一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法和应用，该发明利用从人参、西洋参、三七中提纯的活性分子，调整重组人干扰素γ的空间构象，以获得免疫细胞活化试剂。这种细胞因子与人的CD3单抗配合，可以在体外刺激并活化人体免疫细胞。这种活化所得的免疫细胞能够100％的杀灭癌细胞，并能观察到明确的免疫细胞附着杀伤现象。
【专利说明】一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤生物免疫治疗领域，尤其是涉及一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]癌症是一个尚待解决的医学难题。癌症治疗长期依赖放化疗，其毒副作用大，疗效也不彻底。这种局面与放化疗的研究体系有关系:放化疗对癌细胞和正常细胞不具选择性，为了保全正常细胞，药物浓度或者射线剂量就必须控制，不能太高，而这样的做法显然也给癌细胞的逃脱大开方便之门。这种模式决定了放化疗的效果肯定是不彻底的。为了能够评价各种具体药物的优劣，设计出了抑瘤率(tumor inhibitory rate)这个指标。
[0003]抑瘤率是癌细胞杀伤效果评估体系中唯一一个量化指标。通过对比实验组和对照组癌细胞的数量来评估杀伤效果。例如，假设实验组(自由生长)和对照组(药物抑制)中癌细胞初始数量都是10，我们在实验组中加化疗药物，再让两组癌细胞共同生长2-3天，如果对照组癌细胞数量长到100，实验组癌细胞数量长到40，那么抑瘤率=(100-40)/100=60%。抑瘤率如实反应了药物对癌细胞生长速度的抑制，但是实验组癌细胞数量毕竟从10增加到40，这与我们的期望值有明显差距一一杀伤后癌细胞数量至少要在初始数量10的基础上减少才称得上治疗有效。然而抑瘤率允许实验组癌细胞数量在初始数量的基础上继续生长，那么其所能描述的效果明显比我们的期望值低了一个水准。特别的，因为放化疗只能短暂进行，血药无法像体外试验一样连续几天维持在高浓度，大大影响了实际效果；必需的治疗间歇期无疑在放任癌细胞自由生长。
[0004]以上分析暴露了放化疗效果不彻底的原因，也说明了当前肿瘤治疗的实际水平。以抑瘤率来评估效果的治疗方法实际价值并不大，我们需要一个在不破坏正常细胞的前提下，能实际杀灭癌细胞的方法，最理想条件下，做到100%杀灭癌细胞。
[0005]鉴于放化疗的不彻 底性和过大的毒副作用，肿瘤的生物免疫疗法越来越受重视。免疫学上已经确认，人体的淋巴细胞在清除病变和变异细胞中发挥主要作用，从中衍生出一种思路是，增加淋巴细胞的数量或许能达到一定疗效。1980年美国学者Rosenberg报道的 LAK(Lymphokine Activated Killer cells)是这种思路的源头。
[0006]LAK的出现与IL-2的发现息息相关。1976年T淋巴细胞生长因子(TCGF，T CellGrowth Factor)被发现，这种细胞因子能够促使淋巴细胞生长。1979年TCGF被统一定名为IL-2。1980年Rosenberg即提出用大剂量的IL-2诱导淋巴细胞增殖，并将其用于癌症治疗，这就是LAK的概念。
[0007]LAK并未取得有益疗效，人们将其归咎于LAK技术中淋巴细胞增殖的倍数(20-40倍)不够。一直到1991年和1993年，美国斯坦福大学学者两次报道，通过抗人⑶3单克隆抗体(ant1-⑶3)、IL-2和IL-12的联合刺激，连续培养21天后，淋巴细胞数量可以增殖1000倍(考虑到细胞活力会降低，实际上仅培养14天，大约增殖200倍)，这就是CIK(Cytokine Induced Killer)的概念。[0008]CIK完全继承了 LAK的思想，即通过增加淋巴细胞的数量达到疗效，这种思想产生的同时就埋下隐忧:难道提高了数量就能解决实际问题吗？不过相对于LAK而言，较大的增殖倍数仍然使CIK具备了可操作性:如今CIK技术已经是目前肿瘤生物免疫治疗的主要内容了。
