增强过继细胞疗法
【专利说明】増强过继细胞疗法 发明领域
[0001] 本发明涉及生命科学和医药领域。具体地，本发明涉及人类的癌症治疗。更具体 地，本发明涉及单独使用的或与用于癌症的治疗用途和治疗方法的治疗组合物一起使用的 溶瘤腺病毒载体。在一个方面，本发明涉及过继细胞治疗组合物和溶瘤腺病毒载体的分开 给药。此外，本发明涉及都利用溶瘤腺病毒载体的药物试剂盒和药物组合物。
[0002] 发明背景
[0003] 对于癌症治疗，新的治疗方法是不断发展的。过继细胞疗法（ACT)是用于治疗癌 症的有效方法，但也可用于治疗其他疾病，诸如感染和移植物抗宿主疾病。过继细胞转移是 以转移移植物的免疫功能和特征为目标，将体外（ex vivo)生长的细胞（最常见的是免疫 源细胞）被动转移到宿主中。过继细胞转移可以是自体的，如过继T细胞疗法中常见的，或 者是同种异体的，如通常用于治疗感染或移植物抗宿主病的。临床上，这种方法的常见实施 方案包括将免疫促进或致耐受性细胞如淋巴细胞转移至患者，以增强对病毒和癌症的免疫 力，或者促进在自身免疫性疾病如I型糖尿病或类风湿性关节炎的设定中的容忍力。
[0004] 对于癌症治疗，ACT方法是在20世纪80年代由在美国工作的少数小组所构想的， 领导小组之一是在NCI (美国国立癌症研究所）工作的Steven Rosenberg和同事。自体 肿瘤浸润淋巴细胞（TIL)或遗传学上重新定向的外周血单核细胞的过继转移已经用于成 功地治疗患有晚期实体瘤如黑色素瘤的患者以及患有表达CD19的恶性血液病的患者。在 ACT中，最常用的细胞类型是T细胞，有时分类为⑶8+，但其他变型包括⑶4+细胞、NK-细 胞、δ - γ T细胞、调节性T细胞和外周血单核细胞。细胞可以是未修饰的，如在TIL疗法中 的，或是基因修饰的（modified)。有两种常用的方法来实现将T细胞对肿瘤特异性靶标的 基因靶向。一种是具有已知特异性（TCR疗法）和具有匹配的人类白细胞抗原（HLA，被认为 是啮齿类动物中的主要组织相容性复合体）类型的T细胞受体的转移。另一种是用人造分 子（诸如嵌合抗原受体（CAR))的细胞修饰。这种方法不依赖于HLA且相对于靶向分子更 灵活。例如，可以使用单链抗体，且CAR还可以结合共刺激域。然而，CAR细胞的靶标需要 在靶细胞的膜上，而TCR修饰可以利用细胞内靶标。
[0005] 对于ACT发展的第一个十年，重点关注的是TIL。TIL被发现于肿瘤中，表明肿瘤 触发了宿主中的免疫应答。这种所谓的肿瘤免疫原性由肿瘤抗原介导。这些抗原将肿瘤与 健康细胞区分开，从而提供免疫学刺激。
[0006] 例如，US2003194804 A1描述了一种通过利用TIL来增强T细胞对肿瘤细胞的反 应性的方法。在US2003194804 A1中，将T细胞暴露于试剂，并重新引入到患者体内。该试 剂能够降低或防止在T细胞中内源性Notch或Notch配体的表达或相互作用。
[0007] US5126132 A描述了一种治疗癌症的方法，其中，使用有效量的自体TIL和细胞因 子。
[0008] Diaz RM 等人（Cancer Res. 2007 Mar 15 ;67 (6) : 2840-8 (癌症研究 2007 年 3 月 15日；67 (6) :2840-8))描述了通过使用过继T细胞转移疗法结合疱疹性口腔炎病毒的瘤 内病毒疗法来提高肿瘤抗原特异性T细胞的循环水平。Diaz等人在过继T细胞转移疗法中 使用ΟΤΙ细胞，即人工单克隆细胞系。
[0009] 虽然即使在ACT的早期试验中，也有治疗效果突出，甚至治愈的例子，但多数患者 没有受益，并且许多患者出现了严重的副作用。在过继细胞疗法的第一个二十年期间，细胞 转移本身的安全性一般是好的，但显著的毒性甚至死亡率与用于增强治疗的联合治疗（包 括预处理化疗和放疗）和转移后使用的IL-2相关。预处理用于杀死宿主中的抑制细胞如 调节性T细胞和骨髓衍生的抑制剂，以调节肿瘤微环境和为移植物"让出空间"。转移后使 用IL2以减少移植物的无能（anergy)并使之繁殖。
