一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其毕赤酵母表达载体和工程菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其表达载体和工程菌。本发明提供一种重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列，如SEQIDNo：1所示。本发明根据毕赤酵母密码子使用偏爱性，对ThermusthermophilusHB27来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，当优化后的锰过氧化氢酶在毕赤酵母中表达时，5L发酵罐培养液中最高可检测到过氧化氢酶酶活约为12000U/mL。
【专利说明】一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其毕赤酵母表达载体和工程菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其毕赤酵母表达载体和工程菌。
【背景技术】
[0002]过氧化氢酶(Catalase，简称CAT)，催化分解过氧化氢为水和氧气。CAT广泛应用于食品、纺织、造纸和医药等行业，其中在纺织工业中主要用于布料漂白后残余H2O2的消除。与传统工艺的水洗或化学助剂相比，CAT具有减少污染、提高后续印染质量等优点；但值得关注的是，印染工序通常是在高温(T>70°C)碱性(pH>9)环境中进行的，这就需要CAT具备嗜热嗜碱的应用特性。尽管CAT来源丰富，几乎存在于所有的需氧微生物中，但市场上目前仍缺乏具备优良纺织应用特性的CAT。
[0003]过氧化氢酶按催化中心结构差异可分为两类:(I)含铁卟啉环结构CAT，又称铁过氧化氢酶(FeCAT) ;(2)由锰离子代替铁离子的卟啉结构，又称锰过氧化氢酶(MnCAT)，目前已发现约280种FeCAT和30种MnCAT。近年来，研究者发现个别来源于高温碱性环境中的古细菌可以产生具有嗜热嗜碱特性的MnCAT,例如:Metallosphaera hakonensis来源的MnCAT，在pH8.0-10.0环境中处理60min酶活损失小于20% ;在70°C下处理50min，酶活残留率约在60%(Alkal1-tolerant high-activity catalase from a thermophilic bacteriumand its overexpression in Escherichia coli，Protein expression and purification，2008.57 (2): 255-26 0.)。但目前这类嗜热MnCAT的研究仍处于初级阶段，国外文献报道的该类MnCAT最高发酵酶活力仅约为20U/ml，国内也鲜有报道。大肠杆菌和毕赤酵母表达系统是目前工业生产中最为成熟的基因工程表达系统，目前关于该酶在毕赤酵母中的表达的文献还未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明鉴于上述情况，根据毕赤酵母密码子使用偏爱性，对Thermusthermophilus HB27来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，提供一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其毕赤酵母表达载体和工程菌，用于解决现有技术中的问题。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No:1所示。
[0006]所述多核苷酸序列根据Thermus thermophilus来源的猛过氧化氢酶基因核苷酸序列，按照毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱件(http://gcua.schoedl.de/seqoverall v2.html)优化设计。
[0007]本发明第二方面提供一种重组含锰过氧化氢酶，由所述的多核苷酸序列编码。
[0008]本发明第三方面提供一种重组含锰过氧化氢酶表达载体(pPIC3.5K_MnCAT)，包含所述重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列。[0009]优选的,所述表达载体为pPIC系列表达载体。
[0010]更优选的,所述pPIC系列表达载体为pPIC3.5K。所述pPIC3.5K购自Invitrogen公司。
[0011]本发明第四方面提供一种工程菌(KM71/pPIC3.5K_MnCAT)，所述工程菌由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体(PPIC3.5K-MnCAT)转化获得。