[0009]相对于放化疗，没有毒副作用是CIK技术明显的优点。用于培养的淋巴细胞一般都来源于患者本人(少数来源于脐带血，属于异体来源)，增殖之后的细胞基因也完全复制于患者本人，其所编码的蛋白当然也与患者体内一致。CIK技术属于典型的“自体免疫细胞治疗”技术，对自身细胞耐受(不伤害自体正常细胞)，也不会引发过敏反应，因此基本没有毒副作用。“自体免疫细胞治疗”在逻辑上属于自体细胞移植。
[0010]在效果上，CIK技术只能作为放化疗的“补充”。这种差强人意的评价根源于CIK技术以数量为主导的，不够成熟的治疗思想。CIK对癌细胞的杀伤效果，延用放化疗的指标抑瘤率来描述，允许实验组的癌细胞数量在原有基础上继续生长。至今还未有人直接观察到，CIK的“杀伤”过程如何完成，各种对CIK效应机制的假设性描述并不能平息人们对CIK实际能力的猜疑:即CIK细胞分泌的细胞因子确实可能使癌细胞的生长速度得到部分抑制，但CIK细胞杀伤癌细胞还远远没有成为事实。
[0011]非常明显，以数量为主导的CIK技术不能概括淋巴细胞的全部能力。我们所了解的免疫系统本应具备十分强大的功能，比如普通感冒可以在三四天内完全自愈，比如器官移植排斥那强烈的彻底的排斥效果。免疫学研究也早已明确一个真正的细胞杀伤过程具备3个时相:接触相、打击相、裂解相，并且找到了实现这一系列功能的分子基础【穿孔素(perforin)和颗粒酶(granzymes)】,那么这整个杀伤过程,特别是附着(接触)现象必然就是一个在显微镜下可观察的特征，这些特点在CIK技术上看不到一点影子(邢宏等，《细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的基础与临床研究新进展)》，中国免疫学杂志，2011年第27卷)。很显然当前以CIK技术为代表的肿瘤免疫细胞治疗技术还远远不够，在以数量为主导的思想之外，我们需要寻找一种更为理想的免疫细胞激活技术，这种技术不能再以抑瘤率来评价效果，而必须具备更 客观的、可直接观察的杀伤癌细胞的能力，从而构建一个确实有效的肿瘤免疫细胞治疗方法。
【发明内容】
[0012]本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法和应用。
[0013]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0014]一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下工艺步骤:
[0015]a、将五加科植物人参、西洋参、三七作为原药清洗、烘干、粉碎后，将其与无水乙醚溶液按固液比1: 2-5置于密封容器中，常温浸泡12天-32天，得到浸提液，这里，无水乙醚为无色透明易挥发的液体，有芳香刺激性气味，无水乙醚熔点-116.3°C，沸点34.6°C，折射率1.353，密度0.713—0.715g/ml (20 °C )，无水乙醚微溶于水，易溶于盐酸，能与醇、醚、石油醚、笨、氯仿等有机溶剂混溶；
[0016]b、将浸提液用纱布过滤以去除杂质，在不大于33°C的情况下用旋转蒸发仪蒸出乙醚溶液得到浓缩液，亦或是在自然环境下通过乙醚挥发而得到浓缩液；
[0017]C、将浓缩液与解离溶液按体积比1: 2-3混合萃取，当分层的乙醚消失时，溶质完全溶解于解离溶液中，制得溶液A，以解离溶液作为空白对照，测定并记录溶液A在278nm波长下的吸光度值M,并用220um滤膜过滤除菌，得到溶液A'；
[0018]对溶液A'取样，并根据其在278nm下的吸光度值M，用pH为7的等渗磷酸盐缓冲液稀释至吸光度值等于0.01后，用家兔做多点皮试，如皮试结果为阴性则溶液A'属合格品;
[0019]d、解离变构:
[0020](dl)根据溶液A'在278nm波长下的吸光度值M，将步骤c的解离溶液滴入溶液K'进行稀释，直至溶液A'被稀释至吸光度值等于0.003，并于4-8°C下轻柔搅拌，得到溶液B ；