[0010] 关于功效，留下了改进空间。一般而言，保证了细胞疗法的提高的特异性和足够的 肿瘤杀伤能力。具体而言，在现有技术的ACT中，转移细胞无法运输至肿瘤，且即使它们行 进至肿瘤，它们也往往很快变成无能的，或者不能杀死肿瘤细胞或无法繁殖，导致细胞数量 快速下降。此外，癌症经常下调肿瘤细胞中的人类白细胞抗原（HLA)-被认为是动物中的主 要组织相容性复合体，因而导致T细胞不能杀死，因为需要HLA来向T细胞受体呈现肿瘤表 位。
[0011] 本发明提供了利用过继细胞转移进行癌症治疗的有效工具和方法。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明的一个目的是提供克服低效率、不安全且不可预测的癌症疗法的上述问题 的简单方法和工具。更具体地，本发明提供用于细胞疗法的新颖方法和手段。本发明的目 的通过其特征在独立权利要求中所声明的病毒载体、方法和布置（arrangement)实现。本 发明的具体实施方案在从属权利要求中公开。
[0014] 本申请描述了重组病毒载体的构建、与病毒载体有关的方法以及它们在肿瘤细胞 系、动物模型和癌症患者中的用途。
[0015] 本发明是基于以新颖和创造性的方式将编码细胞因子的溶瘤腺病毒载体或腺病 毒载体与过继细胞疗法结合用于癌症治疗的想法。本发明是基于令人惊喜的效果，即，过继 T细胞疗法中的以下改进：i)到肿瘤的转移细胞的聚集（recruitment) ;ii)肿瘤处转移细 胞的繁殖；iii)肿瘤处转移细胞的增强的反应性（图20)。实际上，病毒载体和细胞因子与 过继细胞疗法的所述结合提供了对比可能被假定的更宽的靶标的更有效的结果。与单独的 包含细胞因子转基因的病毒载体或单独的过继细胞转移的效果相比，包含细胞因子转基因 的病毒载体与过继细胞转移的所述结合的效果是协同性的。
[0016] 本发明的另一个目的是提供用于人体中恶性肿瘤的治疗的肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)和转基因（由病毒递送的转基因产生的）白细胞介素-2 (IL-2)的结合。本发明的上 述和各种其他目的和优点通过一种治疗人体中恶性肿瘤的方法来实现，该方法包括：在有 或没有预处理化疗和/或放疗的情况下，对患有癌症的患者施用有效量的TIL和IL-2,以引 起癌症的消退或稳定。
[0017] 本发明涉及治疗受试者中癌症的方法，其中该方法包括对受试者分开施用过继细 胞治疗组合物和编码至少一种细胞因子的溶瘤（=肿瘤而不是正常细胞中的复制能力）腺 病毒载体。
[0018] 本发明还涉及用于癌症治疗的编码至少一种细胞因子的溶瘤腺病毒载体以及分 开的过继细胞治疗组合物。
[0019] 本发明还涉及编码至少一种细胞因子的溶瘤腺病毒载体以及分开的过继细胞治 疗组合物在制备用于治疗受试者中癌症的药物中的用途。
[0020] 本发明还涉及用于提高受试者中过继细胞疗法或T细胞疗法的功效的溶瘤腺病 毒载体。
[0021] 而且，本发明涉及溶瘤腺病毒载体在制备用于提高受试者中T细胞疗法的疗效的 药物中的用途。
[0022] 而且，本发明涉及通过对有需要的受试者施用溶瘤腺病毒载体来提高受试者中过 继细胞疗法或T细胞疗法的功效的方法。
[0023] 本发明还涉及药物试剂盒，其包含过继细胞治疗组合物和编码至少一种细胞因子 的溶瘤腺病毒载体，其中过继细胞治疗组合物被配制在第一剂型（formulation)中，和编 码至少一种细胞因子的溶瘤腺病毒载体被配制在第二剂型中。