[0012]优选的，所述工程菌由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体转化毕赤酵母获得。
[0013]更优选的，所述毕赤酵母为毕赤酵母KM71。
[0014]本发明第五方面提供所述重组含锰过氧化氢酶的制备方法，包括如下步骤:[0015]将所述工程菌在种子培养基中活化后,转接至发酵培养基中培养，当菌浓0D600达到100-120时，添加MnCl2,同时添加甲醇并进行诱导培养。
[0016]所得培养液的菌体破碎上清液中CAT酶活力可达12000U/ml。
[0017]本领域技术人员可根据经验，选择适合的蛋白纯化技术对所得培养液的具体破碎上清液进行处理，以期获得目标重组含锰过氧化氢酶。
[0018]优选的，所得培养液的菌体破碎上清液可依次通过常规蛋白纯化方法中的疏水层析、阴离子交换和凝胶过滤等步骤进行蛋白纯化。
[0019]优选的，所述种子培养基中活化的具体方法为:YPD培养基中，于30°C下200rpm/min 培养 19-22h。
[0020]优选的，所述发酵培养基为BMGY培养基或BSM培养基。
[0021]当进行发酵罐培养时，当培养基中甘油耗尽时，进行流加补料培养基，控制甘油在培养液中的终浓度小于10g/l。
[0022]优选的，转接时按10%转接。
[0023]优选的，所述MnCl2添加完毕时的终浓度lmmol/L。
[0024]优选的，所述添加MnCl2添加的方法为:直接将MnCl2加入发酵培养基中，或将菌体离心收集后，重悬于新的含有MnCl2的发酵培养基中。
[0025]优选的，所述添加甲醇的具体方法为:定期向培养基中补加甲醇至目标浓度，或采用连续流加甲醇的方式，保持浓度为0.25%-l%(V/V)。
[0026]优选的，所述诱导培养的具体条件为:在30°C流加甲醇诱导72_120h。
[0027]本发明根据毕赤酵母密码子使用偏爱性，对Thermus thermophilus HB27来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，当优化后的MnCAT在毕赤酵母中表达时，摇瓶发酵液中最高可检测到CAT酶活为5700U/mL ;而当该MnCAT工程菌在5L发酵罐中发酵培养时，培养液中最高可检测到CAT酶活约为12000U/mL，本发明通过基因密码子优化及发酵优化首次实现了 Thermus thermophilus HB27来源的MnCAT在毕赤酵母中的高效表达,且其发酵酶活值达到约12000U/mL，有利于该酶的进一步应用开发。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1表达载体pPIC3.5K-MnCAT的物理图谱。
[0029]图2表达载体pPIC3.5K-MnCAT的酶切鉴定；
[0030]MiMarke λ -EcoT14I digest ；1:SnaB I 和 Not I 双酶切后的 DNA 片段。
[0031]图3重组毕赤酵母E.coli PB-Ol的SDS-PAGE图；[0032]M:Protein MW Marker ;1_3:KM71/pPIC3.5K_MnCAT。
【具体实施方式】
[0033]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的【具体实施方式】加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0034]在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0035]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。 [0036]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本【技术领域】常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition, 2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ;WoIffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0037]所述重组含锰过氧化氢酶表达载体(pPIC3.5K-MnCAT)的构建方法为:将所述重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列两端设计限制性内切酶SnaB I和Not I酶切位点，重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列经SnaB I和Not I双酶切后克隆至经相同酶切后的胞内表达载体PPIC3.5K上，构建重组含锰过氧化氢酶表达载体。所述表达载体经测序验证后转化至大肠杆菌DH5ci中进行保存。
