，并将混合混的 最终PH值调至7.6，W得到符合要求的碳纳米球粒制剂。
[0(?日]实施例3:制备0.5%的碳纳米球粒制剂。
[0066] 根据0.5%的浓度要求，取定量的碳纳米球粒和去离子水混合分散，并揽拌15分 钟，其中揽拌速度为70r/min。
[0067] 对揽拌后的混合液进行超声处理，其中超声全程时间设为18分钟，单次超声时间 设为3秒，间隙时间设为3秒，超声强度设为lOOw(低溫水浴下超声）。
[0068] 对超声后的混合液采用碳酸氨钢一碳酸钢缓冲液进行调PH值处理，并将混合混的 最终PH值调至7.4，W得到符合要求的碳纳米球粒制剂。
[0069] 实施例4:制备0.2%的碳纳米球粒制剂。
[0070] 根据0.2 %的浓度要求，取定量的碳纳米球粒和去离子水混合分散，并揽拌10分 钟，其中揽拌速度为60r/min。
[0071] 对揽拌后的混合液进行超声处理，其中超声全程时间设为15分钟，单次超声时间 设为3秒，间隙时间设为3秒，超声强度设为80w(低溫水浴下超声）。
[0072] 对超声后的混合液采用碳酸氨钢一碳酸钢缓冲液进行调PH值处理，并将混合混的 最终PH值调至7.2，W得到符合要求的碳纳米球粒制剂。
[0073] 实施例5:制备0.1 %的碳纳米球粒制剂。
[0074] 根据0.2 %的浓度要求，取定量的碳纳米球粒和去离子水混合分散，并揽拌10分 钟，其中揽拌速度为60r/min。
[0075] 对揽拌后的混合液进行超声处理，其中超声全程时间设为15分钟，单次超声时间 设为3秒，间隙时间设为3秒，超声强度设为80w(低溫水浴下超声）。
[0076] 对超声后的混合液采用碳酸氨钢一碳酸钢缓冲液进行调PH值处理，并将混合混的 最终PH值调至7.1，W得到符合要求的碳纳米球粒制剂。
[0077] 作为碳纳米球粒制剂抗幽口螺杆菌感染的实验方法的【具体实施方式】，包括W下步 骤：
[007引I、通过体外快速尿素酶实验检测碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌尿素酶的抑制率；
[0079] Π 、利用透射电镜观察碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌的直接损伤作用；
[0080] 虹、根据步骤I和步骤Π 的结果分析确定碳纳米球粒制剂抗幽口螺杆菌感染的最 终结果。
[0081] 实施例6:通过体外快速尿素酶实验检测碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌尿素酶的 抑制率。
[0082] 制备及稀释样本：用生理盐水将Helicobacter pylori SS1菌液109CFU/ml(0D578 =0.6)稀释1000倍至106C即/ml,备用;将浓度分别为！.0%、0.5%、0.4%的Ξ种碳纳米球 粒制剂用去离子水稀释100倍，备用，稀释后的Ξ种碳纳米球粒制剂的浓度分别为lOOug/ ml、50ug/ml、40ug/ml (用去离子水经过100倍的稀释后样本呈PH中性）；将尿素酶抑制剂乙 酷氧目亏酸先用去离子水溶解成1.0%，然后再用去离子水稀释100倍，备用;稀释后的尿素酶 抑制剂乙酷氧目亏酸浓度为lOOug/ml;取去离子水，备用；其中，尿素酶抑制剂乙酷氧目亏酸作 为阳性对照，去离子水作为阴性对照。
[008；3]上样:在96孔板的孔中加入lOul的106C即/ml菌液，复立孔;加完后，按照分组分别 迅速加入100ug/ml、50ug/ml、40ug/mlS种碳纳米球粒制剂、去离子水、lOOug/ml乙酷氧月亏 酸各90ul。
[0084] 解育:上样后采用封口膜密封96孔板，并在4°C的恒溫箱中解育24小时。
[0085] 显色:解育完后，在相应的孔中加入50ul的尿素试剂，并放于37°C的恒溫箱中解育 30分种显色。
[0086] 读数:解育30分种后，在578nm波长处读数，并记录每组的0D值。
[0087] 计算抑制率:抑制率=【1-(0顿起-0輪)/(0攻顺-〇輪)】乂 100%。
[008引 0D值及抑制率结果如表1
