鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌血清蛋白质检测的质谱试剂盒的制作方法

专利名称：：鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌血清蛋白质检测的质谱试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新的鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌生物样品中蛋白质分析方法的试剂盒。一种通过能与蛋白质结合的基质力捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌生物标志。在此提及的此项发明涉及蛋白质检测领域，为-一种新的非侵入性的体外质谱检测方法。本发明可以应用到己经脱离人体的体液中的鳞状细胞癌抗原阴性s颈癌生物标志组合的检测方法或试剂盒。技术背景不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。丙此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，R前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用质谱联合可克服这一技术缺点。S颈癌的发生是一个多基丙突变导致抑癌基闵失活、癌基闲活化的过程。基闲组学研究由于自身的限制难以完全阐明基因与蛋白质参与过程及其具体作用，而近年来蛋白质组学的发展为人们从整体上了解恶性肿瘤的发生、发展提供了较为理想的技术平台。B前临床上对恶性肿瘤预后评估主要依赖于临床表现、病理学及传统肿瘤标志(turaormarker),但肿瘤早期复发或转移时常常无明显临床表现，而病理学证据很难得到且重复性差。S颈癌涂片筛査异常细胞是肿瘤防治学上的重要成就之一。自引入巴氏涂片进行筛査宫颈癌后，降低了筛査人群宫颈癌的发病率。但巴氏涂片的准确性受许多冈素的影响，假阴性率较高，大约为15%40%。传统肿瘤标志鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)在宫颈癌预后评估中有重要价值，但临床工作中也发现有相当比例的宫颈癌患者中丙鳞状细胞癌抗原表达阴性而无法检测，同时对于鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌患者的预后评估则缺乏有效的早期监测手段。但是，我们在进行蛋白质质谱分析时发现没有一个临床鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌质谱标准化的试剂盒。
发明内容本发明的目的是建立一种在鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌生物样品中检测的方法。该方法为鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的鳞状细胞癌抗原阴性s颈癌生物标志提供了基础。本发明涉及一种通过生物标志结合的基质表面，并用定量性质谱分析来同时检测多种生物标志状态。本发明中的生物标志是利用一台质谱仪来发现的。该设备的质量精确度约为+/-0.1%。基质是任何能与生物标志选择性或特异性结合的物质。举例说明，WCX阴离子，C8/C18疏水作用基质吸附剂，分离生物化学中的这些方法和由这些方法产生的吸附剂具有诊断反面的用途(即阴离子吸附剂捕获阳离子蛋白质)。底基洗左未吸附的物质。任何适宜的洗液均可使用。生物标志首先能够被具有能与生物标志物结合基质吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的生物标志物在质谱仪中被检测。生物标志通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50%质谱信号强度的最大值。生物标志的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，生物标志的数量与质量都可以被检测出来。飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了T扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。通过对生物标志的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的生物标志的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个生物标志的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标志的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的下扰，这可以设置调零。计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的生物标志物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生物标志物和那些高于或低于校准样本的生物标志物。分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于--个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一-些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。发明中使用的生物标志是基质所捕获。这些生物标记是进一步通过质谱(massspectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。