专利名称：A－nk细胞分离培养方法
技术领域：
本发明涉及医学肿瘤生物治疗学方法技术背景A-NK细胞(adherent natural killer cell)又称A-LAK(adherent Lymphokin Activitate killer cell)细胞，基于其体外增殖和抗肿瘤能力强，对正常细胞无杀伤作用等优点，成为近年来肿瘤过继免疫疗法的研究热点之一。在临床应用中，目前常用于细胞培养的完全培养基，因含有人AB血清，虽经各种病毒的检测，但仍有可能传播其他疾病，安全性低，并且存在批间差异，不宜质控，价格也很昂贵。近几年面世的无血清培养基则可达到生物洁净要求，成分明确，质量稳定，便于质控，克服了添加人AB血清的缺点，对于免疫治疗的推广应用有重要意义。本发明力求找到一种新的方法，即不减少A-NK细胞的数量和活性，又能增加其临床应用的安全性。
以往A-NK细胞的分离方法是首先需要通过常规的实验方法获得外周血单个核细胞(PBMC)，然后过尼龙毛柱以去除单核细胞，将收集的细胞用负免疫选择技术纯化出NK细胞，即加CD3、CD5、CD19和CD14单克隆抗体包被的磁珠，用磁板吸附结合于磁珠的T细胞、B细胞和单核细胞，未吸附细胞即为纯化的NK细胞。将纯化的NK细胞与22nM(6000IU/ml)IL-2培养获得粘附在瓶壁的A-NK细胞。此方法耗资、耗力、耗时，容易污染，不利于临床治疗的开展。
长久以来科学家们一直认为，只有IL-2能诱导产生A-NK细胞并增强或维持细胞的增殖能力和杀伤活性。但近年来，由于多种细胞因子的产品问世以及它的多种免疫生物学活性，它们在肿瘤免疫学方面的功能正受到愈来愈多的重视与关注。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题和缺陷，提供一种A-NK细胞分离培养方法，达到省力、省时，减少费用，减少污染，利于临床治疗的开展。
在临床试验中，为进一步简便、快速、大量的制备A-NK细胞，需要在方法上进行改进。常规分离制备A-NK用尼龙毛法去除单核巨噬细胞，以避免其对A-NK的增殖和细胞毒的抑制作用。本发明的基本设计是用苯丙氨酸甲酯(PME)可有效去除单核巨噬细胞而不改变淋巴细胞的表型和细胞毒性.具体方法是取健康人外周血，肝素抗凝，用PBS二倍稀释后，用人淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，2000转/分，20分钟，吸取中界面层的单个核细胞用PBS洗涤三次。然后，置于塑料管中用PME(5mmol/L)室温处理40分钟(5×106/ml)，以去除B细胞和单核巨噬细胞，将PME处理过的已去除单核巨噬细胞的PBMC调细胞浓度为5×106/ml置于完全培养液中，与22nM(6000IU/ml)IL-2共同培养4-5小时后，收集粘附于塑料培养瓶表面的细胞(即A-NK细胞)进行临床治疗，将收集细胞的时间从传统的24-48小时缩小到3-5小时。这样可以缩短激活A-NK细胞的时间，从而减少临床病人等待输液的时间。是一种简便、快速的制备A-NK的方法。
由于完全培养基中添加血清存在安全性低、不易质控等缺点，无血清培养基则可达到生物洁净要求，成分明确，质量稳定，便于质控，得到越来越广泛的应用。本发明比较了无血清培养基(AIMV)与完全培养基(RPMI-1640培养液，10％人AB血清)对A-NK/IL-2的支持作用。我们的研究结果表明，无血清培养基可替代含血清的完全培养基，二者所得培养物的数目和功能相当。发展无血清培养基用于A-NK细胞的临床生物治疗，即不减少A-NK细胞的数量和活性，又能增加其临床应用的安全性。
白细胞介素2(IL-2)是A-NK细胞活化和维持其细胞活性必不可少的细胞因子，但临床治疗时大量IL-2进入体内会引起发热、寒战、食欲不振、休克、毛细血管渗漏综合症等毒、副作用，因此适当减少IL-2使用剂量，保持免疫细胞应有活性一直是亟待解决的课题。
我们探讨了IL-12对于A-NK/IL-2治疗的辅助作用，力求找到一种新的方法。结果证明，IL-12同样也能刺激A-NK细胞大量增殖，并能增强它的杀瘤能力，而且我们联合应用IL-12激活A-NK细胞，还可同时降低IL-2和IL-12的使用剂量，从而减少两者的毒、副作用。
