一株活性嗜热菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种嗜热微生物，为地衣芽孢杆菌属XS2菌株（Geobacillus?pallidus），该菌株的保藏号为CMCCC?No.8338。本发明的XS2菌株用于发酵生产胞外生物乳化剂。本发明中的嗜热菌XS2对pH，温度，盐分具有很强的耐受能力，具有对石油污染环境和油藏环境广泛的适应能力。菌株XS2生产的活性生物乳化剂，具有产量高，活性稳定，适应性强，生产成本相对低廉等优点，可以应用于微生物提高石油采收率，修复环境污染及化工行业，这在提高我国工业生物乳化剂的应用范围和效率方面具有较强的开发潜力。
【专利说明】一株活性嗜热菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于功能微生物筛选、应用【技术领域】，具体涉及一株嗜热菌株及其应用，SP一株能够生产活性生物乳化剂的菌株，以及该菌株转化葡萄糖来分泌胞外生物乳化剂的应用。
【背景技术】
[0002]表面活性剂是同时含亲水和亲油基团，在很低浓度下就能显著降低溶剂表面张力或液-液界面张力的两亲分子化合物的总称。结构上的特点决定了表面活性剂多种理化性质，如双亲性，溶解性，表面吸附等，广泛应用在石油工业，环境工程，食品工业和皮革、建筑、化妆品等领域。
[0003]许多生物来源的分子也具有亲水和亲油基团，表现出很高表面活性，通常把具有亲水和亲油活性的，由微生物、动物或植物产生的天然表面活性剂称为生物表面活性剂(Biosurfactants)0生物表面活性剂具有选择性好、用量少、无毒、可降解、无污染、可引入新化学基团等优点。生物表面活性剂在降粘，提高原油采收率，石油污染土壤的生物修复等石油工业和环境工程领域具有广泛的应用。而能够生产生物表面活性剂的微生物由于其极强的环境适应能力，快速繁殖能力和降解石油类污染物的高活性，在石油污染修复中应用最为广泛，效果也最好。在石油污染地区接种微生物，使微生物产生生物表面活性物质，加速对烃类的乳化分解也是目前普遍采用的污染治理方法。
[0004]研究发现生产生物表面活性剂的微生物中，有的只在降解利用烃类等疏水性碳源时才形成表面活性剂，而有的微生物则只在利用水溶性碳源时才形成表面活性剂，也有的微生物在两类碳源中都能合成生物表面活性剂。而且，目前生物乳化剂的菌株在应用方面的存在如下的问题:1，活性不稳定，多数在实验室条件下活性强的菌株无法应用于实际生产；2，环境适应能力差，实际环境同实验室条件差异过大，如油藏温度多在30-70°C，而实验室一般培养条件为25-30°C，造成微生物无法在实际环境中正常生长和产生活性；3，代谢产物产量低，活性弱，导致在运输和应用方面成本过高，使用效果不理想。因此，筛选具有实用价值的生产生物表面活性剂的微生物就具有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种能够代谢生产生物表面活性剂的嗜热微生物菌株，以及该菌株转化葡萄糖来分泌胞外生物乳化剂的应用，从而弥补现有技术的不足。
[0006]本发明首先提供一种嗜热微生物，为地衣芽孢杆菌属XS2菌株(Geobacilluspallidus)，该菌株的保藏号为CMCCC N0.8338，于2013年10月15日保藏位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0007]本发明的XS2菌株用于发酵生产胞外生物乳化剂；
[0008]本发明还提供一种发酵生产胞外产物的方法，是用XS2菌株转化葡萄糖来发酵生产胞外生物乳化剂；
[0009]其中用于发酵的培养基，包含有如下质量百分比的组分:葡萄糖2%，硝酸钠0.3%，磷酸二氢钾0.042%,磷酸氢二钾0.12%，硫酸亚铁0.005%,硫酸镁0.05%,氯化钙0.005% ;培养基pH为7.5 ;
[0010]将发酵液混合于等体积甲醇混合，-20°c冷冻过夜后，6000rpm离心20min，弃去上清得到乳化剂粗品；
[0011]本发明筛选的XS2菌株所生产的生物乳化剂具有很强的乳化稳定性，发酵原液对液体石蜡的乳化稳定性24h后仍保持68.6±0.4% ；[0012]本发明中的嗜热菌XS2对pH，温度，盐分具有很强的耐受能力，具有对石油污染环境和油藏环境广泛的适应能力。菌株XS2生产的活性生物乳化剂，具有产量高，活性稳定，适应性强，生产成本相对低廉等优点，可以应用于微生物提高石油采收率，修复环境污染及化工行业，这在提高我国工业生物乳化剂的应用范围和效率方面具有较强的开发潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1:碳源对本发明菌株代谢合成生物乳化剂的影响图；
