用于ADSCs培养的组合物及ADSCs培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于脂肪间充质干细胞培养的组合物，所述组合物包括：人血白蛋白、维生素C、白藜芦醇、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、孕酮和谷胱甘肽。本发明还公开了一种脂肪间充质干细胞培养方法，在基础培养基中添加本发明的上述组合物，然后对脂肪间充质干细胞进行培养。采用本发明的方法培养脂肪干细胞，不但能促进脂肪干细胞的生长增殖速度，又能抑制其过早分化成熟和早衰，保持脂肪干细胞的分化潜能，十分适合脂肪干细胞的培养。
【专利说明】
用于ADSCs培养的组合物及ADSCs培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞培养液及培养方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs)，是脂肪组织中一类多 能性干细胞。由于脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带 来的痛苦较小，因此日益受到研究者的重视。目前，研究人员已成功地在体内、体外条件下， 将其诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。
[0003] 脂肪间充质干细胞在来源、获取及本身分化增殖潜力等方面的优势，预示着其作 为组织工程种子细胞，有着很好的应用前景。目前脂肪来源的间充质干细胞已引起科学界 广泛关注，开展了大量的基础实验研究，在临床治疗中也有部分应用。骨、软骨、神经、肌肉 等组织缺损，一直是一个难以解决的难题，但以干细胞为基础的组织工程的出现为这些疾 病的治疗带来了新希望。脂肪来源的干细胞在组织工程及临床上的应用有以下几方面：① 细胞治疗：直接将脂肪来源的间充质干细胞移植入体内，修复缺损组织、器官，或体外培养 再生组织和器官，这将是医学史上的又一次革命。②作为基因治疗载体：联合基因转染技 术，携带靶基因或生长因子基因，治疗遗传性疾病。③种子细胞的最佳选择，以其多项独特 优势，成为组织工程的种子库来源，同时与可降解支架材料联合培养，体外构建有生命的种 植体，修复组织缺损或替代器官的部分功能，治疗难治性疾病。④未来可筹建干细胞库，用 于免疫缺陷性疾病，或将来自体病损组织和器官的修复，也可配型成功后，用于同种异体移 植治疗。
[0004] 目前，常用的ADSCs分离培养方法大多是从脂肪组织分离细胞，经机械、酶处理去 除红细胞等成熟细胞，然后利用饲养层细胞与含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培 养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢、细胞过 早衰老。因此本领域技术人员致力于开发一种能够提高ADSCs继代增殖效率的技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种提高ADSCs继代增殖效率的技术。
[0006] 本发明提供了一种用于脂肪间充质干细胞培养的组合物，包括：人血白蛋白、维生 素 C、白藜芦醇、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、孕酮和谷胱甘肽。
[0007] 优选地，所述组合物中人血白蛋白10_30mg/ml、维生素 C 10-50μ g/ml、白藜芦醇 10_20μ g/ml、氢化可的松3_6ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)O. 1-0. 5ng/ml、孕酮 3_6ng/ml 和谷胱甘肽 30-50 μ g/ml。
[0008] 更优选地，所述组合物中人血白蛋白20mg/ml、维生素 C 40 μ g/ml、白藜芦醇 15 μ g/ml、氢化可的松4ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF) 0. 3ng/ml、孕酮4ng/ml和 谷胱甘肽40 μ g/ml。
[0009] 优选地，所述组合物中还包括维生素 E，较佳地维生素 E含量为15-20 μ g/ml。
[0010] 优选地，所述组合物中还包括抗生素，所述抗生素可以是青霉素和/或链霉素。
[0011] 优选地，所述组合物中青霉素的含量为20-250单位/ml和链霉素的含量为20-250 单位/ml。
[0012] 上述各组分的含量均为各组分在培养基中的最终含量。
[0013] 本发明的第二方面提供了一种脂肪间充质干细胞培养方法，其中，在基础培养基 中添加本发明第一方面所述的组合物，然后对脂肪间充质干细胞进行培养。
[0014] 优选地，所述基础培养基是DMEM/F12培养基。
[0015] 本发明的有益效果是：
[0016] 1、本发明的培养液组合物，配方成分确定具有较高的安全性，适合临床治疗应 用；
[0017] 2、采用本发明的方法培养脂肪干细胞，不但能促进脂肪干细胞的生长增殖速度， 又能抑制其过早分化成熟和早衰，保持脂肪干细胞的分化潜能，十分适合脂肪干细胞的培 养。
【附图说明】
[0018] 图1显示了本发明实施例2中活细胞技术结果。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1
[0020] 以DMEM/F12培养基（购自TAKARA BIO INC.)为基础培养基，加入青霉素 200单 位/ml，加入链霉素200单位/ml。按照下表配制，各组分含量为各组分在培养基中的最终 含量。