[0021](d2)取重组人干扰素Y或由人体免疫细胞分泌的干扰素Y按一定比例逐滴加入溶液B中，并轻柔搅拌5分钟，制得溶液C，这里的计算比例为:每毫升解离溶液配比干扰素800 -6000 万 IU ；
[0022](d3)将溶液C注入规格为:宽11.5mm，容积lml/cm，截留分子量为10000的透析袋中，不留空隙，并抓紧透析袋，避免渗漏，然后将透析袋悬垂于4-8°C的复性溶液中，复性溶液体积为透析袋内溶液体积的50倍，轻柔搅拌，4小时后更换新鲜复性溶液，过夜，待透析袋内溶液PH平衡至7.2，使干扰素Y复性；
[0023]e、吸取步骤d3中透析袋内的溶液，直接滴注于凝胶过滤层析柱中，开始层析分离；
[0024]层析柱高I米,选用凝胶SephadexG-25或G-50,层析柱置于4°C中，采用复性溶液作为洗脱液，自动部分收集器收集B峰流出液，测定B峰流出液在280nm下的吸光度值N，用复性溶液按比例将B峰流出液稀释至浓度为Q的溶液D，然后用220um的灭菌针尖滤器对溶液D过滤除菌，制得变构的干扰素Y ；
[0025]需要说明的是，变构干扰素Y是否制备成功，可以通过凝胶过滤层析时，自动部分收集器记录的特征吸收曲线来确认，这属于成熟的现有技术，在此不再赘述。
[0026]f、组合成活化人体免疫细胞的试剂:活化人体免疫细胞的试剂包括变构的干扰素Y和ant1-CD3，利用两种细胞因子的共同刺激以激活免疫细胞。
[0027]所述原药为人参、西洋参、三七三种五加科植物之一或其组合，根、茎、花均可，优选三年生以上春三七的根，其处理工艺最简单，提取产物的质量最为稳定。
[0028]所述解离溶液含L-甘氨酸、L-精氨酸和N-甘氨酰-L-谷氨酰胺，并用盐酸滴定至 pH4.8。
[0029]所述溶液B的配制体积V与层析柱直径D的关系为:当层析柱直径D为3cm，则溶液B的配制体积V为10-25ml ;当层析柱直径D为4cm，则溶液B的配制体积V为15-45ml ;当层析柱直径D为5cm，则溶液B的配制体积V为20-70ml。
[0030]步骤d2中计算比例为:
[0031]每毫升解离溶液配比干扰素3000万IU,重组人干扰素Y比活为1.6X 107IU/mg。
[0032]所述复性溶液为pH为7.2，0.15M的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液含甘露醇。
[0033]活化人体免疫细胞的试剂是活化人体免疫细胞以及肿瘤免疫细胞治疗中较好的-1r 口
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[0034]蛋白质的空间结构又称为三维结构或构象(conformation),是在不改变氨基酸序列的前提下，肽链在三维空间的分布方式。特定的空间构象是蛋白质发挥功能的结构基础，构象改变将使蛋白质功能发生变化，甚至丧失原有活性。本发明描述的是一项通过改变干扰素Y的空间构象，从而促进其活化性能的技术。
[0035]干扰素Y是II型干扰素中的唯一成员，主要起免疫调节作用，可以促进ThO细胞分化为Thl细胞(增强细胞免疫应答)，抑制Th2细胞增殖(抑制体液免疫应答)；促进细胞毒性T淋巴细胞成熟及杀伤活性。目前干扰素Y主要通过基因重组的大肠杆菌获得，即重组人干扰素Y，并已制成注射针剂用于病毒感染和癌症治疗。然而实际运用中，我们能够得到的干扰素Y对免疫细胞的刺激效果并不如上述那么强大，因此，我们就从探究干扰素Y的效应机制入手。
[0036]人参皂苷(Ginsenoside，GS)是一种固醇类化合物，是从五加科植物(人参、西洋参、三七)根、茎、叶中提取的主要活性成分，包含一组结构类似的，难以继续分离的单体分子，现已明确知道的GS单体约有40余种。人参皂苷被视为是人参中的活性物质，并且具有增加白细胞数量、提高人体免疫力、促进物质代谢、抗疲劳、抗衰老等作用。由于人参皂苷成分复杂，各种单体的效能难以分离研究，人们对人参皂苷的认识仍然存在诸多盲点。