[0038]重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列中不具备但载体pPIC3.5K多克隆位点上具有限制性内切酶SnaB I和Not I酶切位点。
[0039]所述表达载体pPIC3.5K-MnCAT的物理图谱如图1。
[0040]所述表达载体pPIC3.5K-MnCAT的SnaB I和Not I双酶切图谱如图2所示。
[0041]所述工程菌(KM71/pPIC3.5K_MnCAT)的构建方法为:从工程菌DH5 α /pPIC3.5K-MnCAT 中提取重组表达质粒 pPIC3.5K_MnCAT，质粒 pPIC9K_MnCAT 经 Sal I 进行线性化酶切后，电转化毕赤酵母KM71感受态细胞，涂布于MD平板，挑取在MD平板上长出的转化子，点种于含0.25-5mg/ml梯度浓度G418的YPD平板上培养，从而获得基因工程菌P.pastoris KM71/pPIC3.5K_MnCAT。
[0042]工程菌P.pastoris KM71/pPIC3.5K_MnCAT在种子培养基中培养19_22h后，按10%转接至发酵罐培养基中培养，以25%的氨水控制pH5.0，30°C培养至菌浓0D600达到100-120时，流加0.25%-l%(V/V)的甲醇和ImM的Mncl2进行诱导培养72h，菌体破碎上清液中的酶活力可达约12000U/ml。
[0043]锰过氧化氢酶酶活的测定方法具体如下:采用分光光度法37°C测定CAT的酶活力，反应体积为3mL，包括0.1mL的酶液样品和2.9mL含10mmol/L H2O2的50mmol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，H2O2的分解速率用紫外分光光度计在240nm下测定。酶活活力单位(U/mL)的定义为:在37°C、pH8.0的条件下每分钟分解I μ mo I H2O2所需的CAT酶量为一个
酶活单位。[0044]实施例1锰过氧化氢酶MnCAT酵母表达基因工程菌的构建
[0045]1.1基于毕赤酵母密码子使用偏爱性优化设计的MnCAT基因
[0046]根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用的偏爱件(http://gcua.schoedl.de/seaoverall v2.html)优化设计，所得密码子优化后的MnCAT基因具有如序列SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列。
[0047]1.2MnCAT 酵母表达载体 pPIC3.5K_MnCAT 的构建
[0048]在MnCAT基因的5’ -端和3’ -端分别设计该基因中不具备但载体pPIC3.5K多克隆位点上具有的限制性内切酶SnaB I和Not I酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，MnCAT基因片段经SnaB I和Not I双酶切后与至经相同酶切后的表达载体pPIC3.5K进行T4连接，并转化大肠杆菌DH5 α的感受态细胞中，涂布至含IOOmg/L氨苄青霉素的LB平板，挑取单克隆菌落转接至含100mg/L氨苄青霉素的LB培养液中培养，提取质粒进行限制性内切酶SnaB I和Not I的双酶切鉴定。根据序列分析，重组质粒pPIC3.5K-MnCAT经SnaBI和Not I双酶切后，应分别获得897Ibp和914bp大小的DNA片段。如图2所示，DNA凝胶电泳的结果与预期值相符。将酶切验证正确的质粒pPIC3.5K_MnCAT送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果显示MnCAT基因序列与SEQID No:1序列一致，表明表达载体pPIC3.5K-MnCAT的构建成功。
[0049]注:LB培养基组分为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
[0050]1.3 重组表达菌株 KM71/pPIC3.5K_MnCAT 的构建
[0051]重组表达质粒pPIC3.5K-MnCAT经Sal I单酶切线性化后，电转化P.pastorisKM71感受态细胞，涂布于MD平板，倒置于30°C培养至出现重组单菌落，挑取单菌落，点种至分别含0.25,0.5、1、2、4和5mg/ml梯度浓度G418的YPD平板上，最终在含4mg/ml G418的YPD平板上获得可高效表达Mn-CAT的重组菌P.pastoris KM71/pPIC3.5K_MnCAT。
[0052]注:YH)培养基(g/L)组分为:蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20。
