专利名称：一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化及鉴定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种人羊膜间充质干细胞的分离、纯化及鉴定方法。
背景技术：
人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)发源于胚胎早期的胚外中胚层，具有与骨髓间充质干细胞相似的表型，如表达SSEA-4、0CT-4、 CD29、CD44、CD73、CD90、CD166 及波形蛋白，而不表达 CD34、CD45、CD80、CD86 及 HLA-DR ；具有多系分化潜能，在适宜诱导条件下可分化成肝细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞心肌细胞、、胰岛细胞、神经元样细胞等；具有来源广泛，取材方便、无侵入性伤害、不牵涉医学伦理问题等优势，因此，hAMSCs作为供体细胞资源在再生医学领域具有广泛的应用前景。此外， MSCs还具有免疫调节作用，在器官移植、血液系统疾病和自身免疫性疾病的临床治疗领域显现出优于传统治疗的独特价值。hAMSCs的制备过程涉及hAMSCs的分离、纯化、鉴定、体外培养扩增等技术环节。目前关于hAMSCs的分离、纯化、鉴定尚无统一方案。hAMSCs的分离方法有胰蛋白酶-胶原酶液化、胶原酶-中性蛋白酶、羊膜片贴壁培养分离等方法，酶消化法相对简便，而贴壁培养分离较为烦琐且收率不高。各家在采用胰蛋白酶-胶原酶液化法分离hAMSCs时所用胰蛋白酶和胶原酶的浓度、消化温度、消化时间等条件各不相同，分离效果(收率)存在较大差异， 迄今尚无具有统计学意义的每份人羊膜的hAMSCs收率数据。hAMSCs的纯化方法多采用原始分离样品贴壁培养。hAMSCs的鉴定主要根据其表型特征通过高能量流式细胞术、免疫组织化学染色、免疫荧光检测hAMCs标志物，如⑶14丄拟9、⑶；34、⑶44、、⑶45、⑶90、HLA_DR、 SSEA-4、0CT-4等；少数采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测其相关基因及全能性相关基因表达，如 LEFTYA、Cripto、Sox2、Nanog、0ct-4、ACTG2、ACTA2、MMP2 等。目前不仅缺乏统一的hAMSCs鉴定标准，而且存在诸多问题①受检样品不一致，原代和传代细胞的表型标志不尽相同；②hAMCs与羊膜上皮细胞的阳性标志物有交叉，如⑶44、⑶90、SSEA-4 、0CT-4等，阴性标志物也有交叉如⑶14、⑶34、⑶45、HLA-DR等，单凭这些标志物的检测不能区分hAMCs与羊膜上皮细胞；③有的检测方法如原位免疫组织化学染色和免疫荧光染色不能反映细胞群体的标志特征，有的检测方法如PCR较为繁琐且成本较高。鉴于上述存在的问题，本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞的分离、纯化及鉴定方法，是一种高丰度、高纯度、高活力的分离方法、简便而明确的鉴定指标和适宜的体外扩增培养方案。
发明内容
本发明解决的技术问题是现有技术存在的问题，本发明提供了一种高收率、高纯度、高活力的人羊膜间充质干细胞分离、纯化方法以及简便、准确的人羊膜间充质干细胞鉴定方法。
本发明采用的技术方案为
本发明的人羊膜间充质干细胞的分离，包括以下步骤
第一，无菌采集人足月剖宫产胎盘，机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hank’ s液冲洗数次以清除残留血迹，将羊膜剪成碎片；
第二，羊膜碎片加入含EDTA的胰蛋白酶消化溶液旋转消化10分钟，弃上清；重新加入消化液，旋转消化弃上清，留取未消化的羊膜碎片；
第三，D-Hank’ s液冲洗未消化的羊膜碎片，加入含有DNase I的胶原酶，旋转消化至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，离心，收集细胞沉淀，得到原始的人羊膜间充质干细胞；
第四，将分离的原始的人羊膜间充质干细胞重新悬浮于LG-DMEM培养基(购自Gibco 公司，货号31600-0 )中，将细胞密度接种于6孔培养板，置于CO2培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基；待细胞汇合度达 8(Γ90%后，用胰蛋白酶一EDTA溶液消化，加入培养基终止胰蛋白酶作用，离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1X107/L的细胞密度传代。本发明的人羊膜间充质干细胞的鉴定方法，包括以下步骤
第一，免疫细胞化学染色人羊膜间充质干细胞爬片用PBS缓冲液漂洗，多聚甲醛固定，PBS漂洗，Triton-XlOO作用15 20 min, H2O2灭活内源性过氧化物酶，PBS漂洗，加正常羊血清封闭，滴加波形蛋白抗体或鼠抗人CK19抗体室温孵育，PBS漂洗，滴加鼠兔通用型二抗室温孵育，PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固，光学显微镜下观察，阴性对照组用PBS替代一抗；
