一种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法
【专利摘要】本发明属于细胞生物学领域，公开了一种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法。本发明所述方法将骨髓间充质干细胞接种含有PHAs支架的骨髓间充质干细胞生长培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换成成骨分化培养液继续培养，每3天换液，共培养4周。本发明所述方法采用聚羟基脂肪酸酯作为支架材料与骨髓间充质干细胞一起培养，使其吸附在聚羟基脂肪酸酯支架上，骨髓间充质干细胞不断的增殖、分化并形成骨组织，而聚羟基脂肪酸酯支架逐渐被降解和吸收。实验结果显示采用本发明所述方法诱导培养骨髓间充质干细胞后，Von Kossa染色可见钙化结节。骨髓间充质干细胞经过传代后，采用本发明所述方法仍然可定向诱导分化成骨组织。
【专利说明】
_种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法
技术领域
[0001]本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞(stemcell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层ISC具有自我复制、自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一。除此以外，间充质干细胞能分泌多种营养物质，包括血管内皮生长因子(vEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等在内的各种生长因子，这些生长因子可参与多种细胞反应，促进细胞生长，而收集条件培养基是获得这些活性成分的有效方法。
[0003]骨髓间充质干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于骨髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。骨髓干细胞的可以分化成各种间充质来源的细胞，如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肝细胞、肌细胞、神经细胞等，是未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想种子细胞。
[0004]近来有众多的国内外研究探索骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的方法，以期作为骨组织工程的研究基础和临床骨相关疾病生物治疗的理论指导。然而目前体外分离纯化的骨髓间充质干细胞经过传代后，相关的生物学特性发生改变，外形未见明显变化，但是已逐渐失去其分化潜能，定向诱导分化后很难向所需的方向分化，影响其作为组织工程细胞来源的应用。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法。采用本发明所述方法可以定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨分化。
[0006]为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
[0007]—种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法，将骨髓间充质干细胞接种含有PHAs支架的骨髓间充质干细胞生长培养液，37°C，5%CO2培养箱中培养24h，换成成骨分化培养液继续培养，每3天更换新鲜成骨分化培养液，共培养4周。
[0008]聚轻基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates或PHAs)是细菌胞内合成的一类高分子化合物(胞内聚酯)，是在营养不平衡的环境下，细菌将多余的物质转化为碳源和能源的储备物，同时将水溶性的小分子转化为水不溶性的大分子PHA13PHA的力学性能与某些热塑性材料如聚乙烯、聚丙烯类似，但又可完全降解进入自然界的生态循环。因此其具有类似于合成塑料的物化特性又具有合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。
[0009]本发明采用聚羟基脂肪酸酯作为支架材料与骨髓间充质干细胞一起培养，使骨髓间充质干细胞吸附在聚羟基脂肪酸酯支架上，骨髓间充质干细胞不断的增殖、分化并形成骨组织，而作为细胞吸附、生长支架的聚羟基脂肪酸酯支架逐渐被降解和吸收。
[0010]其中，所述PHAs支架的制备方法为聚羟基脂肪酸酯和Γ4-二氧六环混合加入到小烧杯中，转移到-800C冰箱中急冻，将急冻过夜的支架真空干燥。
[0011]作为优选，按g/mL计，所述聚羟基脂肪酸酯和Γ4-二氧六环的比例为1:(10-50)。即每Ig聚羟基脂肪酸酯加入10mL-50mLl’4-二氧六环混合。在一些实施方案，Ig聚羟基脂肪酸酯加入20mLl ’ 4-二氧六环混合。
[0012]在一些实施方案中，所述PHAs支架需经预处理。
[0013]优选的，所述预处理具体为将PHAs支架切成l-3mm厚的薄片，在75 %乙醇中浸泡1-3小时，紫外灭菌I小时，同时挥发掉支架上的酒精，放入12孔板中，加入ImL骨髓间充质干细胞生长培养液润洗支架。
[0014]所述骨髓间充质干细胞生长培养液的组成为体积分数10%FBS，10ng/mL bFGF，余量为DMEM培养液。
