一种高活性cik细胞的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高活性CIK细胞的制备方法，该方法采用多级、分步培养的方式，对外周血单个核细胞进行培养制备高活性的CIK细胞。使用本发明的CIK细胞制备方法制得的CIK细胞具有较强的增殖能力，较高的细胞毒活性，具有更佳的肿瘤杀伤效率。本发明还公开了使用该方法制备的CIK细胞在制备药物中的应用，该药物可以用于治疗肿瘤或免疫相关疾病。
【专利说明】
一种高活性ClK细胞的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种高活性CIK细胞的制备方法及通过该方 法制备的CIK细胞。
【背景技术】
[0002] 过继性细胞免疫治疗（Adoptive Cellular Immunotherapy，ACI 或 ΑΙΤ)是指向 肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤或激活机体的免疫应答杀肿瘤细 胞。该疗法可以提高肿瘤的治疗效果和改善患者的生存质量，在临床中可以作为手术、放 疗、化疗的有效补充。
[0003] 国内外在临床应用的自体免疫细胞治疗肿瘤，主要是细胞因子诱导的杀伤细胞 (Cytokine-Induced Killer Cell, CIK)、树突状细胞（Dendritic Cell, DC)、自然杀伤细 胞（Natural Killer Cell, NK)等。CIK细胞最初是指在正常人体外周血中只占1-5%的 ⑶3+⑶56+T淋巴细胞。临床应用的CIK细胞是将人体外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)在体外用多种细胞因子共同培养而获得的一群以⑶3+⑶56+、 CD3+CD8+、CD4+为主的异质性细胞，是一种高效的具有广谱杀瘤活力的免疫效应细胞，也是 目前国际上公认的最有效的肿瘤生物治疗细胞之一。
[0004] CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、非主要组织相容性复合体 (Major Histocompatibility Complex，MHC)限制性、对正常骨髓造血影响轻微等优点。特 别是对于术后清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重 要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生命 的积极作用。CD3 +CD56+双阳性细胞在正常人体外周血组分中含量极少，体外在含多种细胞 因子的培养基中扩增，可使CD3 +CD56+双阳性细胞数量扩增1000倍以上。目前CIK细胞的 传统制备方法是将分离得到的外周血单个核细胞用干扰素-Y刺激24小时后，再用CD3单 抗、IL-1 a、IL-2等因子进行刺激但是由于CIK细胞中⑶3+、⑶4+、⑶8+的T细胞含量低、细 胞活力和肿瘤杀伤能力低，对肿瘤的治疗效果十分有限。因此本领域技术人员仍致力于开 发一种提高CIK细胞毒活性的技术。
【发明内容】
[0005] 本发明目的之一是提供一种高活性CIK细胞的制备方法。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种通过上述方法制备的高活性CIK细胞在肿瘤治疗 中应用。
[0007] 本发明的第一方面，提供了一种高活性CIK细胞的制备方法，其中，采用多级、分 步培养的方式，对外周血单个核细胞进行培养制备高活性的CIK细胞。
[0008] 优选地，所述的高活性CIK细胞的制备方法包括以下步骤：
[0009] (1)制备CIK前期细胞
[0010] 分选去除外周血单个核细胞中的⑶4+⑶25+Treg细胞，得到CIK前期细胞；
[0011] (2)初级培养
[0012] 将CIK前期细胞置于初级细胞培养液培养18-24小时，
[0013] 其中，初级细胞培养液中加入：PHA70-150ng/ml、IL-21 10-30ng/ml、 IL-63〇-60ng/ml ；
[0014] (3)二级培养
[0015] 加入⑶3单克隆抗体l-5ug/ml、IFN- γ 700-1200U/ml，进行二级培养，培养时间为 40-60小时；
[0016] ⑷三级培养
[0017] 加入 IL-1720-30ng/ml、IL-12 20-40ng/ml，进行三级培养，培养时间为 72-96 小 时；
[0018] (5)四级培养
[0019] 补充含有吐温-80 0· 1-lug/ml、胰岛素0· 5-2ug/ml的培养液，进行四级培养，培 养时间为6-10天。
[0020] 优选地，步骤⑵中初级细胞培养液中PHA浓度为90-120ng/ml、IL-21浓度为 20-25ng/ml、IL-6浓度为40-50ng/ml ;更优选地，步骤（2)中初级细胞培养液中，PHA浓度 为 100ng/ml、IL-21 浓度为 20ng/ml、IL-6 浓度为 40ng/ml。
[0021] 优选地，步骤（3)中加入CD3单克隆抗体2ug/ml、IFN- γ 1000U/ml。
[0022] 优选地，步骤（4)中加入 IL-17 25ng/ml、IL-12 30ng/ml。
[0023] 优选地，步骤（5)中补充培养液中含有吐温-80 0· 5ug/ml、胰岛素 lug/ml。
[0024] 优选地，步骤（2)-(5)中的培养的条件均为37°C、5% C02的培养条件。