第二，流式细胞术分析调整人羊膜间充质干细胞密度为IX 106/ml，每管200 ？ L细胞悬液，共3管，分别加入各20 L荧光标记单抗Q^9-PE+CD44-FITC、CD34-PE+CD45-FITC 和⑶166-PE，混勻，室温避光孵育，每管加2 ml含1 g/L Ni^3的磷酸盐缓冲液，混勻，离心弃上清，振荡悬浮细胞，每管加入10 g/L多聚甲醛300 ？ L，混勻，用流式细胞仪检测，用Cell Quest软件进行采集分析，用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作为同型对照。结合免疫细胞化学染色和流式细胞术分析结果，hAMSCs的鉴定标志为波形蛋白阳性，CK19阴性，CD29, CD44、和CD166均阳性，CD34和CD45均阴性。本发明达到的有益效果
(1)本发明人羊膜间充质干细胞的分离的有益效果从羊膜分离的原代hAMSCs数> 6X IO7 /份，通过原代培养细胞数可扩增12倍，这样的细胞产率已能满足临床细胞治疗的需用量。(理论上，一个成熟的完整人羊膜含有4X IO8个hAMSCs)
(2)本发明人羊膜间充质干细胞的纯化的有益效果所获的hAMSCs其纯度>99%，用台盼蓝染色其活细胞率达98% ；如果不经过贴壁生长培养纯化步骤，其纯度则不到85%，更重要的是纯度低的样品将大大影响后续实验及实验结果的评价。(3)本发明人羊膜间充质干细胞的鉴定方法的有益效果①原代分离样品因受消化酶的影响可能致表面标志丢失，而用第2代hAMSCs作为鉴定样品更能准确反映hAMSCs 的表型特征；②通过免疫细胞化学染色波形蛋白和CK19，可鉴别hAMSCs和羊膜上皮细胞； ③我们通过流式细胞术反复检测证明hAMSCs稳定表达⑶29、⑶44、和⑶166，而不表达 ⑶34和⑶45，该表型谱可作为鉴定hAMSCs的表型，不必过多检测其它表面标志；④本鉴定方案方法简便、准确。
具体实施例方式实施例1
本发明的人羊膜间充质干细胞的分离，包括以下步骤
第一，无菌采集人足月剖宫产胎盘，机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hank’ s液冲洗数次以清除残留血迹，将羊膜剪成2mmX2mm大小的碎片；
第二，羊膜碎片加入含0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶消化溶液，于37° C，200转/分旋转消化10分钟，弃上清；重新加入消化液，于37° C，200转/分旋转消化30分钟，弃上清，留取未消化的羊膜碎片；
第三，D-Hank，s液冲洗未消化的羊膜碎片，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0.75 mg/ ml的胶原酶，于37° C，200转/分旋转消化约2 h至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，1500转/分，离心10分钟，收集细胞沉淀即原始hAMSCs，本次从羊膜分离的原代 hAMSCs 数达 6. 7 X IO7 / 份；
第四，将分离的原始MMSCs重新悬浮于LG-DMEM培养基中(含10% FBS、10 μ g/ml bFGF、55 μ mol/L 2-巯基乙醇，100 U/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素)，以 1. 25X 105/ml 的细胞密度接种于6孔培养板，置于37° C、饱和湿度、体积分数为5%ω2的(X)2培养箱培养 36 48小时，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，这一点非常重要。第 3天更换新的培养基。待细胞汇合度达80 90%后，用0. 25%胰蛋白酶一0. 02% EDTA溶液于 37° C消化纩3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分，离心5分钟，弃上清， 细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1 X 107L的细胞密度传代。所获的hAMSCs其纯度为99. 2% (根据波形蛋白阳性率判定)，用台盼蓝染色其活细胞率为98. 5%。通过原代培养可扩增12 倍，产生的hAMSCs数达8 X IO8。实施例2
本发明的人羊膜间充质干细胞的鉴定方法，包括以下步骤
第一，免疫细胞化学染色hAMSCs爬片用PBS缓冲液漂洗，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗，0. 3%Triton_X100作用15 20 min, 3%H202灭活内源性过氧化物酶10 min， PBS漂洗，加正常羊血清封闭30 min，滴加波形蛋白抗体或鼠抗人CK19抗体室温孵育1 h， PBS漂洗，滴加鼠兔通用型二抗室温孵育1 h，PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固，光学显微镜下观察。阴性对照组用PBS替代一抗。结果应为hAMSCs表达波形蛋白，而不表达上皮细胞标志CK19，以此可排除分离hAMSCs过程中是否有羊膜上皮细胞的混杂，同时可判断所分离的hAMSCs的纯度；
