含植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法。涉及一种医用材料的制备技术。包括：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～50wt%的种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的培养基混合后置于培养容器中静置培养得到含有天然植物成分的细菌纤维素膜；取羊膜细胞外基质膜浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养1～6h，经纯化处理，灭菌后得到一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，制备的敷料具有杀菌、保湿、吸收伤口渗出液及加速伤口愈合等性能，适用于各类慢性皮肤创伤。
【专利说明】含植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医用材料的制备【技术领域】，特别是指一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法。
【背景技术】
[0002]羊膜是从细胞滋养层衍化而来，是两层胎膜的内层。正常羊膜薄而明，不含有血管、神经和淋巴管等结构，厚度为20~500 μ m。羊膜具有5层结构可分为:上皮层、基底膜层、致密层、纤维母细胞层、海绵层。去除细胞后的羊膜细胞外基质材料中含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分，表达多种生长因子及其mRNA的相关蛋白，能为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分，有利于细胞的生长繁殖；基底膜层较厚，有利于表皮细胞的贴附和迁移，促进上皮化，防止其凋亡；致密层与海绵层的胶原纤维形成疏松的三维立体构型；组织相容性好，不表达人类白细胞抗原，无诱导排斥反应；容易得到，且可塑性好，易于加工处理。大量研究证实，羊膜作为生物敷料对于治疗大面积烧伤、烫伤等皮肤损伤具有良好的效果。但由于羊膜薄而柔软、保温保水性差、创面渗出多是易溶失，同时生物力学性能较差，操作有一定难度，使其在生物敷料应用中受到限制。
[0003]细菌纤维素是一种天然的生物高聚物，具有超精细网状结构，由直径3~4纳米的微纤组合成40~60纳米粗的纤维束，并相互交织形成发达的超精细网络结构。且其化学纯度非常高，由于细菌纤维素具有良好的生物相容性、湿态时高的机械强度、良好的液体吸收性能和保湿性能，使其在医学生物材料发展中表现出极大的优势，可作为理想的可降解载体材料应用于伤口敷料、药物载体材料等诸多领域。国外采用单纯的细菌纤维素作为湿性敷料已有报道，并且已经产业化用于临床。
[0004]迷迭香(Rosmarinus officinatis L.)又名油安草,别名艾菊,系唇形科迷迭香属植物，多年生常绿亚灌木。迷迭香提取物中最重要是迷迭香抗氧化剂及迷迭香精油。迷迭香天然抗氧化剂结构稳定，不容易分解，耐190°C高温，其抗氧化效果好，且不具毒性。迷迭香植物中含有酚、酸、酮、萜等多种化合物，在食品、医药、工业上得到了广泛的应用。迷迭香提取物具有良好的抗菌性能，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、汉逊氏酵母菌、青霉、黑曲霉、黄曲霉和桔青霉均有很好的抑制效果；迷迭香提取物用于治疗慢性伤口可以减少炎症、增强伤口收缩、有助于上皮组织及肉芽组织的重建，并且能够提高伤口血管化和胶原蛋白的形成。综上所述，将含有天然迷迭香提取物成分的细菌纤维素与羊膜细胞外基质材料结合得到具有三维网络结构的复合材料，可以制备出兼具组织相容性、抗菌、保湿、吸收伤口渗出液、加速伤口愈合以及机械性能良好的湿性敷料。
[0005]本专利采用微生物发酵培养方法原位复合羊膜细胞外基质材料。含有天然迷迭香提取物成分的细菌纤维素材料与羊膜细胞外基质材料，通过细菌纤维素纳米纤维与羊膜细胞外基质材料致密层与海绵层的胶原纤维相互作用且纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，制备的敷料具有杀菌、保湿、吸收伤口渗出液及加速伤口愈合等性能，适用于各类慢性皮肤创伤。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法。涉及一种医用材料的制备技术。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，制备的敷料具有杀菌、保湿、吸收伤口渗出液及加速伤口愈合等性能，适用于糖尿病足溃疡、下肢静脉性溃疡、压疮、供皮区伤口等各类慢性皮肤创伤。
[0007]本发明公开了一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，包括:选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30~50wt%的种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养得到含有天然植物成分的细菌纤维素膜；取羊膜细胞外基质膜浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养I~6h，经纯化处理，灭菌后得到一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。
[0008]作为优选的技术方案:
其中，如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的能分泌细菌纤维素的菌株是指木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。
[0009]如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香冻干粉10~50g、磷酸氢二钠4~16g、磷酸二氢钾4~16g、酵母膏4~20g、蛋白胨4~20g，其中乙醇水溶液浓度为50~70wt%。
[0010]如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的静置培养是指种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养5~7d，其中种子醪液与含有胶原溶液的发酵培养基混合后在培养容器内的液面高度为0.5~3cm。通常情况下，细菌纤维素膜漂浮于培养液的上方，细菌纤维素在发酵培养过程中会消耗一部分培养基，同时一部分培养基通过蒸发失去。本专利中所述的方法通过控制培养液用量在合理范围，培养基用量过少将影响细菌纤维素的生物合成，过多则影响羊膜细胞外基质材料有效平铺于细菌纤维素膜上表面。