宫颈癌检测多肽蛋白筛选用Mann-WhitneyV检验比较配对样本的蛋白峰，初步分析筛选出宫颈癌忠者与健康人群有9个差异多肽蛋白，不同峰的分子量、均值及尸值见表一表一32例宫颈癌与32例年龄匹配的健康人生物样品中的差异峰情况<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>用中筛选出几个特征蛋白峰，3974，3398，13761土Da3个差异峰组成的检验模型对SCC-Ag阴性表达宫颈癌患者和健康人群盲筛检验，用此分类法分析32份S颈癌样本的质谱结果，其中32份区分正确，0份区分错误，敏感性为100%;32份对照样品中30份区分正确，2份区分错误，特异性为93.75%(见表二)表二生物样品中检验模型的判别情况<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>利用C8及C18疏水基质磁珠或芯片的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠或芯片的实验结果一致。CINIII与宫颈癌I、II期患者多肽蛋白比较13份宫颈癌与13份CINin蛋白指纹图谱标准化后，用软件分析，在分子量150035000范围内共检测到122个蛋白峰，其中2个在宫颈癌组与对照组的差异有显著意义(尸〈0.05)，不同峰的分子量、均值及P值见表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所建立的模型对SCC-Ag阴性或阳性忠者的判别情况如表四所示，13例CINIII患者SCC-Ag全都阴性，7例IA期宫颈癌忠者血清中有6例SCC-Ag阴性，37例IB期宫颈癌血清中也有19例SCC-Ag阴性患者，可见早期的宫颈癌忠者血清SCC-Ag大多阴性。但是通过所建立的模型却能很好的把这些SCC-Ag阴性的忠者血清从健康人群中区分出来，如13例CINIII患者血清中有11判断正确，6例IA期宫颈癌忠者血清全部判别正确，19例IB期宫颈癌血清中也有17例正确。另外这个模型也能很好把那些SCC-Ag阳性的忠者血清从健康人群血清中区分出来。表四所建立的模型对SCC-Ag阴性或阳性生物样品中的判别情况<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明利用WCX阴离子基质及利用C8/C18疏水基质磁珠为例对正常人与3颈癌血清(浆)进行蛋白质对比分析。定量性控制及质谱激光能量调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50%质谱信号强度的最大值。一种鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌检测和预后判断的质谱试剂盒和方法的具体操作步骤以下是用本发明提供的一个操作方案及鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌检测试剂盒实例。1.样品处理及标准化质控血清(浆)制备将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中，视需要离心澄清样品。质谱的标准化质控血清(浆)制备定义符合如下标准供血者10人，5男5女，血型为0型；年龄为18-30岁；民族汉。生化指标正常，包括总胆固醇、甘油二酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功检查、肾功检査；无遗传病家族史；无重大传染病史。女性不能怀孕，男性为不吸烟者。2.基质与鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌、标准化质控血清(浆)制备、样品上样抽取0型血的健康受试者(男女各半)的新鲜血液(a)4'C下待血液凝同后马上离心，4'C离心5min分离血清。(b)4'C下马上离心，4'C离心5min分离血浆。标准化质控或tr颈癌血清(浆)样品分装10(^1—小管，于一8(TC储存；或取混合血清(浆)1:2稀释于U9缓冲液(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0)一小管，25。C储存。即成为S颈癌、标准化质控血清(浆)试剂盒。将质谱的标准化质控血清及样品点样在有支持物的基质中的一个位点上。支持物用磁性珠或芯片。基质是用于标记、结合血清(浆)的。标记至液相色谱柱子上的基质可用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)的标准方法力分析。将质谱的标准化质控0血清(浆)用于质谱仪试剂盒的定量方法。3.洗涤用结合缓冲液洗涤。在样品完全千燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。以下歩骤用0.05%1%二氟乙酸彻底洗涤整个磁性珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%二氟乙酸制备的饱和标准溶液)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。3.质谱的定量控制及测试用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337run)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)标准方法去分析滞留于各位点的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。定量性质谱调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50y。信号强度的最大值。定量性控制及质谱激光能量调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中ffl于定量的标准峰6634.0Da强度调至50%质谱信号强度的最大值。用2746土1Da、5909土1Da、6634i1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准。本发明将蛋白质分成了几大类，即WCX阴离子、C8/C18疏水作用等蛋白。