[0014]其中:1-果糖2-半乳糖3-蔗糖4-麦芽糖5-异辛烷6_食用油7_阿拉伯糖8_葡萄糖9-鼠李糖10-液体石蜡11-乳糖12-大豆卵磷脂13-淀粉14-壳聚糖；
[0015]图2:氮源对本发明菌株代谢合成生物乳化剂的影响图；
[0016]图3:乳化剂生产过程中各参数变化规律图；
[0017]图4:分批补料发酵菌体浓度和乳化剂产量变化图；
[0018]图5:不同空隙岩芯模拟发酵液提高石油采收率参数变化图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明的菌株进行详细的描述。
[0020]实施例1:产生物表面活性剂菌株的筛选
[0021]嗜热微生物的活性特征取决于其生长环境的特殊性，将取自中国甘肃玉门油田鸭儿峡油藏石油污染土壤样品同5倍体积的无菌生理盐水振荡混匀，分别取ΙΟΟμ I 土壤悬浊液涂布固体LB平板，温箱60°C培养3d，挑取单克隆，重新在LB平板上划线分离纯化，直到得到纯化后的单克隆，经革兰氏染色发现，菌株XS2为革兰氏阳性菌；经显微镜观察发现，菌株XS2为短杆状，有芽孢；半固体穿刺接种实验表明，菌株XS2为兼性厌氧，硝酸盐还原和脂类水解实验结果呈阳性。提取细胞DNA，用27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1387R (5’ -GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’)引物PCR扩增16S rRNA基因，经测序比对后发现，菌株XS2同Geobacillus pallidus的序列同源性最高,鉴定该菌株为地芽孢杆菌属。培养表明，菌株XS2可以利用多种糖类(葡萄糖，蔗糖，果糖)和烃类物质(石蜡，丙三醇，十六烷，原油)产乳化剂，该菌株在40-80°C、Nacl浓度5-20% (w/v)、pH5_9条件下均能征程生长，降解原油(C9-C37的烃类)活性强，产生物乳化剂活性高(耐受40-80°C，pH5-12，Nacl浓度
1-20%，对液体石蜡乳化能力E24为68%以上)，最适生长温度为60°C，摇床180rpm震荡培养3d条件下，菌株对原油降解率达到45.8%，即9.16g/L。菌株XS2送至中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC N0.8338.[0022]实施例2:菌株Geobacillus sp.XS2的活性与乳化剂性能
[0023]1、菌液制备:种子液涂布LB平板，LB培养基制备如下(w/v):蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，固体培养基添加2%琼脂粉，pH7.5，倒置于60°C恒温培养箱中培养过夜。挑单菌落，划线到新鲜的LB平板上，重复2~3次以获得纯菌。将菌株接种于200ml含2% (w/v)原油无机盐培养基的500mL三角瓶中，180rpm，60°C振荡培养，无机盐配方如下:葡萄糖2%，硝酸钠0.3%，磷酸二氢钾0.042%，磷酸氢二钾0.12%，硫酸亚铁0.005%，硫酸镁0.05%,氯化钙0.005%,培养基pH7.5。原油培养基是上述无机盐培养基中的葡萄糖替换为原油，用于测定菌株XS2降解原油活性。发酵体系在60°C，摇床180rpm震荡培养3d条件下，活菌数量最高达到101°个/ml。
[0024]2、发酵液乳化活性和原油降解活性
[0025]通过等体积发酵液同液体石蜡漩涡振荡混合测试发酵液的乳化活性，结果表明，发酵罐培养40h条件下，发酵原液对液体石蜡的乳化稳定性24小时达68.6±0.4%，表现出了较强的乳化活性。[0026]菌株XS2种子接种到2% (w/v)原油无机盐培养基中，60°C，摇床180rpm震荡培养3d，等体积正己烷萃取残余油，气相色谱分析菌株对原油降解范围和降解率，证明菌株Geobacillus sp.XS2明显降解原油中C8-C18的烃类，原油最高降解率为45.8%，即9.16g/L，表现出了较强的原油降解活性。
[0027]3、乳化剂分离和性能