[0024] 此外，本发明涉及一种溶瘤腺病毒载体，其包含：
[0025] 1)包含5/3嵌合纤突结（chimeric fiber knob)的血清5型腺病毒（Ad5)核酸骨 架；
[0026] 2)用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子；
[0027] 3)腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失（D24);
[0028] 4)病毒gpl9k和6. 7k阅读框的核酸序列缺失；以及
[0029] 5)E3区中的缺失的gpl9k/6. 7K处的导致病毒E3启动子下转基因表达的复制相 关控制的编码至少一种细胞因子转基因的核酸序列，其中该细胞因子选自：干扰素 α、干 扰素 β、干扰素 γ、补体 C5a、IL-2、TNF(肿瘤坏死因子）a、CD40L、IL12、IL-23、IL15、 IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、 CCL17、CCL18、CCL19、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、 CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5( = RANTES)、CCL6、CCL7、 CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、 CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、 CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7 和 XCL2。
[0030] 此外，本发明涉及一种血清3型（Ad3)溶瘤腺病毒载体，其包含：Ε3区中的缺失和 E3的缺失区处的用于转基因的表达的肿瘤特异性启动子。
[0031] 进而，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的溶瘤载体。
[0032] 而且，本发明涉及一种治疗受试者中癌症的方法，其中该方法包括对有需要的受 试者施用本发明的溶瘤腺病毒载体。而且，本发明涉及用于癌症治疗的本发明的溶瘤腺病 毒载体。
[0033] 而且，本发明涉及本发明的溶瘤腺病毒载体在制备用于治疗受试者中癌症的药物 中的用途。
[0034] 本发明布置的优点是治疗效果增强和副作用降低。预防了严重不良事件，甚至死 亡，因为疗效的增强和我们的方法的抗抑制效果可降低对现有技术方法中用于为转移细胞 "让出空间"和减少肿瘤免疫抑制的预处理化疗和/或辐射的需要。而且，预防了严重不良 事件，甚至死亡，因为如果在肿瘤中复制时病毒产生IL2,则不需要分开加入现有技术方法 中用于在将细胞转移进患者之后繁殖和维持转移细胞的IL2。肿瘤处的局部产生也可以增 强IL-2的受追捧效果（sought-after effects)(移植的刺激和繁殖），同时减少导致不良 事件的全身性暴露。本发明提供了选择性治疗，对健康组织的毒性或损伤更小。