第二，流式细胞术分析调整hAMSCs密度为IXlO6Ail，每管200 ？ L细胞悬液，共3 管，分别加入荧光标记单抗CD29-PE+CD44-FITC、CD34-PE+CD45-FITC和CD166-PE，每种抗体各20 L，混勻，室温避光孵育25分钟。每管加2 ml含1 g/L NaR的磷酸盐缓冲液，混勻，1000转/分离心5分钟，弃上清，振荡悬浮细胞。每管加入10 g/L多聚甲醛300 ？ L， 混勻，用流式细胞仪检测，每一样品采集细胞> 20 000个，用Cell Quest软件进行采集分析，用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作为同型对照。根据免疫细胞化学染色和流式细胞术分析结果，本次分离、纯化的hAMSCs其波形蛋白阳性率为99. 2%,而CK19为阴性；⑶29、CD44、和CD166表达率分别为99. 5%,80. 1%和 92. 7%,而不表达⑶；34和CD45，可判定为hAMSCs。
权利要求
1.一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤第一，无菌采集人足月剖宫产胎盘，机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hank’ s液冲洗数次以清除残留血迹，将羊膜剪成碎片；第二，羊膜碎片加入含0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶消化溶液，于37° C，旋转消化弃上清；重新加入消化液，于37° C旋转消化弃上清，留取未消化的羊膜碎片；第三，D-Hank，s液冲洗未消化的羊膜碎片，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0. 75 mg/ml的胶原酶，于37° C，旋转消化约2 h至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，离心得到原始的人羊膜间充质干细胞；第四，将分离的原始的人羊膜间充质干细胞重新悬浮于LG-DMEM培养基中，将细胞密度接种于6孔培养板，置于(X)2培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基；待细胞汇合度达80、0%后，用胰蛋白酶一EDTA溶液消化， 加入培养基终止胰蛋白酶作用，离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1 X 107L的细胞密度传代。
2.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化方法得到的人羊膜间充质干细胞的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤第一，免疫细胞化学染色人羊膜间充质干细胞爬片用PBS缓冲液漂洗，多聚甲醛固定，PBS漂洗，Triton-XlOO作用15 20 min, H2O2灭活内源性过氧化物酶，PBS漂洗，加正常羊血清封闭，滴加波形蛋白抗体或鼠抗人CK19抗体室温孵育，PBS漂洗，滴加鼠兔通用型二抗室温孵育，PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固，光学显微镜下观察，阴性对照组用PBS替代一抗；第二，流式细胞术分析调整人羊膜间充质干细胞密度为IX 106/ml，每管200 ？ L细胞悬液，共3管，分别加入各20 L荧光标记单抗Q^9-PE+CD44-FITC、CD34-PE+CD45-FITC 和⑶166-PE，混勻，室温避光孵育，每管加2 ml含1 g/L Ni^3的磷酸盐缓冲液，混勻，离心弃上清，振荡悬浮细胞，每管加入10 g/L多聚甲醛300 ？ L，混勻，用流式细胞仪检测，用Cell Quest软件进行采集分析，用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作为同型对照。
全文摘要
本发明公开了一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化及鉴定方法，hAMSCs的分离方法为将人羊膜剪成碎片，用EDTA的胰蛋白酶，DNaseI的胶原酶分二步旋转消化，用钢网过滤，收集细胞滤液即为分离的原始hAMSCs；hAMSCs的纯化方法是原始hAMSCs用LG-DMEM培养基置于CO2培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基，待细胞汇合度达80~90%后，用胰蛋白酶—EDTA溶液消化收集细胞即可获得高纯度的hAMSCs；hAMSCs的鉴定方法采用免疫细胞化学染色波形蛋白和CK19以鉴别hAMSCs和羊膜上皮细胞，采用流式细胞术检测CD29、CD44、CD166、CD34和CD45的表达。本发明方法具有hAMSCs高收率、高活性、高纯度优点，鉴定方法简便、精准。
文档编号G01N15/10GK102559586SQ20111040458
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者方宁, 陈代雄 申请人:遵义医学院附属医院