[0025] 优选地，步骤（2)中的初级细胞培养液选自：X-VIV0无血清细胞培养液或AM-V 无血清细胞培养液。在其他实施方式中，也可以使用本领域中常用的其他细胞培养液。
[0026] 上述个步骤中所涉及的浓度均为终浓度。
[0027] 在本发明的第二方面，提供了上述方法制备的CIK细胞在制备药物中的应用，所 述药物用于治疗肿瘤或免疫相关疾病。
[0028] 优选地，所述肿瘤包括：B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、 结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和宫颈癌细 胞。
[0029] 技术效果
[0030] 本发明在细胞培养液加入IL-21和IL-6培养外周血单个核细胞，能够显著抑制外 周血单个核细胞向⑶4+⑶25+Treg细胞的分化。
[0031 ] 本发明在CIK细胞培养4天的最后阶段使用含吐温-80和胰岛素的细胞培养液进 行细胞培养，能够有效的促进CIK细胞的增殖，显著地缩短了 CIK细胞的培养时间，并增加 了细胞毒活性。
[0032] 通过本发明的方法制备的CIK细胞具有较高的毒活性，较强的增殖能力，明显的 缩短了 CIK细胞的制备时间。提高了临床效率，增强了 CIK细胞治疗的疗效。
[0033] 以下将结合实施例对本发明作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和 效果。
【附图说明】
[0034] 图1显示了本发明实施例中制备的CIK细胞的增殖倍数。
[0035] 图2显示了本发明实施例中CIK细胞对K562的杀伤率。
【具体实施方式】
[0036] 实验方法
[0037] 制备外周血单个核细胞（PBMC)
[0038] 采用本领域常规的Ficoll密度梯度法制备外周血单个核细胞（PBMC)。将人抗凝 血1500rpm离心15分钟后，吸取上层血浆，56°C灭活30分钟，4°C静置30分钟后3000rpm 离心8min，去除沉淀，4°C保存待用。
[0039] 用生理盐水稀释血细胞沉淀，比重为1.077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1 : 2 的比例加入离心管中，2000rpm离心20分钟，抽取白细胞层，用生理盐水清洗两次，低速离 心后得到PBMC。
[0040] 活细胞数检测
[0041] 取培养第偶数天的（如第2、4、6、8、10、12、14、16天）的CIK细胞100ul，加入 lOOulO. 4%胎盘蓝染色液，死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。计算活细胞率。
[0042] CIK细胞增殖力检测
[0043] 取不同培养天数的100ul的细胞，分别加入检测用鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、 ⑶8-PE、⑶56-APC抗体10ul，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤两次，流式细胞仪检测 计算细胞扩增倍数。
[0044] 检测CIK细胞的细胞毒活性
[0045] CIK细胞按效靶比例2.5 : 1、5 : 1、10 : 1、20 : 1、40 : 1加入K562肿瘤细胞株 (购自武汉普诺赛生命科技有限公司）细胞接种24小时的96孔板内，共同培养24小时后加 入新鲜配制的5mg/ml的ΜΤΤΙΟμ 1，共同培养4小时，离心吸弃上清液，每孔加 DMSOlOOy 1 振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对 照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算效 应细胞的细胞毒活性，杀伤率（％) =[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A 值）]/靶细胞对照A值X 100 %。
[0046] 实施例1制备高活性CIK细胞
[0047] (1)去除 CD4+CD25+Treg 细胞（Mini MACS 磁珠分离柱）
[0048] 取PBMC细胞悬液调整到适宜的细胞浓度，加入PE-labeled AntiHuman CD25,4°C 孵育30min后取出，PBS离心洗涤3次后，加入Anti-PE磁珠，4°C孵育30min，过MACS柱，洗 脱液为去除Treg细胞的⑶3 +、⑶4+、⑶8+的CIK前期细胞。
[0049] (2)将得到的 CIK 前期细胞，置于含有 PHA(100ng/ml)、IL-21 (20ng/ml)、 IL-6(40ng/ml)的初级细胞培养液中，37°C，5% C02的培养箱中孵育24小时。
[0050] (3)加入 CD3 单抗（2ug/ml)，IFN- γ (1000U/ml)，37°C，5% C02 的培养 48 小时。
[0051] (4)加入 IL-17 (25ng/ml)、IL-12 (30ng/ml)，37°C，5% C02 的培养 96 小时。
[0052] (5)补充含有吐温-80终浓度0· 2ug/ml、胰岛素 lug/ml的培养基继续培养9天， 得到高细胞毒活性的CIK细胞。
[0053] 实施例2
[0054] 按照实施例1中的方法进行CIK细胞的制备，不同点在于，在步骤（2)细胞培养液 中不添加 IL-21。
