一株活性嗜热菌突变株及其在驱油方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一株嗜热微生物突变菌株及其应用，本发明所提供的XS2-450(Geobacillus?sp.)是通过对出发菌株Geobacillus?sp.XS2进行常压室温等离子体诱变得到的，其保藏编号为CGMCC?No.9430。本发明采用室温常压等离子体诱变方法获得Geobacillus?sp.XS2-450，可大幅提高乳化剂的乳化活性，对甲苯，二甲苯的乳化活性高达100％；乳化稳定性好，静置30d仍能保持70-100％的乳化活性；菌株连续传代20次后乳化活性无明显下降。本技术发明对突变株Geobacillus?sp.XS2-450进行了工业化放大生产，并应用于油田单井吞吐中试，使长庆油田刘55-4油井产油量提高12倍，采出液含水量降低70％以上,表现出了重大的经济价值和规模化应用的潜力。
【专利说明】一株活性嗜热菌突变株及其在驱油方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于活性微生物菌株的筛选和应用【技术领域】，具体涉及一株嗜热微生物突 变菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 表面活性剂是一类两亲分子的总称，这类分子同时含亲水和亲油基团，在很低浓 度下就能显著降低溶剂表面张力或液-液界面张力或增加乳化体系的稳定性。表面活性剂 有多种活性，如乳化，表面吸附，溶解性，润湿性，发泡，去污等，广泛应用在皮革，化妆品，建 筑，石油工业，环境工程等领域。
[0003] 由生物产生的表面活性剂称为生物表面活性剂（Biosurfactants)。生物表面活性 剂与化学表面活性剂相比，具有用量少、选择性好、无毒、无污染、可降解等优点。在环境治 理，微生物驱油等领域具有较大的应用潜质。生物表面活性剂中分子量大，起乳化作用并具 有稳定活性的称为生物乳化剂，主要包括多聚糖，蛋白，脂多糖，脂蛋白或者这些生物高聚 物的复杂混合物。生物乳化剂可以形成水包油（0/W)或者油包水（W/0)的乳状液，并使其 稳定。在较低的浓度下呈现出较好的乳化作用，并表现出一定的底物专一性。
[0004] 目前代谢合成生物乳化剂的菌株在应用方面存在如下问题：1)活性不稳定，在实 际生产中活性下降严重；短时间内作用活性高，长时间作用活性下降；2)环境适应能力差， 生长温度范围窄，实际环境温度变化大，使菌株无法快速生长和表现活性；3)生物乳化剂 乳化活性强，但不能显著降低表面张力，导致单独使用驱油活性见效慢。因此，筛选具有应 用价值的产高活性、高稳定性生物乳化剂菌株具有重要的生产价值，如能将其与显著降低 表面张力的绿色生物表面活性剂复配应用，则会具有事半功倍的效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株嗜热微生物突变菌株及其应用。即一种具有生长速度 快，遗传稳定性高，乳化剂活性稳定、耐受力好的菌株，从而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明所提供的XS2-450 (Geobacillus pall idus)是通过对出发菌株 Geobacillus sp.XS2进行常压室温等离子体诱变（ARTP)得到的。已于2014年7月9日保 藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏编号为：CGMCC No. 9430。
[0007] 本发明还提供一种微生物复合驱油的方法，驱油剂主要由三部分组成：微生物发 酵液，发酵培养基和生物表面活性剂鼠李糖脂。
[0008] 其中所用微生物发酵液即为Geobacillus pall idus XS2-450发酵培养所得，活菌 数为5xl09cfu/ml左右；
[0009] 发酵培养基是以2 %葡萄糖为碳源，0.3 %硝酸钠为氮源，包含磷酸根离子 0. 54%，硫酸根离子0. 055%，钾离子0. 66%，铁离子0. 005%，镁离子0. 05%，钙离子 0.005% ;鼠李糖脂复配后的质量百分比分数为1%。