[0035] 而且，本发明通过以下提供了令人惊喜的治疗效果：i)例如通过将包含重组细胞 因子的病毒载体注射进肿瘤中来向肿瘤提供运输（trafficking)信号。病毒注射导致产生 与这种效果（对与病原体相关分子模式识别受体结合的病毒的反应）相关的细胞因子，但 是通过额外产生最相关的细胞因子作为来自病毒的转基因可以实现好得多的效果。ii)通 过增加危险信号减少了耐受性。病毒注射本身可以通过与病原体相关分子模式识别受体结 合实现这一点，但效果可以通过额外产生细胞因子作为来自病毒的转基因来增强。iii)诱 导HLA表达。病毒感染增加了 HLA表达，因为细胞试图呈现用于安装抗病毒T细胞应答的 病毒表位。出乎意料的是，这可以用来增强需要HLA起作用的针对肿瘤抗原表位的T细胞 疗法。病毒对HLA的效果部分地由细胞因子介导；在本发明的一个令人惊喜的实施方案中， 所述由病毒产生细胞因子可以因此也在附近的肿瘤细胞中诱导HLA表达。iv)通过解除由 病毒本身的存在（再次通过病原体相关分子模式识别受体）介导的但通过产生细胞因子增 强的免疫抑制来诱导细胞的繁殖（图48)。因此，这种方法可以解决目前阻碍自适应细胞疗 法的关键障碍。
[0036] 附图简要说明
[0037] 下面将借助于具体实施方案并参照附图更详细地描述本发明，附图中：
[0038] 图1示出用Ad5/3嵌合溶瘤腺病毒处理增加了 B16-0VA肿瘤中的细胞因子和趋化 因子分泌。干扰素 γ可以上调HLA( = MHC) I类的表达，从而生成可以由TIL有效地识别 的肿瘤细胞表型。可促进TIL活化和增殖的免疫细胞聚集中涉及各种IFN-γ诱导趋化因 子（如RANTES、MIP-la和MCP-1)。而且，TIL的运输可以通过这些趋化因子的上调而得到 增强。
[0039] 图2示出了在有或没有过继细胞转移情况下多次注射5/3嵌合溶瘤腺病毒后的肿 瘤生长控制。相较于PBS治疗，单独使用腺病毒处理（A)对B16-0VA肿瘤生长的影响很小。 500000(B)或2000000(C)个肿瘤特异性0Τ-Ι淋巴细胞的过继转移与病毒注射联用导致显 著的肿瘤生长控制。单独使用腺病毒或0Τ-Ι细胞与PBS联用对肿瘤生长的较差治疗效果 突出了用作单一试剂的溶瘤腺病毒和过继细胞转移疗法的主要缺点，支持本发明的目的， 以使用腺病毒增强过继细胞疗法的功效。
[0040] 图3示出腺病毒注射诱导T细胞运输进肿瘤和增加肿瘤中过继转移T细胞的增 殖。A)在治疗后第1天引流Ad治疗小鼠的淋巴结和脾，据称由于淋巴细胞运输，过继转 移CD8+CFSE+细胞的量在肿瘤中增加和在血液中减少。在整个实验中，整体CD8+T细胞计 数在腺病毒处理的肿瘤中保持很高，表明这些细胞对有害肿瘤微环境的抗性和/或增加的 CD8+T细胞增殖。B)相较于PBS组，在第6和14天，在Ad治疗的肿瘤中0Τ-Ι细胞增殖增 强，被视为已经经过细胞分裂的细胞（移向M7)比PBS组中的细胞占据更大的比例。因此， 用溶瘤腺病毒处理诱导了过继转移TIL的运输和增殖。C)关于如何进行CFSE阳性细胞的 设门（gating)的实例已完成。M0表示还没有分裂的细胞，M7表示已分裂的足以将CFSE稀 释到可检测极限以下（7倍以上）的细胞。
[0041] 图4揭示了在箭头指示的天数来自用溶瘤腺病毒治疗的人的数据。病毒注射到肿 瘤中导致血液中的淋巴细胞减少，反映了它们到肿瘤的运输。
[0042] 图5揭示了溶瘤腺病毒注射到人癌症患者的肿瘤中引起CD8+T细胞的流通 (influx)的数据。溶瘤腺病毒的瘤内注射引起肿瘤处CD8+T细胞的积聚，其在治疗前和治 疗后由针活检评估。
[0043] 图6示出了与T细胞的过继转移联用的腺病毒注射的结果。用5 X ΙΟ5 0T1淋巴细 胞对患有皮下B16-〇va肿瘤的小鼠进行腹腔内（intraperitoneally)过继转移并且不处理 肿瘤，或者用PBS或Ad5/3注射（参见实施例材料和方法）。在类似于人黑色素瘤的免疫抑 制B16_0va模型中，抗Ova 0T1细胞的过继转移很少。添加病毒注射显著提高了疗效（a)。 ⑶8+T细胞增加（b)。这些细胞不是抗Ova T细胞（c)。