这样，可用质谱仪直接进行分析及定量。利用C8及C18疏水基质磁珠或芯片的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠或芯片的实验结果一致。本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外鳞状细胞癌抗原阴性S颈癌质谱检测方法的定量控制，如离体体液的宫颈癌试剂盒用于临床质谱的鳞状细胞癌抗原阴性S颈癌检测方法。可以检测多个宫颈癌蛋白质生物标志群及质谱多肽图谱。.本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点(1)准确质谱直接分析有很强的精确性，一般误差率只有O.1Da。闲为蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。(2)方便本方法将蛋白质分成了几大类，即阴离子、疏水作用蛋白。这样，可用质谱仪直接进行分析。支持基质的方法所用吸附剂的支持物是磁珠或芯片。用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。磁珠表面的结合面积大于芯片，从而其灵敏性比芯片更高。这样，可用质谱仪直接进行分析。(3)快捷用本发明提供的蛋白指纹法进行检测时，无需对蛋白质进行测序。本发明采用了计算机"条码格式"，信号强度沿着线性轴以暗度强度值显示。此强度可以用扫描仪记录并用分析软件自动分析对比强弱，从而有助于临床复杂的检测，如可用此"蛋白指纹"或条码格式进行医学分析。具体实施方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范,。实施例1正常与鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌忠者的区分及质谱的试剂盒制备(1)实验方法77例S颈鳞癌患者(其中I期44例，II期33例，平均年龄44岁)和13例CINIII忠者(平均年龄41岁)的术前血清。健康体检者52例，平均年龄42岁，来源于肝功能、肾功能等检査均正常的体检人群。受检者空腹采集静脉血lmL，采集后立即于4'C冰箱静置2小时，4°C4000r/min离心IO分钟分离血清，将血清于4'C12000r/min再次离心5分钟，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为100A/管，共5管，保存于-8(TC冰箱。避免反复冻融。蛋白质芯片及磁珠操作步骤血.清样品处理从-80。C冰箱中取出血清，于4。C，10OOOrptn离心5min。取IO叱血清样品，加2(mLU9处理液(9mol/L尿素，2%CHAPS,1%DTT，50隱ol/LTris-CL，pH9.0),充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360叱结合缓冲液(100,ol/LNaAc,pH4.0),立即混匀。芯片上样及洗脱将WCX2芯片(弱阴型离子表面，羧基基团，捕获正电荷基团蛋白)装入bioprocessor中，每孔加入200叱结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5min，甩T。每孔分别加入IOO叱处理好的样品，振荡孵育lh，甩去样品，用200ul芯片洗脱缓冲液(10Ommol/LNaAc，pH4.0)室温振荡洗涤2次，每次5min，甩T;再用HPLCH20洗涤一次，立即甩T。取出芯片，每点加2次O.5叱SPA饱和溶液，晾T后上机测量。磁珠上样及洗脱将处理好的样品IOO叱加至已装好WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团，捕获正电荷基团蛋白)的PCR管(北京赛尔迪公司)中，置磁性处理器上孵育30min，除力液体。加100叱磁珠结合缓冲液(50醒ol/LNaAc，pH4.04.3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10叱ElutionBuffer2min，洗脱标本至上清液。取5叱上清液移至另一个PCR管中，加入5叱SPA饱和溶液充分混匀，取l叱混合溶液加样到Au片上，晾T后h机测量。数据收集将处理好的Au片置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有all-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子量误差<().1%。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围100015000Da，最佳聚柒中心8000Da，数据采集参数范围2080，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。用血清中的内标峰4091.1Da或6634.0Da校正原始数据中的蛋白指纹图谱，使分子量误差<0.01%,从而获得的精确的蛋白指纹图谱。统计学分析应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白指纹图谱。所有的图谱都进行了标准化，统--到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1或6634.0Da强度调至4050%信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了"减少基线"，定义蛋白峰(s/n>5，最小的峰强度>1.6)。分析所有150kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，汁算出峰的平均数，标准差(SD)和变异系数(CW。)。用Mann-WhitneyV检验比较配对样本的蛋白峰，计算p值.鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)检测取空腹静脉血4mL，离心后提取血清，按照检测系统步骤进行操作，正常参考值<10"g/L(<10ng/ml)。