[0089] 表1:碳纳米球粒制剂体外快速尿素酶抑制酶活性实验数据表
[0090]
[0091] 通过表1所列实验结果可知，本发明的抗幽口螺杆菌感染的碳纳米球粒制剂对幽 口螺杆菌尿素酶有明显的抑制作用。
[0092] 实施例7 :通过透射电镜(TEM)观察碳纳米球粒制剂对幽口螺杆菌的直接损伤作 用。
[0093] 菌液制备：用生理盐水将幽口螺杆菌NTCC11637菌液109CFU/ml(0D578 = 0.6)稀释 10 倍至l〇8CFU/ml，备用。
[0094] 上样:取12只1ml试管，在每管中加入360ul 108CFU/ml的幽口螺杆菌NTCC11637菌 液，复Ξ孔；加完后，按照分组分别迅速加入0.4%、0.1 %的碳纳米球粒制剂、去离子水、 0.1%克拉霉素各40ul，并混匀;其中，去离子水作为阴性对照，克拉霉素作为阳性对照。 [00%]反应:上样后采用封口膜密封孔板，先在37°C的恒溫摇床摇菌培养10分种，然后取 出并迅速放入37 °C的恒溫箱中培养30分种。
[0096] 染色:取lOOul反应液置于透射电镜铜网上，并用1.0%憐鹤酸负染色。
[0097] 观察:在透射电镜(TEM)下观察幽口螺杆菌的形态特点，并判断碳纳米球粒制剂对 幽口螺杆菌直接损伤结果。
[009引透射电镜(TEM)下，各组实验结果如图1至图4所示：
[0099] 400ug/ml高剂量碳纳米球粒制剂组图1所示:幽口螺杆菌未见鞭毛、胞壁胞膜变薄 不完整，细菌轮廓模糊，结构不清。
[0100] lOOug/ml低剂量碳纳米球粒制剂组图2所示:幽口螺杆菌鞭毛减少，胞壁胞膜不完 整。
[0101] lOOug/ml克拉霉素组图3所示：幽口螺杆菌胞壁胞膜变薄不完整，鞭毛减少或消 失。
[0102] 去离子水组图4所示:幽口螺杆菌鞭毛丰富，胞壁胞膜完整，细菌轮廓清楚，菌体正 常。
[0103] 由此可知，碳纳米球粒制剂CNS对幽口螺杆菌有直接损伤作用。
[0104] W上实施例仅是对本发明优选实施方式进行的描述，并非对本发明请求保护范围 进行的限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域工程技术人员依据本发明的技术 方案做出的各种形式的变形，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种碳纳米球粒制剂，其特征在于，所述碳纳米球粒制剂由碳纳米球粒和分散液混 合构成，碳纳米球粒制剂的浓度为0.1%~1.0%，其中，分散液为去离子水，95 %以上的碳 纳米球粒的粒径为5~30nm。2. 按照权利要求1所述的一种碳纳米球粒制剂，其特征在于，所述碳纳米球粒制剂的PH 值为7.1~7.6。3. 按照权利要求2所述的一种碳纳米球粒制剂，其特征在于，所述碳纳米球粒的粒径频 数百分比为:粒径为5~10nm的碳纳米球粒占20~30 %，粒径为10~15nm的碳纳米球粒占25 ~35 %，粒径为15~20nm的碳纳米球粒占15~25 %，粒径为20~25nm的碳纳米球粒占6~ 10%，粒径为25~30nm的碳纳米球粒占1~7%。4. 一种权利要求2所述碳纳米球粒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 一、 以石墨稀为原始材料加工制备碳纳米球粒； 二、 利用透射电镜筛选粒径符合要求的碳纳米球粒，其中，粒径为5~30nm的碳纳米球 粒占95 %以上;碳纳米球粒呈单个球形分散； 三、 根据浓度要求，分别称取经步骤二筛选后的碳纳米球粒和量取去离子水，备用； 四、 将步骤三得到的碳纳米球粒和去离子水混合分散； 五、 对经步骤四混合得到的混合液进行搅拌处理，其中，搅拌时间为10~20分钟，搅拌 速度为60~80r/min; 六、 对经步骤五搅拌处理后的混合液进行超声处理，其中，超声时间为15~20分钟，超 声强度为80~100w; 七、 利用碳酸氢钠一碳酸钠缓冲液对经步骤六超声处理后的混合液进行调整PH值处 理，将混合液的PH值调整为7.1~7.6，得到最终的碳纳米球粒制剂。5. 