[0055] 实施例3
[0056] 按照实施例1中的方法进行CIK细胞的制备，不同点在于，在步骤（4)细胞培养液 中不添加 IL-17。
[0057] 实施例4
[0058] 按照实施例1中的方法进行CIK细胞的制备，不同点在于，在步骤（5)细胞培养液 中不添加吐温-80。
[0059] 实施例5
[0060] 按照实施例1中的方法进行CIK细胞的制备，不同点在于，在步骤（5)细胞培养液 中不添加胰岛素。
[0061] 实施例6
[0062] 按照中国专利CN201110036490. 7中记载的方法进行CIK细胞的制备。
[0063] 实施例7 :CIK细胞的活性检测
[0064] (1)活细胞数检测
[0065] 活细胞数检测结果如下表所示：
[0066]
[0067] 从上表中可以看出，实施例1中采用本发明的方法制备CIK细胞，活细胞率要由于 实施例2-6中的对照组。实施例4、5中的数据表明，胰岛素的添加对培养后期的细胞存活 较为关键，在不添加胰岛素仅添加吐温-80的实施例5中，活细胞率最低；仅添加胰岛素不 添加吐温-80的实施例4中，细胞存活率也较低。而同时添加吐温-80和胰岛素的实施例 1中，细胞存活率最高，说明吐温-80和胰岛素的同时存在有助于提高培养后期的CIK细胞 的存活率。
[0068] (2) CIK细胞增殖力检测
[0069] 取培养第16天的CIK细胞计数，实验结果如图1所示，实施例1中制备的细胞中 CIK细胞扩增倍数为1312倍，远高于实施例2-5中CIK细胞的扩增倍数。
[0070] (3)细胞毒活性检测
[0071] 实验结果表明，本发明实施例1制备的CIK细胞效靶比为5 : 1时K562细胞的杀 伤活性达到87%，10 : 1时对K562细胞的杀伤活性达到96%。而实施例2-6中制备的CIK 细胞，效靶比为10 : 1时的杀伤率分别为83%、74%、81%、77%、86%(图2)。
[0072] 以上结果说明，使用本发明的方法制备CIK细胞，增殖能力强、所得细胞活性高， 具有更佳的肿瘤杀伤效率。
[0073] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的 技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种高活性CIK细胞的制备方法，其特征在于，采用多级、分步培养的方式，对外周 血单个核细胞进行培养制备高活性的CIK细胞。2. 如权利要求1所述的方法，包括以下步骤： (1) 制备CIK前期细胞 分选去除外周血单个核细胞中的⑶4+⑶25+Treg细胞，得到CIK前期细胞； (2) 初级培养 将CIK前期细胞置于初级细胞培养液培养18-24小时， 其中，初级细胞培养液中加入：PHA 70-150ng/ml、IL-21 10-30ng/ml、IL-6 30-60ng/ ml ； (3) 二级培养 加入⑶3单克隆抗体l-5ug/ml、IFN- γ 700-1200U/ml，进行二级培养，培养时间为 40-60小时； (4) 三级培养 加入IL-17 20-30ng/ml、IL-12 20-40ng/ml，进行三级培养，培养时间为72-96小时； (5) 四级培养 补充含有吐温-80 0. 1-lug/ml、胰岛素0. 5-2ug/ml的培养液，进行四级培养，培养时 间为6-10天。3. 如权利要求1所述的方法，步骤⑵中初级细胞培养液中PHA浓度为90-120ng/ml、 IL-21浓度为20-25ng/ml、IL-6浓度为40-50ng/ml ;更优选地，步骤（2)中初级细胞培养液 中，PHA 浓度为 100ng/ml、IL-21 浓度为 20ng/ml、IL-6 浓度为 40ng/ml。4. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（3)中加入CD3单克隆抗体2ug/ml、 IFN-γ1000U/ml〇5. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（4)中加入IL-17 25ng/ml、IL-12 30ng/ml。6. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（5)中补充培养液中含有吐温-80 0.5ug/ml、 胰岛素 lug/ml。7. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（2)-(5)中的培养的条件均为37°C、5% CO2的 培养条件。8. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（2)中的初级细胞培养液选自=X-VIVO无血清 细胞培养液或A頂-V无血清细胞培养液。9. 上述任一项权利要求所述的方法制备的CIK细胞在制备药物中的应用，所述药物用 于治疗肿瘤或免疫相关疾病。10. 如权利要求9所述的应用，其中所述肿瘤为：B淋巴细胞肿瘤、白血病、肺癌胞、胃 癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌或宫颈癌。
【文档编号】A61P35/00GK105886467SQ201410442771
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年8月27日
【发明人】杨钟华
【申请人】瑞安市普罗生物科技有限公司