[0053]实施例2重组菌KM71/pPIC3.5K_MnCAT的摇瓶发酵培养
[0054]2.1摇瓶种子培养
[0055]将重组菌KM71/pPIC3.5K_MnCAT 接种至 50mL YPD 培养基中，30°C、200rpm/min 培养 19-22h ；[0056]2.2摇瓶发酵培养:
[0057]将种子培养液按10%的接种量转接至50mL BMGY培养基中，30°C、200r/min培养19-22h ；4°C,6000r/min离心收集菌体，并用25mL含终浓度为lmmol/L MnCl2的BMMY培养基重悬菌体，30°C、200rpm/min培养，每20h向培养基中补加100%甲醇至终浓度为0.25%(V/V)进行Mn-CAT的诱导表达，培养120h后，离心收集菌体、破碎细胞后对上清液进行SDS-PAGE分析，发现在33Kda处存在明显的蛋白条带，与文献报道的MnCAT蛋白分子量一致(图3);破碎细胞后对上清液进行酶活测定，结果显示破碎上清液中CAT酶活力达到5700U/ml ο
[0058]将菌体破碎上清液于4°C，7000r/min离心15min，取上清；上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4°C,7000r/min离心15min,取沉淀物用适量pH7.6的磷酸缓冲液溶解，透析过夜,加入20%硫酸铵后通过0.4μ m膜过滤后制成上样样品；上疏水层析柱(Butyl-Toyopearl650-M, T0S0)，柱子用50mM磷酸钾缓冲液(其中含有1.0mM，pH7.6的硫酸铵)平衡，平衡好以后，线性洗脱(洗脱液为:50mM磷酸钾缓冲液中含有0-1.0mM的硫酸铵)，得到的含过氧化氢酶的部分在50mM的pH7.6的Tris-HCl进行透析(目的是去硫酸铵)；取透析液上阴离子交换柱(DE-52DEAE_cellulose, Whatman),柱子先用50mM的pH7.6的Tris-HCl进行平衡，平衡后线性洗脱(洗脱液为:50mM的pH7.6的Tris-HCl中含0-1.0mM的KCl),收集含酶部分，浓缩(用Centricon-30, Millipore进行浓缩)；浓缩液上凝胶柱(S-200HR Seph-acryl, GE-Healthcare),柱子平衡、洗脱都用50mM ρΗ7.6的磷酸钾缓冲液其中含0.15Μ的KCl ;收集到的含酶液(用50mM的pH7.6的Tris-HCl)脱盐，获得纯化后的酶液。
[0059]将获得的Mn-CAT蛋白进行N端测序，测序结果显示所得Mn-CAT蛋白序列无误，结果符合预期。
[0060]注:BMGY培养基组分:甘油10g/L，YNB13.4g/L，生物素4X 10_4g/L，磷酸钾缓冲液
0.lmol/L (pH6.0)。
[0061]BMMY培养基组分:甲醇40mL/L，YNB13.4g/L，生物素4X 10_4g/L，磷酸钾缓冲液
0.lmol/L (pH6.0)。
[0062]实施例3重组菌KM71/pPIC3.5K_MnCAT的5L发酵罐培养
[0063]3.1发酵罐种子培养
[0064]将重组菌KM71/pPIC3.5K_MnCAT 接种至 50mL 种子培养基中，30°C、200rpm/min 培养 19-22h。
[0065]发酵罐种子培养基组分为:蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L，甘油10g/L，生物素4X 10-4g/L，磷酸钾缓冲液 0.lmol/L (pH6.0)。
[0066]3.2发酵罐发酵
[0067]将种子培养液按10%的 接种量转接至装液量为2L的发酵罐BSM培养基中，发酵参数为--温度30°C，pH5.0，通过调节通气量和搅拌转速控制溶氧在15-20% ;当初始培养基中的甘油耗尽时，开始流加补料培养基，控制甘油在培养液中的终浓度小于10g/l ;当重组菌生长至0D_100-120时，开始连续流加甲醇，控制甲醇在培养液中的体积终浓度小于1.5%(V/V),并添加终浓度为ImM的MnCl2,诱导培养72h，收集菌体、破碎细胞后对上清液进行酶活测定，结果显示破碎上清液中CAT酶活力达到约12000U/ml。