S颈癌检测多肽蛋白筛选用Mann-Whitney〃检验比较配对样本的蛋白峰，初步分析筛选出S颈癌忠者与健康人群有9个差异多肽蛋白，不同峰的分子量、均值及尸值见表-表一32例宫颈癌与32例年龄匹配的健康人生物样品中的差异峰情况<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例2试剂盒的双盲测试用从实施例1中筛选出几个特征蛋白峰，3974，3398，13761土15Da3个差异峰组成的检验模型对SCC-Ag阴性表达宫颈癌患者和健康人群盲筛检验，用此分类法分析32份S颈癌样本的质谱结果，其中32份区分正确，0份区分错误，敏感性为100%;32份对照样品中30份区分正确，2份区分错误，特异性为93.75%(见表二)表二生物样品中检验模型的判别情况<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注敏感性100%(32/32);特异性93.75%(32/32)利用C8及C18疏水基质磁珠或芯片的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠或芯片的实验结果一致。实施例3CINIII与宫颈癌I、II期患者多肽蛋白筛选CINffl与宫颈癌I、n期患者多肽蛋白比较13份宫颈癌与13份CINIII蛋白指纹图谱标准化后，用软件分析，在分子量150035000范围内共检测到122个蛋白峰，其中2个在S颈癌组与对照组的差异有显著意义(尸<0.05)，不同峰的分子量、均值及尸值见表表二13例宫颈癌与13例宫颈CINIII生物样品中的差异峰情况<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例4血清SCC-Ag阴性或阳性的宫颈癌患者血清多肽蛋白表达差异所建立的模型对SCC-Ag阴性或阳性患者的判别情况如表四所示，13例CINIII患者SCC-Ag全都阴性，7例IA期宫颈癌患者血清中有6例SCC-Ag阴性，37例IB期宫颈癌血清中也有19例SCC-Ag阴性患者，可见早期的宫颈癌患者血清SCC-Ag大多阴性。但是通过所建立的模型却能很好的把这些SCC-Ag阴性的患者血清从健康人群中区分出来，如13例CINIII忠者血清中有11判断正确，6例IA期宫颈癌忠者血清全部判别正确，19例IB期宫颈癌血清中也有17例正确。另外这个模型也能很好把那些SCC-Ag阳性的忠者血清从健康人群血清中区分出来。表四所建立的模型对SCC-Ag阴性或阳性生物样品中的判别情况<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种用磁珠支持基质的方法捕获体外生物样品中鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌蛋白质组的试剂盒和方法，其特征是采用蛋白指纹法对鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌中体外样品蛋白质组或质谱多肽图谱进行鉴别检测。用标准化质控血清(浆)控制下的定量性质谱分析来检测。该方法通过以下步骤实现(1)样品处理及质谱标准化质控血清(浆)制备；(2)基质与血清(浆)结合试剂盒制备、样品上样；(3)洗涤；(4)质谱的定量控制及质谱检测；其中所述步骤(1)将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用O型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清(浆)；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清(浆)及样品点样在有支持物的基质中的一个位点上。支持物用磁珠或芯片。基质是用WCX阴离子基质及C8/C18疏水基质与血清(浆)选择性结合；所述步骤(3)用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片或位点上。所述步骤(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制备的饱和标准溶液)用质谱仪去分析滞留与各位点的生物标志或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用质谱仪去分析。对血液进行蛋白质对比分析，用计算机分析血液中质荷比数据。本试剂盒依据几个特征蛋白峰3974、3398、13761±15Da，双盲测试鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)阴性表达宫颈癌体外样品的敏感性100％，特异性93.75％。2.权利要求l所述的蛋白质分析方法，所用的基质包括阴离子、疏水作用吸附剂。3.权利要求2中所用吸附剂的支持物是磁珠或芯片。4.一种权利要求l所述的检测试剂盒，其特征在于，它包括一容器以及装于容器中的权利要求1所述的生物样品。将生物样品分装100^1—小管，于一80'C储存或取生物样品l:2稀释于-一小管U9缓冲液(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0)，25°C储存。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征于，所述的生物样品为血清或血浆。全文摘要本发明涉及一种用磁珠支持基质的方法捕获体外生物样品中宫颈癌蛋白质组，用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。然后用质谱法进行分析的蛋白指纹法。本发明的方法可用于正常人与鳞状细胞癌抗原阴性宫颈癌体外样品检测和预后判断的蛋白指纹或质谱多肽图谱的试剂盒。本方法准确、方便且快捷。文档编号G01N33/68GK101246176SQ20071000494公开日2008年8月20日申请日期2007年2月13日优先权日2007年2月13日发明者余传定,洋许申请人:许洋;余传定