[0021]
[0022] 上述各组培养基配制完成后，调节pH7. 2备用，临用前加入体积分数10%的小牛 血清。
[0023] 对照组为基础培养基加小牛血清（基础培养基：小牛血清为9 : 1，体积比）。
[0024] 实施例2
[0025] 用上述各组培养基培养脂肪间充质干细胞，检测培养效果。
[0026] 在装有实施例1中各组培养基的培养基皿中，分别接种基础量为1 X 106个的脂肪 干细胞，置于37°C，5% C02的培养箱中进行培养；每隔3天用移液管吸去上层培养基，加入 新的培养基，倒置式显微镜观察。
[0027] 自培养皿中取样后，PBS缓冲液洗涤2次，加入胰蛋白酶复合体Trypsin-EDTAlmL， 轻摇至贴壁细胞分离，加入4mL含有10 %牛血清FBS的基础培养基终止胰酶作用。使用台 盼蓝染色后血细胞计数板统计活细胞数。培养至第8天，对照组的活细胞数约为60 X 106， 实验组活细胞计数结果如图1所示，从图中可以看出A组培养基的细胞增殖效果最好；B组 培养基中未添加白藜芦醇，细胞增殖效果最差，与对照组相当，说明白藜芦醇能够显著地促 进脂肪间充质干细胞的增殖；C组中虽然添加了白藜芦醇，但是没有添加维生素 C，细胞增 殖效果虽然优于B组，但是仍然没有达到A组的水平，说明维生素 C和白藜芦醇具有协同的 促进脂肪间充质干细胞增殖的作用。D组的计数情况可以看出，谷胱甘肽对脂肪间充质干细 胞的增殖有正面的影响但是影响较不显著。
[0028] 在实验中，发明人发现，采用上述培养基培养的脂肪干细胞，细胞形态出现梭形 及纤维细胞状形态，细胞形态一致性较差，经反复验证，本发明人发现在培养基中添加 15-20 μ g/ml的维生素 E可明显提高细胞形态的均一性。
[0029] 实施例3表面抗原分析
[0030] 取培养8天的脂肪间充质干细胞，弃培养液，消化液消化后（2. 5%的胰蛋白酶溶 液和0.02%EDTA溶液混合成消化液，体积比1 : 1)，用含1%牛血清白蛋白（BSA)的PBS 洗涤后制成每l〇〇ul含有1X 106个细胞的单细胞悬液，分别加入7个Ep管中，每管加入细 胞悬液lOOuL，对照管加入共20yL的FITC Mouse IgGl、APC-CY7Mouse IgG2b和染色缓冲 液用于检测由于抗体非特异性结合产生的背景，其他试管分别加入⑶29、⑶34、⑶44、⑶45、 CD105、HLA. DR单克隆抗体（单抗购自TAKARA BIO INC.)各20 μ L，室温孵育25min，用含 1 % BSA的PBS洗涤后，流式细胞仪检测。
[0031] 流式细胞仪分析人脂肪干细胞表型，实验结果见表1。
[0032] 表1人脂肪干细胞表型分析
[0033]
[0034] 从上表中可以看出，实验组A、B、C、E、F和对照组中培养的细胞均具有干细胞特 性。但是，D组中的HLA. DR表达量较高，说明未添加谷胱甘肽的培养液，虽然也能促进有效 促进细胞增殖，但是增殖的细胞具有成纤维细胞化的倾向，此实验说明，在本发明的细胞培 养液中添加谷胱甘肽能够有效防止脂肪间充质干细胞的成纤维细胞化。
[0035] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的 技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种用于脂肪间充质干细胞培养的组合物，其特征在于，所述组合物包括：人血白 蛋白、维生素 C、白藜芦醇、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、孕酮和谷胱甘 肽。2. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中人血白蛋白10_30mg/ml、维生素 (：10-5(^8/1111、白藜芦醇10-2(^8/1111、氢化可的松3-61^/1111、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 0.1-0· 5ng/ml、孕丽 3_6ng/ml 和谷脈甘肤 30-50 μ g/ml。3. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中人血白蛋白20mg/ml、维生素 C 40μg/ml、白藜芦醇15μg/ml、氢化可的松4ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF) 0.3ng/ml、孕酮 4ng/ml 和谷胱甘肽 40μg/ml。4. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中还包括维生素 E，较佳地维生素 E 含量为 15-20μ g/ml。5. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中还包括抗生素，所述抗生素可以是 青霉素和/或链霉素。6. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中青霉素的含量为20-250单位/ml 和链霉素的含量为20-250单位/ml。7. -种脂肪间充质干细胞培养方法，其特征在于，在基础培养基中添加本发明权利要 求1所述的组合物，然后对脂肪间充质干细胞进行培养。8. 如权利要求7所述的方法，其中，优选地所述基础培养基是DMEM/F12培养基。
【文档编号】C12N5/0775GK105886462SQ201410442734
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年8月27日
【发明人】杨钟华
【申请人】瑞安市普罗生物科技有限公司