[0010] 本发明采用室温常压等离子体诱变方法获得Geobacillus pallidus XS2-450,可 大幅提高乳化剂的乳化活性，对甲苯，二甲苯的乳化活性高达100% ;乳化稳定性好，静置 30d仍能保持70-100%的乳化活性；菌株连续传代20次后乳化活性无明显下降。本技术发 明对突变株Geobacillus pallidus XS2-450进行了工业化放大生产，并应用于油田单井吞 吐中试，使长庆油田刘55-4油井产油量提高12倍，采出液含水量降低70%以上，表现出了 重大的经济价值和规模化应用的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1 :突变株XS2-450进行常压低温等离子体诱变筛选时的存活曲线。
[0012] 图2 :发酵不同时间突变株XS2-450与原始菌株乳化活性的对比。
[0013] 图3 :突变株XS2-450发酵24h的发酵液对不同烃类的乳化活性。
[0014] 图4 :突变株XS2-450发酵24h的发酵液对四种烃类的乳化稳定性。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明的菌株及复合驱油方法进行详细的描述。
[0016] 实施例1
[0017] 本实施例说明将原始菌株进行等离子体诱变的方法。
[0018] 其中所使用的培养基配方（w/v):
[0019] 固体平板LB(Luria-Bertani)培养基：氯化钠10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物 5%，琼脂 2%，pH 7. 5。
[0020] 液体LB培养基：氯化钠10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物5%，pH7. 5。以原始菌 株Geobacillus pallidusXS2进行等离子体诱变的具体方法如下：
[0021] 1、制备原始菌株 Geobacillus pallidusXS2 菌悬液
[0022] 原始菌株Geobacillus pallidusXS2是本实验室从中国甘肃玉门油田鸭儿峡油藏 分离筛选到的一株嗜热地芽孢杆菌；为地芽孢杆菌属XS2菌株（Geobacillus pallidus)， 该菌株的保藏号为CGMCC No. 8338,于2013年10月15日保藏位于北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 从固体LB平板上挑取原始菌株Geobacillus pallidusXS2的单克隆接种于液体LB中进行 摇床活化培养，培养温度60°C，摇床转速200rpm，50ml三角瓶，装液量为15-20ml，培养时间 8-12h，得到对数生长期、活力高的菌液，稀释至细胞浓度0D_ = 1-1. 3,得到待诱变的菌悬 液。
[0023] 2、制备样品载片
[0024] 取上一步骤制备得到的菌悬液10μ1，滴加在灭菌冷却后的载片上，载片直径 10_，然后将载片置于无菌超净工作台，自然风干至无明显液滴，全部操作在无菌条件下进 行。
[0025] 3、等离子诱变操作
[0026] 利用等离子体诱变系统进行操作。以氦气为放电气体，射频功率100W，气体流量 10SLM，选取处理时间0s，15s，30s，45s，60s，90s进行等离子体诱变，每次处理一个载片。诱 变后，用生理盐水将载体上的细胞洗脱下来，绘制存活曲线。
[0027] 实验结果如附图1所示。为提高获得高乳化活性和生长能力较强菌株的几率，根 据预实验结果选取45s为后续筛选的诱变辐照时间，此时细胞的存活率为3. 08%。
[0028] 实施例2
[0029] 本实例说明产高活性生物乳化剂菌株的筛选方法。
[0030] 其中所使用的培养基配方（w/v):
[0031] 固体平板LB(Luria-Bertani)培养基：氯化钠10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物 5%，琼脂 2%，pH 7. 5。
[0032] 液体LB培养基：氯化钠10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物5%，pH7. 5。
[0033] 发酵培养基：葡萄糖2 %，硝酸钠0. 3 %，磷酸二氢钾0. 042 %，磷酸氢二钾0. 12 %， 硫酸亚铁0.005%，硫酸镁0.05%，氯化钙0.005%，维生素0.02 %。微量元素0.1%，pH 为 7. 5。
[0034] 微量元素：硼酸0. 025 %，硫酸铜0. 05 %，硫酸锰0. 05 %，钥酸钠0. 006 %，硫酸锌 0· 07%。
[0035] 维生素：D-泛酸钙0· 004 %，肌醇0· 002 %，烟酸0· 004%，维生素6. 004%，对氨基 苯甲酸0· 002%，维生素 B120. 05%。
