一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法，采用组织块贴壁法分离出羊膜间充质干细胞并传代培养，对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察，用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子和阴性分子并采用六孔板法检测细胞增殖情况,本实验从胎盘羊膜组织中分离出细胞是hAMSCs，为进一步研究hAMSCs的生物学和免疫学特性、分化能力、核型稳定性，以及将其作为临床应用的种子细胞等提供了基础。
【专利说明】
一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法，属于医疗检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]胎盘是由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官，除含有滋养细胞外，还含有大量血管及间充质成分；胎盘间充质干细胞是近年来新发现的从胎盘获取的一类干细胞，与从脐带血或骨髓中提取的干细胞相比较，不但干细胞数量多而且可分化成多种类的组织细胞，而且胎盘组织来源于产后，其收取过程对母体和新生儿不造成任何损伤，不受伦理学和临床医学的限制，此外，研究人员从细胞表面抗原分析发现，胎盘间充质干细胞是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，由于其低免疫原性，不易被受体的免疫系统排斥，是理想的干细胞保存和利用的资源胎盘的构造主要有3层(羊膜)绒毛膜和蜕膜，绒毛膜和蜕膜则富含血管和红细胞，不易分离，羊膜是一层易于分离，且结构简单的组织％如能从羊膜上分离出间充质干细胞，将是间充质干细胞的一个良好供体，为研究者提供一个获得间充质干细胞的简便途径。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法，能从从体外成功分离培养出人羊膜间充质干细胞，以克服现有技术的不足。
[0004]本发明的技术方案
一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法，采用组织块贴壁法分离出羊膜间充质干细胞并传代培养，对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察，用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子和阴性分子并采用六孔板法检测细胞增殖情况。
[0005]由于采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明通过将羊膜组织块贴附在培养瓶上进行培养7-10d后从组织块周围生长出细胞，形态多样，但以长梭形为主，传代后生长迅速，呈流水状生长，3-6d达生长高峰，这与骨髓MSCs的生长特性一致；传代至第3代，通过流式检测细胞膜表面分子，结果显示(细胞高表达⑶44、⑶105、⑶73HE⑶90，其表型特征与骨髓MSCs相似；说明本实验从胎盘羊膜组织中分离出细胞是hAMSCs，为进一步研究hAMSCs的生物学和免疫学特性、分化能力、核型稳定性，以及将其作为临床应用的种子细胞等提供了基础。
【具体实施方式】
[0006]下面对本发明作进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
[0007]本发明的实施例:
I材料与方法
1.1 标本来源胎盘取自健康足月新生儿剖宫产手术后，经家属知情同意并签署《胎盘处理协议书》后捐献所得。
[0008]1.2主要材料与仪器 1.2.1主要材料
透气式细胞培养瓶(NEST)、无菌刻度吸管、六孔板、离心管、巴士得吸管、眼科剪、眼科镊、手术剪、青霉素小瓶等。
[0009]1.2.2主要试剂
细胞培养液为L-DMEM加10%FBS、0.25%胰蛋白酶、5.5%NaHC03、青-链酶素混合液等。
[0010]1.2.3主要仪器设备
超净工作台(苏州净化)C02细胞培养箱、流式细胞仪、倒置显微镜、低温冷冻离心机、正置显微镜等。
[0011]1.3 方法
1.3.1 hAMSCs分离培养
无菌条件下将靠近脐带处的胎盘剪下，小心剥离羊膜，并用无菌生理盐水(NS)清洗数次直至液体清亮，将其转移至青霉素小瓶中用眼科剪剪成约l_2cm大小，用眼科镊夹取并平铺于25cm2细胞培养瓶中，沿培养瓶壁小心加入培养液，使培养液既能覆盖羊膜组织块，又不至于使其漂浮起来，最后将培养瓶置于37度5%C02培养箱中培养。
[0012]1.3.2 hAMSCs 传代培养
当见组织块周围有细胞生长后，每2d换液I次，当细胞呈片状生长时，可用无菌PSB洗去羊膜组织块；此后，隔日换液I次，细胞长成单层时即可传代；传代时用无菌PSB液先洗；遍后，以去除残留的培养液，然后用0.25%胰蛋白酶溶液(约1.5ml)于37度消化约3min,培养液中止消化，用巴士德吸管小心吹打细胞使其从培养瓶上脱落，转移至15min离心管中，800r/min离心3min，弃上清，沉淀用培养液重悬，平均分配至2个培养瓶中，置于37度5%C02培养箱中培养，次日换液。
[0013]1.3.3 hAMSCs 表型鉴定
将分离传代至P3代的细胞，按照流式检测试剂盒使用说明和步骤操作，用流式细胞仪检测细胞膜表面分子，检测的阳性分子包括⑶73-AP、⑶90-FITC、⑶105_Cy5.5和阴性分子包括 CDllb-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE0
[0014]1.3.4 hAMSCs 增值实验
采用六孔板法检测细胞增殖情况P3代的细胞接种于六孔板中，每孔细胞数量1*103，置于37度5%C02培养箱中培养，隔日换液I次，待细胞长成单层后每日取，孔细胞进行胎盼蓝染色，用细胞计数板计数活细胞数，并绘制增殖曲线。
[0015]本发明通过将羊膜组织块贴附在培养瓶上进行培养7-10d后从组织块周围生长出细胞，形态多样，但以长梭形为主，传代后生长迅速，呈流水状生长，3-6d达生长高峰，这与骨髓MSCs的生长特性一致；传代至第3代，通过流式检测细胞膜表面分子，结果显示(细胞高表达⑶44、⑶105、⑶73HE⑶90，其表型特征与骨髓MSCs相似；说明本实验从胎盘羊膜组织中分离出细胞是hAMSCs，为进一步研究hAMSCs的生物学和免疫学特性、分化能力、核型稳定性，以及将其作为临床应用的种子细胞等提供了基础。
【权利要求】
1.一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法，其特征在于:采用组织块贴壁法分离出羊膜间充质干细胞并传代培养，对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察，用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子和阴性分子并采用六孔板法检测细胞增殖情况。
【文档编号】C12N5/0775GK104450612SQ201410741509
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】敖云霞 申请人:敖云霞