[0068]将菌体破碎上清液于4°C，7000r/min离心15min，取上清；上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4°C,7000r/min离心15min,取沉淀物用适量pH7.6的磷酸缓冲液溶解，透析过夜,加入20%硫酸铵后通过0.4μ m膜过滤后制成上样样品；上疏水层析柱(Butyl-Toyopearl650-M, T0S0)，柱子用50mM磷酸钾缓冲液(其中含有1.0mM，pH7.6的硫酸铵)平衡，平衡好以后，线性洗脱(洗脱液为:50mM磷酸钾缓冲液中含有0-1.0mM的硫酸铵)，得到的含过氧化氢酶的部分在50mM的pH7.6的Tris-HCl进行透析(目的是去硫酸铵)；取透析液上阴离子交换柱(DE-52DEAE_cellulose, Whatman),柱子先用50mM的pH7.6的Tris-HCl进行平衡，平衡后线性洗脱(洗脱液为:50mM的pH7.6的Tris-HCl中含0-1.0mM的KCl),收集含酶部分，浓缩(用Centricon-30, Millipore进行浓缩)；浓缩液上凝胶柱(S-200HR Seph-acryl, GE-Healthcare),柱子平衡、洗脱都用50mM pH7.6的磷酸钾缓冲液其中含0.15M的KCl ;收集到的含酶液(用50mM的pH7.6的Tris-HCl)脱盐，获得纯化后的酶液。
[0069]将获得的Mn-CAT蛋白进行N端测序，测序结果显示所得Mn-CAT蛋白序列无误，结果符合预期。[0070]注:BSM培养基=CaSO40.93g/L, K2S0418.2g/L, MgSO4.7Η2014.9g/L, Κ0Η4.13g/L,甘油 30.0g/L，85% 磷酸 26.7mL/L, PTM14.35mL/L。
[0071 ] PTM 微量元素液:CuS04.5H206g/L, KI0.08g/L, MnSO4.H203g/L, NaMoO3.2H200.2g/L, H3BO30.02g/L, CoCl220g/L, ZnCl220g/L, FeSO4.7H2065g/L,生物素 0.2g/L, H2S045.0mL/L。
[0072]流加补料生产培养基:50% (w/v)甘油(含4mL/L PTM微量元素液)。
[0073]流加补料诱导培养基:100%甲醇(含10mL/L PTM微量元素液)。
[0074]综上所述，通过本发明所提供的重组含锰过氧化氢酶的序列所表达的CAT酶活力达到约12000U/ml，具高度产业利用价值，具备很好的应用开发潜力。
[0075]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属【技术领域】中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【权利要求】
1.一种重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No:l所示。
2.一种重组含锰过氧化氢酶，由权利要求1所述的多核苷酸序列编码。
3.一种重组含锰过氧化氢酶表达载体，包含如权利要求1所述的重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体，其特征在于，所述表达载体为PPIC系列表达载体。
5.如权利要求4所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体，其特征在于，所述pPIC系列表达载体为PPIC3.5K。
6.一种工程菌，所述工程菌由权利要求3-5任一权利要求所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体转化获得。
7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌由权利要求3-5任一权利要求所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体转化毕赤酵母获得。
8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母KM71。
9.一种重组含锰过氧化氢酶的制备方法，包括如下步骤:将权利要求6-8任一权利要求所述的工程 菌在种子培养基中活化后，转接至发酵培养基中培养，当菌浓0D600达到100-120时，添加MnCl2和甲醇，并进行诱导培养。
10.如权利要求9所述的一种重组含锰过氧化氢酶的制备方法，其特征在于，所述种子培养基为YPD培养基。
11.如权利要求9所述的一种重组含锰过氧化氢酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为BMGY培养基或BSM培养基。
12.如权利要求9所述的一种重组含锰过氧化氢酶的制备方法，其特征在于，所述诱导培养的具体条件为:在30°C流加甲醇诱导72-120h。
13.如权利要求9所述的一种重组含锰过氧化氢酶的制备方法，其特征在于，所得诱导培养培养液的菌体破碎上清液依次通过常规蛋白纯化方法中的疏水层析、阴离子交换和凝胶过滤进行蛋白纯化，即得所述重组含锰过氧化氢酶。
【文档编号】C12N15/53GK103882038SQ201410128235
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】赵志军, 史吉平, 姜标, 孙俊孙, 何晓娟 申请人:中国科学院上海高等研究院