[0011]如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的含有天 然植物成分的细菌纤维素膜是指静置培养得到的水凝胶细菌纤维素膜，厚度为I~3cm，其中细菌纤维素的三维网络纳米纤维上均匀附着有含天然迷迭香提取物成分的化学物质。发酵过程中细菌首先在培养基中大量扩增并生物合成纤维素微纤，含有天然迷迭香提取物成分的化学物质黏附在纤维素微纤上，随着发酵时间延长形成纤维素纳米纤维，并且在纳米纤维上均匀附着迷迭香提取物成分；最终形成含有天然迷迭香提取物成分的水凝胶状细菌纤维素膜。
[0012]如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的羊膜细胞外基质材料是指来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的脱细胞生物羊膜。新鲜羊膜取自健康剖宫产产妇的胎盘，产前血清学检查排除乙肝、丙肝、梅毒及获得免疫缺陷综合征，取材处理均在无菌操作下完成；经处理去除细胞、脂肪、可溶性抗原，一般采用冷冻干燥法进行干燥并经辐照灭菌。
[0013]如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的铺于含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面是指羊膜细胞外基质材料的海绵层与含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面相接触。羊膜细胞外基质材料具有5层结构可分为:上皮层、基底膜层、致密层、纤维母细胞层、海绵层。其中致密层与海绵层的胶原纤维形成疏松的三维立体构型，有利于细菌纤维素膜中的纤维素纳米纤维与其形成相互贯穿的网络结构。基底膜层含有IV型和V型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及各种螯合蛋白，能够促进种子细胞的分化、增殖和迁移。因此，在制备敷料时将羊膜细胞外基质材料的海绵层与细菌纤维素膜上表面相接触，有利于细菌纤维素膜的纤维素纳米纤维进入海绵层的疏松胶原纤维内部，同时保持了基底膜层的生物活性。
[0014]如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的纯化处理是指复合材料在1~3wt%的氢氧化钠水溶液30~60°C浸泡12~24h，并用去离子水清洗至中性。本专利中选用较低浓度的氢氧化钠在低温下对复合材料进行处理，氢氧化钠溶液浸泡能够彻底去除菌体蛋白和粘附在细菌纤维素膜上的残余培养基，确保复合材料的内毒素符合医用植入性材料的要求，同时低浓度氢氧化钠可以防止在处理过程中影响羊膜细胞外基质材料中含有的诸多蛋白及生长因子。
[0015]如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料是指含有天然植物成分的细菌纤维素膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于敷料的上层，含有天然植物成分的细菌纤维素膜位于敷料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与含有天然植物成分的细菌纤维素膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
[0016]如上所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料在使用时，位于敷料上层的羊膜细胞外基质与皮肤伤口接触。
[0017]本发明的另一目的是提供一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料，其特征是:包含细菌纤维素、迷迭香和羊膜细胞外基质。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本专利采用微生物发酵培养方法原位复合羊膜细胞外基质材料。含有天然迷迭香提取物成分的细菌纤维素材料与羊膜细胞外基质材料，通过细菌纤维素纳米纤维与羊膜细胞外基质材料致密层与海绵层的胶原纤维相互作用且纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。在保证复合材料的组织相容性、生物活性的前提下，有效增强了材料的机械性能，抗菌性能；所含的天然迷迭香提取物成分可以减少伤口炎症、增强伤口收缩、有助于上皮组织及肉芽组织的重建，并且能够提高伤口血管化和胶原蛋白的形成。本发明制备工艺简单易行、成本低、材料来源广泛，制备的敷料具有杀菌、保湿、吸收伤口渗出液及加速伤口愈合等性能，适用于糖尿病足溃疡、下肢静脉性溃疡、压疮、供皮区伤口等各类慢性皮肤创伤。
[0019]【具体实施方式】[0020]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0021]实施例1:
选取能 分泌细菌纤维素的木醋杆菌活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为50wt%的种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合。所述的含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香冻干粉30g、磷酸氢二钠16g、磷酸二氢钾16g、酵母膏20g、蛋白胨20g，其中乙醇水溶液浓度为70wt%。混合后的溶液置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为3cm，静置培养5d得到膜厚度为3cm的水凝胶状含有天然迷迭香提取物成分的细菌纤维素膜。
[0022]将来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面相接触。继续静置培养lh，得到的复合材料置于lwt%的氢氧化钠水溶液60°C浸泡12h，并用去离子水清洗至中性，得到一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。其中羊膜细胞外基质位于敷料的上层，含有天然植物成分的细菌纤维素膜位于敷料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与含有天然植物成分的细菌纤维素膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。该敷料在使用时，位于敷料上层的羊膜细胞外基质与皮肤伤口接触。
[0023]实施例2:
选取能分泌细菌纤维素的根瘤菌属和假单胞菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为40wt%的种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合。所述的含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香冻干粉20g、磷酸氢二钠Hg、磷酸二氢钾Hg、酵母膏18g、蛋白胨18g，其中乙醇水溶液浓度为70wt%。混合后的溶液置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为2cm,静置培养5d得到膜厚度为2.5cm的水凝胶状含有天然迷迭香提取物成分的细菌纤维素膜。