[0015]本发明所述骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法中所述成骨分化培养液的组成为lOmmol/LP甘油磷酸钠、0.05mmol/L维生素C、100mmol/L地塞米松、体积分数10%FBS，余量为DMEM培养液。
[0016]本发明所述方法中所述骨髓间充质干细胞可以由骨髓分离后培养得到。
[0017]在一些实施方案中，所述骨髓间充质干细胞的制备方法为骨髓分离得到单个核细胞，接种骨髓间充质干细胞生长培养液，37 °C、5 %CO2培养箱中培养，48小时后，去除培养上清，重新换上骨髓间充质干细胞生长培养液继续培养，每3天换液，至细胞汇合度达到80-90%，胰蛋白酶消化后离心，弃上清，用骨髓间充质干细胞生长培养液重悬细胞沉淀。
[0018]其中，所述骨髓间充质干细胞生长培养液的组成为体积分数10%FBS，10ng/mLbFGF，余量为DMEM培养液。
[0019]作为优选，所述胰蛋白酶的用量为0.25%-0.125%。
[0020]作为优选，所述离心为200_300g离心5-10min。
[0021 ]在一些实施方案中，所述骨髓分离得到单个核细胞的方法具体为骨髓加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，以300-400g离心1min，收集中间层的单核细胞层。
[0022]在一些优选实施方案中，所述骨髓分离得到单个核细胞的方法还包括Hanks缓冲液清洗分离得到的单个核细胞的步骤。具体为用巴氏吸管吸取中间层的单核细胞层，转移到含有5-10ml Hanks缓冲溶液的离心管中，轻轻混勾，以200离心1min，去上清，用Hanks再次清洗I次。
[0023]由上述技术方案可知，本发明提供了一种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法，将骨髓间充质干细胞接种含有PHAs支架的骨髓间充质干细胞生长培养液，37°(:，5%0)2培养箱中培养24h，换成成骨分化培养液继续培养，每3天更换新鲜成骨分化培养液，共培养4周。本发明所述方法采用聚羟基脂肪酸酯作为支架材料与骨髓间充质干细胞一起培养，使骨髓间充质干细胞吸附在聚羟基脂肪酸酯支架上，骨髓间充质干细胞不断的增殖、分化并形成骨组织，而作为细胞吸附、生长支架的聚羟基脂肪酸酯支架逐渐被降解和吸收。实验结果显示采用本发明所述方法诱导培养骨髓间充质干细胞后，Von Kossa染色可见钙化结节。骨髓间充质干细胞经过传代后，采用本发明所述方法仍然可定向诱导分化成骨组织。
【附图说明】
[0024]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0025]图1示实施例2PHA支架电镜图，放大倍数为200倍；
[0026]图2示实施例4VonKossa染色结果图，放大倍数为200倍；
[0027]图3示实施例5VonKossa染色结果图，放大倍数为200倍；
[0028]图4示实施例6油红O染色结果图，放大倍数为200倍。
【具体实施方式】
[0029]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030]为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中PHAs材料购自天津国韵生物材料有限公司。
[0031 ]实施例1:骨髓间充质干细胞的原代分离培养
[0032]1、在无菌环境下，在骨髓中加入等体积的生理盐水，轻轻混匀，得到骨髓混合液；
[0033]2、在新的离心管中加入骨髓混合液等体积的淋巴细胞分离液，用注射器吸取骨髓混合液缓慢沿着管壁加入到淋巴细胞分离液中，以300-400g离心lOmin，离心后可见液体分层；
[0034]3、用巴氏吸管吸取中间层的单核细胞层，转移到含有5-10ml Hanks缓冲溶液的离心管中，轻轻混勾，以200离心1min，去上清，用Hanks再次清洗I次；
[0035]4、用骨髓间充质干细胞生长培养液(DMEM+10%FBS+10ng/mL bFGF)重悬细胞，并接种培养皿中，放置在37°C，5 %CO2培养箱中培养，48小时后，去除培养上清，重新换上骨髓间充质干细胞生长培养液继续培养，每3天换液，4-8天即可见细胞汇合度达到80-90 % ；
[0036]5、用0.25 %-0.125 %胰蛋白酶消化贴壁细胞，以200_300g离心5_10min，弃上清，用骨髓间充质干细胞生长培养液重悬细胞沉淀，按照5000-10000/cm2细胞密度接种培养皿中，传代至P3-P5代。
[0037]实施例2:PHA支架的制备:
[0038]Ig PHAs材料和20mL 1’4_二氧六环混合加入到小烧杯中，立即转移到_80°C冰箱中急冻，将急冻过夜的支架在冻干机中快速抽真空干燥即可。
[0039]将支架切成Imm厚的薄片，在电镜中拍照，观察支架结构。结果见图1。
[0040]结果显示，支架上靠近外周的支架孔隙比较密、小，靠近中间的比较大、疏。在电镜上拍照清楚的看到每个孔的轮廓。
[0041 ]实施例3:骨髓间充质干细胞向成骨分化
[0042]将PHBVHHx支架切成I _3mm厚的薄片，在75 %乙醇中浸泡I _3小时，紫外灭菌一小时，同时挥发掉支架上的酒精，放入12孔板中，加入ImL骨髓间充质干细胞生长培养液(DMEM+10%FBS+10ng/mL bFGF)润洗支架。