[0037]本发明正是从上述两类物质的研究中延伸而来的。本发明利用人参皂苷的分子结构特性调整重组人干扰素Y的空间构象，所获得的新的蛋白因子具备比原来的干扰素Y更为强大的细胞刺激效能。这种新的蛋白因子与抗人CD3单抗配合，作为一种活化试剂，被用于激活人体免疫细胞。激活的结果，免疫细胞将具备100%杀灭癌细胞的能力，并且能在显微镜下观察到典型的细胞附着`杀伤现象，最终癌细胞完全消失。通过本项发明，我们可以构建一个确实有效的肿瘤免疫细胞治疗方法。
[0038]在本发明中，由于免疫细胞杀灭癌细胞的效果已经远远超过杀瘤率所能够描述的效果，因此不再以杀瘤率作为效果评估的指标。本发明中将以癌细胞完全消失或者基本消失，并且在显微镜下直接观察到明确的杀伤行为，作为有效杀伤的依据。可以肯定的是，如果癌细胞完全消失或者接近完全消失，抑瘤率总是100%或者接近100%。在这种高效杀伤的情况下，抑瘤率已经失去了评价的意义。所以，采用显微镜直接观察评估杀伤效果，是本发明区别于以往同类技术的显著特征。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为活化试剂的制备及免疫细胞的活化方法流程图。
[0040]图2为典型的层析收集峰(280nm)示意图。
[0041]图3为实施例1中癌细胞被杀伤4小时的效果观察图。
[0042]图4为实施例1中癌细胞被杀伤6小时的效果观察图。
[0043]图5为实施例1中癌细胞被杀伤12小时的效果观察图。
[0044]图6为实施例1中癌细胞被杀伤24小时的效果观察图。
[0045]图7为实施例2中癌细胞被杀伤6小时Gemsa染色观察图一。
[0046]图8为实施例2中癌细胞被杀伤6小时Gemsa染色观察图二。【具体实施方式】
[0047]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
[0048]实施例1:一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法，其具有如下步骤(参见图1):
[0049](I)原药筛选。本发明所述及的原料药包括五加科三种植物全株:人参、西洋参、三七，根、茎、花均可，优选三年生以上春三七的根，其处理工艺最简单，提取产物的质量最为稳定。将三七根切片，厚约2~3mm,晒干。
[0050](2)乙醚浸提。称取晒干三七片500克,用2L医用无水乙醚浸泡大于2周，一般浸泡时间为一个月。容器需密封，置于阴凉处，防止乙醚挥发。
[0051]原药与乙醚比例，以及浸泡时间并非决定最终效果的关键，上述比例数据是一种优化。乙醚过少，浸泡时间太短，则每次提取所得太少。三七片可反复用于浸提，但每次浸提所得会减少，因此不要超过5次。
[0052]各种市售的加工制成品，如三七粉，三七总皂苷，人参总皂苷等，在本发明中难以达到效果，可能是浸提工艺的差别所致。一般而言，在上述加工制成品的生产中，为了简化工艺，控制成本和得到最大的提取率，不会采用乙醚浸提，通常采用水或含水乙醇作为溶剂(王忠全，《三七总皂苷提取工艺进展》，中医药导报，第15卷第9期，2009年9月)。
[0053](3)旋转蒸发。取上述乙醚浸提液，用医用纱布过滤，去除杂质，采用旋转蒸发仪浓缩至200ml。设置旋转蒸发仪的恒温锅温度不大于33°C (乙醚沸点34.6°C )。采用旋转蒸发仪是为了提高浓缩速度。如果乙醚沸腾，可能降低提取物质的最终效能，而且可能产生危险，因为乙醚蒸汽易燃易爆。也可以通过乙醚自行挥发得到有效提取物，但耗时长，所用乙醚无法回收，需要充分的通风条件，否则容易造成危险。
[0054](4)水相萃取。将蒸发浓缩的乙醚溶液与400ml解离溶液混合萃取。达到平衡之后，分层的乙醚溶液可以回收至旋转蒸发仪，继续浓缩，然后返回再次混合萃取。也可以让乙醚自行挥发浓缩，通过加热至33°C以加速挥发。
[0055]解离溶液含L-甘氨酸、L~精氨酸和N-甘氨酰-L-谷氨酰胺，pH4.8，以下是优化配方:
[0056]
【权利要求】
