一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，成分包括，细胞因子组合、α?MEM培养液、胰岛素、转铁蛋白、BMP?4、BOP1、FGF?2和AMD3100。所述细胞因子组合包括IL?3，IL?6，SCF和FL，浓度分别为：IL?3 1?20ng/ml；IL?6 1?100ng/ml；SCF 1?100ng/ml；FL 1?100ng/ml。通过研发无血清培养基、改变造血因子的加入顺序，解决目前脐带血间充质干细胞培养基现有技术的弊端。
【专利说明】
一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物领域，尤其涉及一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基。
【背景技术】
[0002] 脐带血间充质干细胞(UCB-MSCs)具有较好的分化潜能，可在骨、软骨、肌肉、神经、 肝脏、心肌等组织工程方面具有广阔的临床前景。脐带血间充质干细胞可从人脐带中分离 出来，具有取材方便，无伦理学争议的优点。脐带血间充质干细胞具有较强的免疫调节作 用，能促进造血恢复功能和修复病变组织器官，在器官移植、自身免疫性疾病、白血病、骨和 肌肉衰退性疾病等方面，有很高的临床应用价值。
[0003] 而脐带血间充质干细胞培养如何实现快速扩增又不影响其功能是脐带血间充质 干细胞培养的关键，然而现有技术中培养脐带血间充质干细胞技术不够成熟，表现在细胞 的增殖速度慢和传代次数较低。
[0004] 现有的脐带血间充质干细胞培养基需要添加动物血清，在这种环境生长的干细 胞，其内部结构可能会发生一些未知的变换，动物血清也可能会引发免疫排斥反应，甚至有 被细菌、病毒等病原微生物污染的风险，不利于干细胞的临床应用和基础研究。
[0005] 脐带血间充质干细胞的增值分化、发育成熟过程相当复杂，依赖于各种造血因子 的调节，其中细胞刺激因子发挥的作用极为关键。m型酪氨酸激酶受体配体(flt3-ligand FL)是最近几年发现的一种调节早期造血的细胞因子，主要生物活性表现为刺激早期脐带 血间充质干细胞的增值与分化。白细胞介素3(Int erleukin3IL-3)有利于脐带血干细胞的 生长和活性维持，然而对脐带血间充质干细胞早期增值分化有抑制效应。
[0006] 通过研发无血清培养基、改变细胞因子的加入顺序，研究脐带血间充质干细胞体 外培养的无血清培养基，解决目前脐带血间充质干细胞培养基现有技术的弊端。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种无血清的脐带血间充质干细胞培养基。
[0008] 为实现本发明的目的，本发明提供了以下技术方案：
[0009] -种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，成分包括，细胞因子组合、α-ΜΕΜ培养 液、胰岛素、转铁蛋、BMP-4、BOP 1、FGF-2 和 AMD3100。
[0010] 所述细胞因子组合包括IL-3，IL-6，SCF和FL，浓度分别为：IL-3 l-20ng/ml; IL-6 l-100ng/ml；SCF l-100ng/ml；FL l-100ng/ml〇
[0011] 转铁蛋白的浓度为0.05-0.15μg/ml; BMP-4的浓度为0.05-0.15ng/ml;所述B0P1浓 度为l-10mg/ml;其特征在于所述FGF-2浓度为5-15ng/ml;所述AMD3100浓度为l-15mg/ml。
[0012] 胰岛素浓度为5-15μg/ml。
[0013] 所述所述α-ΜΕΜ培养液包含0.03-0.04mmol/L脱氧核糖核苷和40-70nmol/L核糖核 苷。
[0014] 所述的α-ΜΕΜ培养液包括以下组分:无水氯化钙、无水硫酸铜、九水硝酸铁、七水硫 酸亚铁、氯化钾、氯化镁、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、七水硫酸锌、 L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、次黄嘌呤、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨 酸、L-天门冬酰胺、D-葡萄糖、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色 氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、亚油酸、硫辛酸、酚红、维生素 B12、l，4-丁二胺二盐酸盐、丙酮酸 钠、维生素 H、D-泛酸钙、氯化胆碱、胸苷、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆淳、核 黄素、盐酸硫胺。