[0036] 筛选步骤如下：
[0037] 1、固体平板培养基初筛
[0038] 将诱变后的载片置于装有l_2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的 细胞洗脱下来，梯度稀释至不同浓度涂布于固体LB培养基平板上，60°C倒置培养16h，挑取 单克隆。
[0039] 2、液体试管培养基复筛
[0040] 将筛选的菌株接种于装有液体LB培养基的试管（15X 150_)中，装液量为2ml， 60°C摇床震荡培养12h后，以10%的接种量转接到液体发酵培养基中，继续震荡培养至 24h。用等体积发酵液同液体石蜡漩涡振荡混合测试发酵液的乳化活性，筛选乳化活性最好 的菌株。最终筛选的XS2-450的乳化活性较原始菌株提高25%，达到75. 05%。
[0041] 3、小型发酵罐扩大培养验证突变株活性稳定性
[0042] 将突变株XS2-450和原始菌株XS2以相同培养条件分别接入种子培养基中扩大 培养，培养温度60°C，500ml，培养时间12h。转接至7L发酵罐中培养，装液量4L，发酵时间 24h，检测发酵过程中乳化活性结果如图2所示。可以看出与原始菌株相比，突变株分泌乳 化剂的时间更长，达到20h，活性也更高，达到70%。
[0043] 实施例3
[0044] 本实施例测定突变株XS2-450对各种不同烃类的乳化活性。
[0045] 本发明所提供的乳化活性测定方法是将突变株发酵原液与七种不同的烃类（甲 苯，二甲苯，正十六烷，液体石蜡，大豆油，柴油，橄榄油）以一定比例混合，涡旋震荡2min， 静置24h，乳化活性=乳化层高度/液面总高度*100%。实验结果表明经过体系优化后突 变株XS2-450对以上七种烃类均有较高的乳化活性。其中甲苯最高达到100%，比原始菌株 活性提高了 29.6%。
[0046] 实施例4
[0047] 本实施例检测突变株XS2-450的乳化稳定性和遗传稳定性
[0048] XS2-450的乳化稳定性：
[0049] 1从固体LB平板上挑取单个克隆，接种于LB液体培养基中活化培养，60°C，200rpm 震荡培养16h制备种子液。
[0050] 2以10% (v/v)的接种量，将种子液接种于无机盐培养基中，60°C，200rpm，震荡培 养 24h。
[0051] 3将发酵原液分别与甲苯，二甲苯，正十六烧，液体石蜡以不同比例混合，涡旋震荡 2min，分别静置24h，15d，30d，检测并记录乳化活性变化过程。
[0052] 结果如图3所示，突变株XS2-450的发酵原液对甲苯的乳化稳定性在24h后可保 持100%，30d后仍保持92±0. 7% ;对二甲苯的乳化稳定性在24h后可保持99. 5±0. 5%， 30d后仍保持85±0. 4% ;对正十六烷的乳化稳定性24h后保持78±0. 5%，30d后仍保持 62. 5±0. 4%;对液体石蜡的乳化稳定性24h后75±0. 5%，30d后仍保持69±0. 3%。说明 菌株XS2-450发酵后分泌的生物乳化剂具有很强的乳化活性和乳化稳定性。
[0053] XS2-450的遗传稳定性：
[0054] 1从固体LB平板上挑取突变株XS2-450单个克隆，接种于LB液体培养基中，60°C， 200rpm震荡培养12h作为第一代种子液。
[0055] 2以10% (v/v)的接种量，将种子液接种于发酵培养基中，60°C，200rpm，震荡培养 24h，作为第一代的发酵液，按照上述方法测定乳化活性。
[0056] 3以10% (v/v)的接种量，再次接种至LB液体培养基中，60°C，200rpm震荡培养 12h，作为第二代的种子液。
[0057] 4以10% (v/v)的接种量，将第二代种子液接种于发酵培养基试管中，60°C， 200rpm，震荡培养24h。作为第二代的发酵液测定乳化活性。
[0058] 如此再继续传代至20代，检测每一代的乳化活性，发酵液对液体石蜡的乳化活性 可以稳定维持在在65%?75%之间，说明突变株遗传稳定。
[0059] 实施例5
[0060] 本实施例说明突变株XS2-450在微生物复合驱油中的应用。
[0061] 1突变株XS2-450大规模发酵培养。
[0062] 其中所使用的培养基配方（w/v):
[0063] 液体LB培养基：氯化钠10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物5%，pH 7. 5。