A-NK细胞杀伤肿瘤的形态学特征扫描和透射电镜下均可见A-NK细胞在靶细胞表面及周围形成花环，部分细胞变形，形成的突起或微绒毛伸向靶细胞，呈点状或斑状接触。透射电镜下可见肿瘤细胞呈现溶解坏死(necrosis)和凋零坏死(apoptosis)。部分靶细胞内浆网肿胀，线粒体内外膜分离，胞质中出现空泡变性，核染色质破碎，核膜、质膜断裂，最终细胞崩解，为典型的溶解坏死征象。而另一些肿瘤细胞核染色质固缩、偏移，形成致密的月牙槽形状聚集在核膜内侧面，基质水肿变性，胞膜肿胀呈泡状结构，核膜、质膜完整，可见典型的凋零小体。提示A-NK细胞进入动物或人体内，通过移行聚集在癌肿部位，与肿瘤细胞建立直接接触，从而发挥它的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。A-NK细胞还能顺利地通过血管内皮基底膜，浸润到实体瘤组织内部的能力也强于其它免疫细胞。
图1是A-NK细胞伸出粗长的伪足，细胞表面不光滑，有质膜皱襞。(扫描电镜、透射电镜)图2是A-NK细胞与K562肿瘤细胞(呈圆形)紧密相贴，靶细胞膜肿胀，呈泡状。(扫描电镜、透射电镜)图3是A-NK细胞伸出长伪足和突起，插向Anip973肿瘤细胞(呈梭形)，并与之紧紧相连。(扫描电镜、透射电镜)图4是A-NK细胞向靶细胞聚集、粘附、形成花环，以突起或伪足与靶细胞微绒毛呈点状或斑状接触，靶细胞出现溶解坏死征象，细胞内空泡变性，线粒体嵴变性。(扫描电镜、透射电镜)图5是A-NK细胞围绕靶细胞，靶细胞核染色质破碎，核膜质膜破裂，最终细胞溶解坏死(扫描电镜、透射电镜)。
图6是A-NK细胞以胞体与靶细胞形成大面积对合，两者相对处膜呈波浪状，其间有许多点状接触。靶细胞呈溶解坏死征象，细胞内浆网肿胀，线粒体内外膜分离，胞质中出现空泡变性。(扫描电镜、透射电镜)图7是呈现溶解坏死征象的肿瘤细胞，可见细胞内浆网肿胀，线粒体内外膜分离，胞质中出现空泡变性，核染色质破碎。(扫描电镜、透射电镜)图8是呈现凋亡早期征象的肿瘤细胞，可见核染色质固缩、偏移，形成致密的月牙槽形状聚集在核膜内侧面，基质水肿变性，但核膜质膜完整。(扫描电镜、透射电镜)图9是单独应用IL-2培养72小时A-NK细胞增殖状态。(倒置显微镜)图10是联合应用IL-2和IL-12培养72小时A-NK细胞增殖状态。(倒置显微镜)具体实施方式
一、主要试剂和培养液1、重组人白细胞介素2(recombined human interleukin-2，rhIL-2)南京军区军事医学研究所产品(10万IU/2ml)2、重组人白细胞介素12(IL-12)3、淋巴细胞分离液Sigma公司产品4、苯丙胺酸甲酯(phenylalanine methyl ester，PME)Sigma公司产品5 MTT(methyl thiazolyldipheny telrazolium bromide)Sigma公司产品6、完全培养液(CM)采用RPMI-1640完全培养液培养，其组成为90％RPMI-1640培养液(Gibco产品)，10％人AB血清(哈尔滨红十字中心血站提供，用于人A-NK细胞培养)或10％灭活的胎牛血清(中国医学科学院血液学研究所，用于肿瘤细胞培养)，2mM谷氨酰胺，10mMHEPES，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
7、无血清培养液(AIMV)Gibco公司产品培养条件为37℃，5％CO2饱和湿化空气的培养箱中建立培养。所用培养瓶和培养板均为美国Costar产品。酶标仪为BioRAU，450型，美国制造。
二、肿瘤细胞1、人肺腺癌细胞Anip973，NK非敏感细胞系。
2、人红白血病细胞K562，NK敏感细胞系。
三.人外周血单个核细胞的制备取健康人外周血，肝素抗凝，用PBS二倍稀释后，用人淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，2000转/分，20分钟，吸取中界面层的单个核细胞用PBS洗涤三次。然后，置于塑料管中用PME(5mmol/L)室温处理40分钟(5×106/ml)，以去除B细胞和单核巨噬细胞，再用PBS洗涤三次备用。
四.A-NK细胞的诱导用PME处理后的人外周血单个核细胞分别重悬于以下培养液中实验一；甲组RPMI-1640培养液，10％人AB血清，IL-2(6000IU/ml)；乙组RPMI-1640培养液，10％人AB血清，IL-2(1000IU/ml)，IL-12(5ng/ml)。
实验二A组AIMV，IL-2(6000IU/ml)；B组AIMV，IL-2(1000IU/ml)，IL-12(5ng/ml)；C组RPMI-1640培养液，10％人AB血清，IL-2(6000IU/ml)；D组RPMI-1640培养液，10％人AB血清，IL-2(1000IU/ml)，IL-12(5ng/ml)。