[0024]将来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面相接触。继续静置培养2h，得到的复合材料置于2wt%的氢氧化钠水溶液50°C浸泡12h，并用去离子水清洗至中性，得到一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。其中羊膜细胞外基质位于敷料的上层，含有天然植物成分的细菌纤维素膜位于敷料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与含有天然植物成分的细菌纤维素膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。该敷料在使用时，位于敷料上层的羊膜细胞外基质与皮肤伤口接触。
[0025]实施例3:
选取能分泌细菌纤维素的八叠球菌属和产碱菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30被％的种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合。所述的含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香冻干粉10g、磷酸氢二钠12g、磷酸二氢钾12g、酵母膏16g、蛋白胨16g,其中乙醇水溶液浓度为60wt%。混合后的溶液置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为Icm,静置培养6d得到膜厚度为Icm的水凝胶状含有天然迷迭香提取物成分的细菌纤维素膜。
[0026]将来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面相接触。继续静置培养3h，得到的复合材料置于3wt%的氢氧化钠水溶液30°C浸泡16h，并用去离子水清洗至中性，得到一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。其中羊膜细胞外基质位于敷料的上层，含有天然植物成分的细菌纤维素膜位于敷料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与含有天然植物成分的细菌纤维素膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。该敷料在使用时，位于敷料上层的羊膜细胞外基质与皮肤伤口接触。
[0027]实施例4:
选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌、气杆菌属和固氮菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为50wt%的种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合。所述的含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香冻干粉50g、磷酸氢二钠10g、磷酸二氢钾10g、酵母膏10g、蛋白胨10g，其中乙醇水溶液浓度为60wt%。混合后的溶液置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为0.5cm,静置培养6d得到膜厚度为2cm的水凝胶状含有天然迷迭香提取物成分的细菌纤维素膜。
[0028]将来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面相接触。继续静置培养3h，得到的复合材料置于lwt%的氢氧化钠水溶液30°C浸泡24h，并用去离子水清洗至中性，得到一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。其中羊膜细胞外基质位于敷料的上层，含有天然植物成分的细菌纤维素膜位于敷料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与含有天然植物成分的细菌纤维素膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。该敷料在使用时，位于敷料上层的羊膜细胞外基质与皮肤伤口接触。
[0029]实施例5:
选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌和无色杆菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为40wt%的种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合。所述的含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香冻干粉40g、磷酸氢二钠4g、磷酸二氢钾4g、酵母膏4g、蛋白胨4g,其中乙醇水溶液浓度为50wt%。混合后的溶液置于培养容器中，混合液在培养容器内的液面高度为2cm,静置培养7d得到膜厚度为2cm的水凝胶状含有天然迷迭香提取物成分的细菌纤维素膜。
[0030]将来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的羊膜细胞外基质材料浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面。其中，羊膜细胞外基质材料的海绵层与含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面相接触。继续静置培养6h，得到的复合材料置于3wt%的氢氧化钠水溶液40°C浸泡18h，并用去离子水清洗至中性，得到一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。其中羊膜细胞外基质位于敷料的上层，含有天然植物成分的细菌纤维素膜位于敷料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与含有天然植物成分的细菌纤维素膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。该敷料在使用时，位于敷料上层的羊膜细胞外基质与皮肤伤口接触。
[0031]实施例6:
含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的皮下埋置实验实验方法:取健康SD大鼠30只，性别不限，分为实验组和对照组，消毒，采用乙醚吸入麻醉，常规无菌操作，切开背部皮肤，实验组背部植入5张I X Icm2敷料(分别取实施例1-5所制备的含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料)，对照组切开后即缝合。观察动物术后一般情况和伤口愈合情况。术后1、2、4周处死各组动物，取出植入敷料戊二醛固定，常规包埋切片，HE染色，光镜观察植入物周围淋巴细胞、巨噬细胞浸润情况。
[0032]实验表明:手术当天动物清醒后即可正常进食，伤口无红肿、渗液等炎性反应，所有创面均可良好愈合，手术切口无I例发生感染，动物无死亡、惊厥、中风等毒性反应，植入物周围软组织未见发黑、坏死、化脓、积液等表现，组织学观察术后I周，植入物周围有大量淋巴细胞，2周时，仅少量淋巴细胞，4周时，基本无淋巴细胞存在。证实本发明的敷料无生物学毒性，有良好的组织相容性。
[0033]实施例7
含有天然植物成分的 细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料对糖尿病足溃疡大鼠的治疗实验
运用高脂饲料配合链脲佐菌素诱导的大鼠2型糖尿病，使用烫伤仪制成深II度烫伤诱导皮肤溃疡制成糖尿病足溃疡大鼠模型。大鼠为SD雄性大鼠，SPF级，体重(180±10)g，共30只，每组5只，共6组，其中一组为对照，另5组分别施用实施例1-5制备的含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。高脂饲料的制备方法为:首先，将大麦15%，小麦31%，玉米15%，麸皮15%，鱼粉6%按比例搅拌混合均匀后，加入豆柏、油、盐混匀后加压成型制成基础饲料，然后，将基础饲料73 %，猪油20 %，奶粉2 %，胆固醇I %，蔗糖4 %按比例搅拌混合均匀后加压成型制成高脂饲料，成品为圆柱块状。高脂饲料喂养8周后，1.5%链脲佐菌素溶解于PH值4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按35mg/kg的剂量左下腹注射。使用SQL-5Q烫伤仪，温度90°C，接触时间10S，压力9.8N，面积4cm2，麻醉后于后背部皮肤进行烫伤。造模成功后，用碘伏清洁创面，用本发明的含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料外敷创面，然后用无菌纱布包扎，I天换药I次，以溃疡面积和血白细胞总数为指标统计平均愈合时间，结果见表1。
[0034]表1对糖尿病足溃疡大鼠的平均愈合时间比较(n=5)
【权利要求】
1.一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料，其特征是:包含细菌纤维素、迷迭香和羊膜细胞外基质。
2.一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征是:选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30~50wt%的种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养得到含有天然植物成分的细菌纤维素膜；取羊膜细胞外基质膜浸泡在培养基中，待其完全润湿后平铺于细菌纤维素膜上表面；继续静置培养I~6h，经纯化处理，灭菌后得到一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料。
3.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征在于:所述的能分泌细菌纤维素的菌株是指木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。
4.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征在于:所述的含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香冻干粉10~50g、磷酸氢二钠4~16g、磷酸二氢钾4~16g、酵母膏4~20g、蛋白胨4~20g，其中乙醇水溶液浓度为50~70wt%。
5.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征在于:所述的静置培养是指种子醪液与含有天然迷迭香冻干粉的发酵培养基混合后置于培养容器中静置培养5~7d，其中种子醪液与含有胶原溶液的发酵培养基混合后在培养容器内的液面高度为0.5~3cm。
6.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征 在于:含有天然植物成分的细菌纤维素膜是指静置培养得到的水凝胶细菌纤维素膜，厚度为I~3cm，其中细菌纤维素的三维网络纳米纤维上均匀附着有含天然迷迭香提取物成分的化学物质。
7.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征在于:所述的羊膜细胞外基质材料是指来源安全，经处理去除细胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥灭菌的脱细胞生物羊膜。
8.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征在于:所述的平铺于含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面是指羊膜细胞外基质材料的海绵层与含有天然植物成分的细菌纤维素膜上表面相接触。
9.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征在于:所述的纯化处理是指复合材料在I~3wt%的氢氧化钠水溶液30~60°C浸泡12~24h，并用去离子水清洗至中性。
10.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征在于:所述的含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料是指含有天然植物成分的细菌纤维素膜与羊膜细胞外基质的复合材料，其中羊膜细胞外基质位于敷料的上层，含有天然植物成分的细菌纤维素膜位于敷料的下层，并且羊膜细胞外基质材料的致密层与海绵层中的胶原纤维与含有天然植物成分的细菌纤维素膜中的纳米纤维相互贯穿，形成链接紧密的复合材料。
11.如权利要求2所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料的制备方法，其特征在于:所述的一种含有天然植物成分的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质敷料在使用时，位于敷料上层的羊膜细胞外基质与皮肤伤口接触。
【文档编号】A61L15/28GK103893816SQ201410061448
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】钟春燕, 钟宇光 申请人:钟春燕