[0064] 发酵培养基：葡萄糖2 %，硝酸钠0. 3 %，磷酸二氢钾0. 042 %，磷酸氢二钾0. 12 %， 硫酸亚铁〇· 005 %，硫酸镁0· 05 %，氯化钙0· 005 %，pH为L 5。
[0065] 发酵过程中补料：葡萄糖40%，硝酸钠12%。
[0066] 实验过程：将活化后的种子液接种于500ml三角瓶中，装液量200ml，共两瓶，培养 12h后，转接至7L发酵罐中，装液量4L。培养18h后，转接至30L发酵罐中，装液量为24L， 培养20h后，转接至200L发酵罐中，装液量为120L，培养20h后，转接至2000L发酵罐中，装 液量为1600L，培养从8h开始，每隔8h补料一次，40h后，收集发酵液。
[0067] 2生物乳化剂同鼠李糖脂复配提高乳化效率和乳化稳定性
[0068] 为了达到适应性强，见效快，有效期长的驱油效果，将突变株XS2-450发酵液与生 物表面活性剂鼠李糖脂复配。分别测定不同比例的发酵液与鼠李糖脂混合液对液体石蜡乳 化活性及稳定性。最终确定突变株XS2-450发酵液与鼠李糖脂溶液（浓度为0. lg/Ι)以 70 :4的比例混合得到对液体石蜡的最高乳化活性为87%。为了进一步验证复配后的混合 液对长庆油田原油的乳化活性，在60°C，180rpm，原油添加量为5% (w/v)的条件下，分别添 加10 %复配混合液，10 %突变株XS2-450发酵液，10 %鼠李糖脂溶液（0. lg/Ι)，摇床震荡 5min，对比复配混合液、突变株XS2-450发酵液、鼠李糖脂溶液（0. lg/Ι)三者对原油作用效 果。可以明显看到复配后的混合液能够快速将原油分散和乳化，同时能够维持乳化状态达 到15d以上，而单独添加突变株XS2-450发酵液或者鼠李糖脂溶液（0. lg/Ι)乳化效果均没 有复配混合液好。说明复配混合液既能够使体系的表面/界面张力降低，又能够有效维持 乳化稳定的状态，综合发挥了生物乳化剂和鼠李糖脂的两者优势。
[0069] 3微生物复合驱油的单井吞吐中试
[0070] 将复配混合液与营养液混匀注入到长庆油田刘55-4井中，封井三个月后开井采 油，同时对原油产量、采出液含水量等数据进行连续监测。试验前该井生产状况如下：刘 55-4于2010年5月投产，2011年11月含水上升，平均日产量0. 23m3,折合原油0.03T，含 水量为85. 7 %。经过微生物复合驱油剂之后的生产状况：平均日产量0. 65M3,折合原油 0. 36T，含水量为25%。经过微生物复合驱油刘55-4的原油产量提升12倍，含水量降低 70%。由此可见本发明具有重大的经济价值。
【权利要求】
1. 一株嗜热地芽孢杆菌，其特征在于，所述的地芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.9430。
2. 如权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌，其特征在于，所述的地芽孢杆菌是通过对出 发菌株Geobaci 1 lus sp. XS2进行常压室温等离子体诱变获得的。
3. 权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌在石油开采中的应用。
4. 一种微生物复合驱油剂，其特征在于，所述的驱油剂包含有微生物发酵液，发酵培养 基和鼠李糖脂；其中所述的微生物发酵液即是权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌发酵培养 获得的。
5. 如权利要求4所述的微生物复合驱油剂，其特征在于所述的微生物发酵液中活菌数 为 5xl09cfu/ml〇
6. 如权利要求4所述的微生物复合驱油剂，其特征在于所述的发酵培养基包含有2% 葡萄糖、0. 3 %硝酸钠、磷酸根离子0. 54%、硫酸根离子0. 055 %、钾离子0. 66 %、铁离子 0. 005%、镁离子 0. 05%、钙离子 0. 005%。
7. 如权利要求4所述的微生物复合驱油剂，其特征在于所述的鼠李糖脂的质量百分比 分数为1%。
8. 权利要求4所述的微生物复合驱油剂在开采石油中的应用。
【文档编号】C09K8/582GK104152388SQ201410419831
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月23日 优先权日:2014年8月23日
【发明者】黄志勇, 董大媛, 王兴彪, 蔡明昱 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所