分别调成细胞浓度为5×106/ml置于塑料培养瓶中，于37℃，5％CO2饱和湿化空气的培养箱中水平培养4-5小时，移去含未粘附塑料表面的细胞悬液(此即NA-NK细胞)，收集粘附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞)，分别重悬于各自含50％自体条件培养基的培养液中，调成细胞浓度为2×106/ml。A-NK细胞的四个实验组按要求分别补加各组培养液成分。NA-NK细胞只保留两组，即E组AIMV+IL-2(1000IU/ml)和F组RPMI-1640培养液+10％人AB血清+IL-2(1000IU/ml)。继续培养，每3天补充新鲜培养液和IL-2或IL-12，细胞浓度和细胞因子终浓度不变。
五、细胞增殖活性的测定采用改进的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法。于培养的第1，4，7，10和第14天分别取细胞，充分洗涤，以1×106/ml浓度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，设3个复孔，培养箱中培养48小时后，每孔加MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4小时，然后翻板，每孔滴加100μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振荡10分钟后在酶标仪上570nm处测定吸光度(OD值)，取3孔均值，OD值高则增殖快。
六、体外细胞毒作用的检测采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定。将靶细胞Anip973和K562肿瘤细胞用完全培养液洗涤三次，用1×104/ml肿瘤细胞悬液100μl/孔加入96孔平底培养板中，按100∶1的效靶比例每孔再加入100μl浓度为1×106/ml的效应细胞(A-NK或NA-NK)，设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔(E+T)，效应细胞对照孔(E)和靶细胞对照孔(T)，每组设3个复孔。37℃ 5％CO2培养箱中培养48小时后，每孔加MTT(5mg/ml)20μl，37℃ 5％CO2培养箱中再培养4小时，然后翻板，每孔滴加100μl二甲基亚砜(DMSO)轻轻振荡10分钟后在酶标仪上570nm处测定吸光度(OD值)，取三孔均值，公式如下细胞杀伤活性(％)＝[1-(ODE+T-ODE)/ODT]×100
权利要求
一种A-NK细胞分离培养方法，其特征在于培养过程中在A-NK细胞分离方法的改进中用苯丙氨酸甲酯(PME)可有效去除单核巨噬细胞而不改变淋巴细胞的表型和细胞毒性。具体方法是取健康人外周血，肝素抗凝，用PBS二倍稀释后，用人淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，2000转/分，20分钟，吸取中界面层的单个核细胞用PBS洗涤三次。然后，置于塑料管中用PME(5mmol/L)室温处理40分钟(5×106/ml)，以去除B细胞和单核巨噬细胞，将PME处理过的已去除单核巨噬细胞的PBMC调细胞浓度为5×106/ml置于完全培养液中，与22nM(6000IU/ml)IL-2共同培养4-5小时后，收集粘附于塑料培养瓶表面的细胞(即A-NK细胞)进行临床治疗，将收集细胞的时间从传统的24-48小时缩小到3-5小时；在A-NK细胞培养方法的改进中，无血清培养基可替代含血清的完全培养基，二者所得培养物的数目和功能相当。发展无血清培养基用于A-NK细胞的临床生物治疗，即不减少A-NK细胞的数量和活性，又能增加其临床应用的安全性；IL-4可联合IL-2对A-NK细胞的生长有较强的刺激或成熟作用；IL-2和IL-12联合应用可提高活化免疫细胞的杀伤活性。
全文摘要
A－NK细胞分离培养方法是一种医学肿瘤生物治疗学的方法。用如下方法对A－NK细胞分离培养进行了改进。用苯丙氨酸甲酯(PME)去除单核巨噬细胞而不改变淋巴细胞的表型和细胞毒性；在A－NK细胞培养方法的改进中，无血清培养基可替代含血清的完全培养基，二者所得培养物的数目和功能相当，发展无血清培养基用于A－NK细胞的临床生物治疗，即不减少A－NK细胞的数量和活性，又能增加其临床应用的安全性；IL－4可联合IL－2对A－NK细胞的生长有较强的刺激或成熟作用；IL－2和IL－12联合应用可提高活化免疫细胞的杀伤活性。
文档编号C12N5/08GK1706938SQ20041004361
公开日2005年12月14日 申请日期2004年6月9日 优先权日2004年6月9日
发明者王志华 申请人:哈尔滨医科大学肿瘤病防治研究所