按照权利要求4所述的一种碳纳米球粒制剂的制备方法，其特征在于，在步骤二中所 述粒径为5~30nm的碳纳米球粒占95%以上，其中，碳纳米球粒的粒径频数百分比为:粒径 为5~10nm的碳纳米球粒占20~30%，粒径为10~15nm的碳纳米球粒占25~35%，粒径为15 ~20nm的碳纳米球粒占15~25%，粒径为20~25nm的碳纳米球粒占6~10%，粒径为25~ 30nm的碳纳米球粒占1~7%。6. 按照权利要求4所述的一种碳纳米球粒制剂的制备方法，其特征在于，在步骤六中所 述对经步骤五搅拌处理后的混合液进行超声处理，是在低温水浴下进行超声处理的。7. 按照权利要求4所述的一种碳纳米球粒制剂的制备方法，其特征在于，在步骤六中所 述超声时间为15~20分钟，是指超声全程时间为15~20分钟，其中，单次超声时间为3秒，间 隙时间为3秒。8. -种权利要求3所述碳纳米球粒制剂抗幽门螺杆菌感染的实验方法，其特征在于，包 括以下步骤： l、 通过体外快速尿素酶实验检测碳纳米球粒制剂对幽门螺杆菌尿素酶的抑制率； Π 、利用透射电镜观察碳纳米球粒制剂对幽门螺杆菌的直接损伤作用； m、 根据步骤I和步骤π的结果分析确定碳纳米球粒制剂抗幽门螺杆菌感染的特性。9. 按照权利要求8所述的一种碳纳米球粒制剂抗幽门螺杆菌感染的实验方法，其特征 在于，在步骤I中所述通过体外快速尿素酶实验检测碳纳米球粒制剂对幽门螺杆菌尿素酶 的抑制率，包括以下步骤： a、 制备及稀释样本：用生理盐水将Helicobacter pylori SS1菌液109CFU/ml稀释1000 倍至106CFU/ml，备用;将浓度分别为1.0%、0.5%、0.4%的三种碳纳米球粒制剂用去离子 水稀释100倍，备用，稀释后的三种碳纳米球粒制剂的浓度分别为100ug/ml、50ug/ml、40ug/ ml;将尿素酶抑制剂乙酰氧肟酸先用去离子水溶解成1%，然后再用去离子水稀释100倍，备 用;稀释后的尿素酶抑制剂乙酰氧肟酸浓度为l〇〇ug/ml;取去离子水，备用;其中，尿素酶抑 制剂乙酰氧肟酸作为阳性对照，去离子水作为阴性对照； b、 上样:在96孔板的孔中加入10ul的106CFU/ml菌液，复三孔;加完后，按照分组分别迅 速加入1〇〇耶/1111、5〇耶/1111、4〇耶/1111三种碳纳米球粒制剂、去离子水、1〇〇1^/1111乙酰氧0亏酸 各90ul; c、 孵育:上样后采用封口膜密封96孔板，并在4 °C的恒温箱中孵育24小时； d、 显色:孵育完后，在相应的孔中加入50ul的尿素试剂，并放于37°C的恒温箱中孵育30 分种显色； e、 读数:孵育30分种后，在578nm波长处读数，并记录每组的0D值； f、 计算抑制率:抑制率=【l-(〇Dm〇D33a)/(OD*^-〇Dsa)】X 100%。10.按照权利要求8所述的一种碳纳米球粒制剂抗幽门螺杆菌感染的实验方法，其特征 在于，在步骤Π 中所述利用透射电镜观察碳纳米球粒制剂对幽门螺杆菌的直接损伤作用， 包括以下步骤： g、 菌液制备：用生理盐水将幽门螺杆菌NTCC11637菌液109CFU/ml稀释10倍至108CFU/ ml，备用； h、 上样:取12只lml试管，在每管中加入360ul的108CFU/ml幽门螺杆菌NTCC11637菌液， 复三孔;加完后，按照分组分别迅速加入0.4%、0.1 %的碳纳米球粒制剂、去离子水、0.1% 克拉霉素各40ul，混匀;其中，去离子水作为阴性对照，克拉霉素作为阳性对照； i、 反应:上样后采用封口膜密封孔板，先在37°C的恒温摇床摇菌培养10分种，然后取出 并迅速放入37 °C的恒温箱中培养30分种； j、 染色:取l〇〇ul反应液置于透射电镜铜网上，并用1.0%磷钨酸负染色； k、 观察:在透射电镜下观察幽门螺杆菌的形态特点，并判断碳纳米球粒制剂对幽门螺 杆菌直接损伤结果。
【文档编号】A61P31/04GK105998065SQ201610519621
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】田汉文
【申请人】成都本珍纳米生物科技有限公司