[0015]所述的α-ΜΕΜ培养液各组分的浓度为：
[0019] -种脐带血间充质干细胞的无血清培养基的使用方法，培养脐带血间充质干细胞 过程如下:a、在制备好α-ΜΕΜ培养液中按浓度加入胰岛素、转铁蛋白、BMP-4、BOP 1、FGF-2和 AMD3100制作成培养液;b、在24孔板中进行培养，每孔lml培养液，接种所需的脐带血间充质 干细胞，接种密度为1 X l〇5cells/ml，于37°C、5%C02的全饱和湿度下培养;c、培养第一周加 入IL-3+IL-6+SCF;第7天同时加入FL直到第四周结束;第14d起停用IL-3。
[0020] 补充说明
[0021 ] FL是(flt3-ligand)III型酪氨酸激酶受体配体；
[0022] IL-3 是 Interleukin3 白细胞介素 3;
[0023] IL-6 是 Interleukin6 白细胞介素 6;
[0024] SCF是stem cell factor干细胞因子；
[0025] BMP-4是Bone Morphogenetic Protein骨形态发生蛋白4;
[0026] α-ΜΕΜ是改良型杜尔伯科极限必需培养基；
[0027] FGF-2是Fibroblast Growth Factor 2成纤维细胞生长因子2;
[0028] FBS是胎牛血清；
[0029] 凋亡率=凋亡阳性的细胞数/细胞总数X 100%。
[0030] 有益效果:本发明通过研发无血清培养基，即培养基中不加胎牛血清，从而避免了 临床应用中可能产生的免疫排斥反应，减少了病原微生物污染的风险;通过改变造血因子 的加入顺序，可减弱FL对脐带血间充质干细胞早起增值的抑制作用，提高脐带血间充质干 细胞在体外增殖分化的活性，降低细胞凋亡率。
【具体实施方式】
[0031] 按照表格1配制高糖型α-ΜΕΜ培养液 [0032] 表1高糖型α-ΜΕΜ配方表
[0033]
[0034]
[0035] a、配制脐带血间充质干细胞培养液:在α-ΜΕΜ培养液中按浓度加入胰岛素、转铁蛋 白、BMP-4、B0P1、FGF-2和AMD3100制作成脐带血间充质干细胞培养液；
[0036] b、加入细胞因子:实验分成五个组，第一组为不加 IL-3的对照组，第二组为不加 FL 的对照组，第三组为四种细胞因子同时加入，不分先后顺序，第四组为本发明脐带血间充质 干细胞培养方法，第五组为空白对照实验，四种细胞因子均不加，具体情况如下：
[0037] 第一组 IL-6+SCF+FL
[0038] 第二组 IL-3+IL-6+SCF
[0039] 第三组 IL-3+IL-6+SCF+FL
[0040] 第四组培养第一周加入IL-3+IL-6+SCF;第7天同时加入FL直到第四周结束;第14d 起停用IL-3;
[0041 ]其中细胞因子的浓度为IL-3 5ng/ml，IL-6 50ng/ml，SCF 50ng/ml，FL 50ng/ml; [0042] c、接种脐带血间充质干细胞:培养试验在24孔板中进行，每孔lml培养液，接种分 离的脐带血间充质干细胞，接种密度为lX105cell S/ml，于37°C、5%C02的全饱和湿度下培 养。在培养开始及第7天、14天、21天、28天分别计算细胞总数。
[0043]结果统计与分析：
[0044] 脐带血间充质干细胞在不同细胞因子组合刺激下扩增倍数
[0045]
[0046] 结果分析:细胞扩增方面，除了第四组外，其他组合都在培养21d时扩增倍数达到 最高，随后出现下降，且在21d时都小于第四组扩增倍数，第四组的最高扩增倍数为培养28d (9847.2倍)时。说明本发明组合扩增效果最好。
[0047] 脐带血间充质干细胞在不同细胞因子组合刺激下细胞凋亡情况比较（％ )
[0048]
[0049] 结果分析:结果二:在细胞凋亡方面，都在培养至14d达到最高，以后有所下降。第 四组的最高凋亡率为（?=6. 1) %，低于其他组合，说明本发明组合凋亡率最低。
[0050] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：成分包括，细胞因子组合、 α-ΜΕΜ培养液、胰岛素、转铁蛋白、BMP-4、BOPI、FGF-2和AMD31OO。2. 根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于:所述 细胞因子组合包括IL-3，IL-6，SCF和FL，浓度分别为：IL-3 l-20ng/ml; IL-6 l-100ng/ml; SCF l-100ng/ml;FL l-100ng/ml。3. 根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，其特征在:转铁蛋 白的浓度为〇 · 05-0 · 15μg/ml ;BMP-4的浓度为0 · 05-0 · 15ng/ml;所述BOPl浓度为l-10mg/ml; 其特征在于所述FGF-2浓度为5-15ng/ml;所述AMD3100浓度为l-15mg/kg。