1.一种活化人体免疫细胞的试剂制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下工艺步骤: a、将五加科植物人参、西洋参、三七作为原药清洗、切片、晒干后，将其与无水乙醚溶液按固液比1: 2-5置于密封容器中，常温浸泡12天-32天，得到浸提液； b、将浸提液用纱布过滤以去除杂质，在不大于33°C的情况下用旋转蒸发仪蒸出乙醚溶液得到浓缩液，亦或是在自然环境下通过乙醚挥发而得到浓缩液； C、将浓缩液与解离溶液按体积比1: 2-3混合萃取，当分层的乙醚挥发消失，溶质完全溶解于解离溶液中，获得溶液A，以解离溶液作为空白对照，测定并记录溶液A在278nm波长下的吸光度值M，并用220um滤膜过滤除菌，得到溶液A'； 对溶液A'取样，并根据其在278nm下的吸光度值M，用pH为7的等渗磷酸盐缓冲液稀释至吸光度值等于0.01后，用家兔做多点皮试，如皮试结果为阴性则溶液A'属合格品； d、解离变构: (dl)根据溶液A'在278nm波长下的吸光度值M,将步骤c的解离溶液滴入溶液A'进行稀释，直至溶液A'被稀释至吸光度值等于0.003,并于4-8°C下轻柔搅拌，得到溶液B ； (d2)取重组人干扰素Y或由人体免疫细胞分泌的干扰素Y按一定比例逐滴加入溶液B中，并轻柔搅拌5分钟，制得溶液C，这里的计算比例为:每毫升解离溶液配比干扰素800 -6000 万 IU ； (d3)将溶液C注入规格为:宽11.5mm，容积lml/cm，截留分子量为10000的透析袋中，不留空隙，并扎紧透析袋，避免渗漏，然后将透析袋悬垂于4-8°C的复性溶液中，复性溶液体积为透析袋内溶液体积的50倍，轻柔搅拌，4小时后更换新鲜复性溶液，过夜，待透析袋内溶液PH平衡至7.2，使干 扰素Y复性； e、吸取步骤d3中透析袋内的溶液，直接滴注于凝胶过滤层析柱中，开始层析分离； 层析柱高I米，选用凝胶S印hadexG-25或G-50，层析柱置于4°C中，采用复性溶液作为洗脱液，自动部分收集器收集B峰流出液，测定B峰流出液在280nm下的吸光度值N，用复性溶液按比例将B峰流出液稀释至浓度为Q的溶液D，然后用220um的灭菌针尖滤器对溶液D过滤除菌，制得变构的干扰素Y ； f、组合成活化人体免疫细胞的试剂:活化人体免疫细胞的试剂包括变构的干扰素Y和ant1-CD3，利用两种细胞因子的共同刺激以激活免疫细胞。
2.如权利要求1所述的试剂制备方法，其特征在于，所述原药为人参、西洋参、三七三种五加科植物之一或其组合。
3.如权利要求1所述的试剂制备方法，其特征在于，所述解离溶液含L-甘氨酸、L-精氨酸和N-甘氨酰-L-谷氨酰胺，并用盐酸滴定至pH4.8。
4.如权利要求1所述的试剂制备方法，其特征在于，所述溶液B的配制体积V与层析柱直径D的关系为:当层析柱直径D为3cm，则溶液B的配制体积V为10-25ml ;当层析柱直径D为4cm，则溶液B的配制体积V为15-45ml ；当层析柱直径D为5cm，则溶液B的配制体积V为20-70ml。
5.如权利要求1所述的试剂制备方法，其特征在于，步骤d2中计算比例为: 每毫升解离溶液配比干扰素3000万IU，重组人干扰素Y比活为1.6X 107IU/mg。
6.如权利要求1所述的试剂制备方法，其特征在于，所述复性溶液为pH为7.2,0.15M的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液含甘露醇，复性溶液配方为:
NaH2PO4.12H20 38.688g/L ；
Na2HPO4.2H20 6.552g/L ； 甘露醇50g/L。
7.如权利要求1的试剂制备方法制备到的活化人体免疫细胞的试剂在活化人体免疫细胞以及肿瘤免疫细胞治疗中的应用。
【文档编号】A61K36/258GK103446207SQ201310010980
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2013年1月11日
【发明者】王艳红, 燕山 申请人:上海禾易生物技术发展有限公司