[0044] 图7揭示了由于过继转移和病毒注射而使"天然"抗肿瘤T细胞的数量的急剧增 加。对患有皮下B16-〇va肿瘤的小鼠腹腔内过继转移5X 105 0T1淋巴细胞并且不处理肿 瘤，或者用PBS或Ad5/3注射（参见实施例材料和方法）。过继转移+病毒注射行为起到用 于肿瘤和局部淋巴结处"其他"T细胞的繁殖的催化剂作用。（a)肿瘤部位处的Trp2 CD8+ 细胞。（b)肿瘤部位处的抗gp100 CD8+细胞。
[0045] 图8示出了第14天时肿瘤中的活化⑶8+细胞和肿瘤中的??Μ-3表达。对患有皮 下B16-〇va肿瘤的小鼠腹腔内过继转移5X ΙΟ5 0T1淋巴细胞并且不处理肿瘤，或者用PBS 或Ad5/3注射（参见实施例材料和方法）。免疫治疗中的免疫抑制：如果未解除免疫抑制， 则T细胞数量的增加不足。在病毒处理的肿瘤中有更多的活化T细胞和较少的免疫抑制。
[0046] 图9示出了抗肿瘤T细胞的增加和免疫抑制的减少导致针对肿瘤抗原的全身免疫 性。对患有皮下B16-〇va肿瘤的小鼠腹腔内过继转移5X105 OTl(a)或2X106(b)0Tl淋巴 细胞并且不处理肿瘤，或者用PBS或Ad5/3注射（参见实施例材料和方法）。通过病毒增强 抗原递呈：T细胞工作更好。抵抗几种肿瘤抗原表位的全身免疫导致：(a)第14天时肿瘤中 树突状细胞（⑶llc+⑶80+⑶86+)上共刺激分子的表达；(b)第14天时具有脾细胞的IFNg ELISPOT。
[0047] 图10示出了病毒注射后的ΟΤΙ T细胞的分布：具有运输趋势，但不足以解释疗效。 (a)图表，（b)动物模型，（c)肿瘤。
[0048] 图11揭示了解除免疫抑制可诱导细胞的繁殖。腺病毒处理的肿瘤含有更多的肿 瘤特异性淋巴细胞（0Τ-Ι细胞）。在PBS处理的肿瘤中，0ΤΙ细胞己滞留在M5阶段（左箭 头），而在Ad组中，它们继续增殖（右箭头）。
[0049] 图12示出了与0T1细胞联用的重组细胞因子（无病毒）的功效。
[0050] 图13示出了与过继T细胞转移联用的武装有细胞因子的腺病毒的抗肿瘤功效。 在第1天，用富集有1.5X10e6⑶8+的0T-1 T细胞对承受皮下B16-0VA黑素瘤肿瘤的 C57BL/6小鼠进行腹腔内治疗。在第1天及此后每周将细胞因子编码的腺病毒或对照病 毒Ad5-Lucl进行瘤内注射（每个肿瘤1 X 10e9病毒颗粒）。按之前所描述的计算肿瘤体 积（Bramante 等，Serotype chimeric oncolytic adenovirus coding for GM-CSF for treatment of sarcoma in rodents and humans (编码用于治疗嗤齿动物和人类中肉瘤的 GM-CSF的血清型嵌合溶瘤腺病毒），Int J Cancer (国际癌症杂志），2013年12月24日）， 且肿瘤大小被表示为相对于设定为100%的第1天的百分比。风险图中的数量：在给定时 间点各实验组中剩余的动物的数量。当肿瘤已经超过最大可接受大小时，或者当疼痛或痛 苦的任何迹象很明显时，将动物人道处死。
[0051] 图14示出了不同病毒对肿瘤大小的影响。
[0052] 图15示出了与ΟΤΙ T细胞联用的包含mTNFa转基因的腺病毒载体对减小肿瘤大 小的优异结果。
[0053] 图16示出了与ΟΤΙ T细胞联用的包含mIL3转基因的腺病毒载体对减小肿瘤大小 的优异结果。
[0054] 图17示出了表达C5a或TNF-α的溶瘤腺病毒的示意图。示出了病毒的一些重要 特征，包括插入转基因的位点。
[0055] 图18示出了由A549细胞中溶瘤腺病毒进行的TNF- a表达。用10 VP/细胞感染 细胞，在指定时间点收集培养基，并使用ELISA来评估培养基中TNF-a的量。病毒诱导来 自感染细胞的TNF- a的表达和分泌。
[0056] 图19示出了由溶瘤TNF- a武装的溶瘤腺病毒产生的TNF- a的生物活性。在该 试验中，使用来自感染细胞的上清液来挑战TNF敏感型WEHI