4. 根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于:胰岛 素浓度为5-15μg/ml。5. 根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于:所述 α-ΜΕΜ培养液包含0.03-0.04mmol/L脱氧核糖核苷和40-70nmol/L核糖核苷。6. 根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于:所述 的α-ΜΕΜ培养液包括以下组分:无水氯化钙、无水硫酸铜、九水硝酸铁、七水硫酸亚铁、氯化 钾、氯化镁、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、七水硫酸锌、L-精氨酸盐酸 盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨 酸盐酸盐、L-蛋氨酸、次黄嘌呤、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰 胺、D-葡萄糖、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨 酸、L-缬氨酸、亚油酸、硫辛酸、酚红、维生素 B12、l，4-丁二胺二盐酸盐、丙酮酸钠、维生素 Η、 D-泛酸钙、氯化胆碱、胸苷、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆淳、核黄素、盐酸硫 胺。7. 根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于:所述 的α-ΜΕΜ培养液各组分的浓度为： 无水氯化钙 90- 1如mg/1 无水硫酸铜 0· 001-0. Q02 mg/:L 九水硝酸铁 0. 07 mg/L 七水硫酸亚铁 0. 3-5: mg/L 氯化钾 3()0-40:0 mg/L 氯化镁 20-35 mg/L 无水硫酸镁 40-60 mg/L 氯化钠 6000-8000 mg/L 无水磷酸二氧钠 45-ffi mg/L. 磷酸氢二钠 6:5-8Θ mg/L 七水硫酸锌 0.4-0. 5： mg/L L-精氨酸盐酸盐 100-200 mg/L L-胱氨酸盐酸盐 20-4Θ mg/L L-谷氨酰胺 3〇0-4卯 mg/L 甘氯酸 IQ-30 mg/L .L·:-亮氨酸 40-(50 ing/L L-赖氨酸盐酸盐 80-100 mg/L L-蛋氨酸 15-22mg/l 次黄嘌呤 1-3 mg/L L-苯丙氨酸 30-4(3 mg/1 L-丝氨酸 20-30 mg/L L-苏氨酸 4?-60 mg/L L_ 丙氨酸 B'-5 mg/L L-天门冬酰胺 .5-1.0 mg/L D-葡萄糖 500-1500 mg/L L-天门冬氨酸 5-7 mg/L L-半胱氨酸盐酸盐 IQ-20 mg/L· L-谷氨酸 5-9 mg/L L-脯氨酸 15-20 mgA L-色氨酸 .8-10 mg/L L-酪氨酸 30-45 mg/L L-缬氨酸 45-55 mg/L 收:油酸 0· 03-0. 05 mg/L 硫辛酸 0· 1-:0., 15 mg./L 酚红 7-10 mg/L 维生素 B12 0. 5-lmg/L 1,4-丁二胺二盐酸盐 0.05-0.1 rag/L 丙酮酸钠 4G-6:0 mg/L 维生素 H 0. :003-0. 04 mg/L D-泛酸钙 2-3 nig/L 氯化胆碱 7-9 mg/L 胸苷 0. _3-0.,_4 m.g/L 叶酸 4 mg/L i-肌醇 .10-20 mg/L 烟酰胺 L 5-2. i liig/L 盐酸吡P多醛 1-3 mg/'L 盐酸吡哆淳 G. 0:2-0. 04 mg/L 核黄素 0. 1-0. 3 mg/L 盈酸硫胺 S_2_. _5. mg/L。8.-种权利要求1-7任一项所述的脐带血间充质干细胞的无血清培养基的使用方法， 其特征在于:培养脐带血间充质干细胞过程如下:a、在制备好α-ΜΕΜ培养液中按浓度加入胰 岛素、转铁蛋白、BMP-4、B0P1、FGF-2和AMD3100制作成培养液;b、在24孔板中进行培养，每孔 Iml培养液，接种接种所需的脐带血间充质干细胞，接种密度为I X 105cel ls/ml，于37°C、 5%C02的全饱和湿度下培养;c、培养第一周加入IL-3+IL-6+SCF;第7天同时加入FL直到第 四周结束;第Hd起停用IL-3。
【文档编号】C12N5/0775GK105886464SQ201610398496
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】谢海涛, 李相鲁, 张严冬
【申请人】广东万海细胞生物科技有限公司