[0043]将5X 14个传代细胞加入支架的孔中，添加入新鲜骨髓间充质干细胞培养液直到每个孔中培养基盖过支架ImL，轻轻吹打均匀，使细胞进入支架中。37 °C，5 %CO2培养箱中培养24h，换成成骨分化培养液(成骨诱导培养液的组成为10mmol/U甘油磷酸钠、0.05mmol/L维生素C、10mmoI/L地塞米松、体积分数10 % FBS，余量为DMEM培养液)，每3天换液，共培养4周。
[0044]实施例4:骨髓间充质干细胞成骨分化情况的检测支架中
[0045]将进行实施例3培养的成骨分化的支架、细胞混合体内的培养液吸去，PBS清洗3次。加入0.5mL4 %的多聚甲醛固定细胞30min，每孔2mL去离子水清洗3次。用刀片将2mL的细胞-支架从侧面斜切割成0.5mL厚的切片。将0.5ml切片放在盖玻片上进行Von Kossa染色，结果见图2。
[0046]由图2可见，骨髓间充质干细胞在PHAs中经过成骨诱导4周后，由VonKossa染色可见钙化结节。表明骨髓间充质干细胞在PHAs生物材料中经诱导能够向成骨分化。
[0047]实施例5:P3代骨髓间充质干细胞诱导成骨分化鉴定
[0048]细胞培养至第2代时，按照IX 13细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养液进行诱导培养，每隔2-3天添加新鲜成骨诱导培养液，28天后进行茜素红染色，结果见图3。
[0049]由图3可以看出，骨髓间充质干细胞在体外成骨诱导分化过程中，28天时可见明显的矿化结节，用茜素红染色可将其形成的钙结节染成红色。
[0050]实施例6:P3代骨髓间充质干细胞诱导成脂分化鉴定
[0051]细胞培养至第2代时，按照IX 13细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养液进行培养。成脂诱导培养液包括基础培养基DMEM、10%胎牛血清、
0.5mM ΙΒΜΧ、ΙμΜ地塞米松、ΙΟΟμΜ吲哚美辛、5yg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺。每三天添加新鲜成脂诱导培养液。三周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图4。
[0052]由图4可以看出，在体外向脂肪细胞诱导过程中，细胞形态从成纤维状，缩短成为短梭形，诱导21d后可见大多数细胞充满红色的油滴空泡。说明骨髓间充质干细胞具有分化潜能。
【主权项】
1.一种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞接种含有PHAs支架的骨髓间充质干细胞生长培养液，37°C，5%CO2培养箱中培养24h，换成成骨分化培养液继续培养，每3天更换新鲜成骨分化培养液，共培养4周。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PHAs支架的制备方法为聚羟基脂肪酸酯和Γ4-二氧六环混合加入到小烧杯中，转移到-80°C冰箱中急冻，将急冻过夜的支架真空干燥。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，按g/mL计，所述聚羟基脂肪酸酯和I，4-二氧六环的比例为I: (10-50)。4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述PHAs支架需经预处理，所述预处理具体为将PHAs支架切成l-3mm厚的薄片，在75%乙醇中浸泡1-3小时，紫外灭菌I小时，同时挥发掉支架上的酒精，放入12孔板中，加入ImL骨髓间充质干细胞生长培养液润洗支架。5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，所述成骨分化培养液的组成为lOmmol/LP甘油磷酸钠、0.05mmol/L维生素C、100mmol/L地塞米松、体积分数10%FBS，余量为DMEM培养液。6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞的制备方法为骨髓分离得到单个核细胞，接种骨髓间充质干细胞生长培养液，37 °C、5 % CO2培养箱中培养，48小时后，去除培养上清，重新换上骨髓间充质干细胞生长培养液继续培养，每3天换液，至细胞汇合度达到80-90 %，胰蛋白酶消化后离心，弃上清，用骨髓间充质干细胞生长培养液重悬细胞沉淀。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞生长培养液的组成为体积分数10^^83，101^/1^ bFGF，余量为DMEM培养液。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的用量为0.25% -0.125 %。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离心为200-300g离心5-10min。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，骨髓分离得到单个核细胞的方法具体为骨髓加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，以300-400g离心1min，收集中间层的单核细胞层。
【文档编号】C12N5/077GK105886461SQ201610234653
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】葛啸虎, 陈海佳, 王飞, 王一飞, 冯德龙, 王小燕
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司