[0028]将发酵液在4°C, 1000Orpm条件下离心30min除去菌体,旋转蒸发仪按5:1的比例浓缩上清液，转移到烧杯中，加入三倍体积冷甲醇溶液(预先_20°C预冷30min)，4°C静置过夜，11000rpm，4°C离心25min收集沉淀，即为生物乳化剂粗产物。
[0029]采用凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography,GPC)分析了生物乳化剂造成，生物乳化剂中含糖类69.6%，含脂类22.7%，含蛋白质类8.7%。可以耐受30_60°C温度，3-12的pH范围和1-20% (w/v)的盐度，这一特征尤其适合用于我国的高盐碱、高pH和高温油藏的微生物提高石油采收率技术和石油污染修复。
[0030]实施例3:菌株Geobacillus sp.XS2最适发酵条件优化
[0031]1、碳氮源筛选。菌株XS2可以利用糖、有机酸、醇、脂、烃等多种碳源生长。在利用葡萄糖做碳源时，细胞生长速率和乳化活性都达到最高，同时乳化剂产量也最高，如下图1所示。同时筛选了 5种氮源对菌体XS2合成乳化剂的影响如下图2所示，硝酸钠做氮源时，发酵液乳化活性及乳化剂产量最高。因此，选择葡萄糖和硝酸钠作为生物乳化剂发酵生产的最佳碳氮源。
[0032]进一步研究证明，2%葡萄糖条件下，当氮源浓度为3g/L，即碳氮比为20:3时，菌体浓度最大；当氮源浓度为5g/L，碳氮比为20:4时，生物乳化剂的产量最高。因此，在XS2菌株发酵生产乳化剂时，采用分批补料发酵模式，控制发酵过程各阶段的碳氮比，达到了菌体生长和产物合成的最佳状态。
[0033]2、发酵条件优化及发酵动力学研究
[0034]2.1培养条件优化。以发酵液0D、E24和乳化剂产量为指标，优化了菌株XS2在发酵罐中的接种量、初始pH、搅拌转速和通气量对发酵过程的影响。结果证明当接种量为10%(v/v), pH在7-7.5之间，通气量为4L/min，搅拌转速为550rpm时，细胞密度和乳化剂产量达到最高(图3)。实验证明本申请中生物乳化剂为典型的部分生长偶联模型，最终所形成的生物乳化剂由两部分组成，包括菌体生长阶段合成的生物乳化剂和菌体生长停止后合成的大量生物乳化剂。结论为优化补料方式方法和开发新的发酵工艺，进一步提高生物乳化剂发酵水平提供了理论指导。
[0035]分别在培养8h，16h, 24h和32h进行补料发酵。补料液为6%(w/v) NaNO3和40%(w/V)葡萄糖溶液，每次补加100ml NaNO3溶液和200ml葡萄糖溶液。如图4所示，经过补加碳、氣源，提闻了菌体的终浓度，生物乳化剂的广量也随之大大提闻，最闻达23.4g/L,是最初的乳化剂产量的5倍左右。
[0036]实施例4:菌株Geobacillus sp.XS2在提高石油采收率(MEOR)的应用
[0037]研究了生物表面活性剂规模化培养，如实施例2表述，采用小型发酵罐在实验室内完成了小试研究和运行，进一步对生物表面活性剂在三次采油中的应用进行深入验证，实施过程如下:利用四种不同孔隙度和渗透率的岩芯在物理条件下模拟生物表面活性剂的驱油性能，结合两种不同粘度的原油和0.15%的聚丙烯酰胺(HPAM)进行复合实验，如下表1所示。
[0038]表1:生物表面活性剂物理模拟驱油实验研究
【权利要求】
1.一种嗜热微生物，其特征在于，所述的嗜热微生物的保藏号为CMCCC N0.8338。
2.权利要求1所述的嗜热微生物本在发酵生产胞外生物乳化剂中的应用。
3.一种发酵生产胞外产物的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求1所述的嗜热微生物转化葡萄糖，再从发酵液中分离胞外生物乳化剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵生产胞外生物乳化剂的培养基，包含有如下质量百分比的组分:葡萄糖2%，硝酸钠0.3%，磷酸二氢钾0.042%，磷酸氢二钾0.12%，硫酸亚铁0.005%，硫酸镁0.05%,氯化钙0.005% ;培养基pH为7.5。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵液与等体积甲醇混合，-20°C冷冻过夜后，6000rpm离心20min，弃去上清得到胞外生物乳化剂。
6.一种乳化剂，其特征在于，所述的乳化剂是由权利要求1所述的嗜热微生物发酵制备的。
7.如权利要求6所述的乳化剂，其对液体石蜡的乳化稳定性24h后仍保持68.6±0.4%ο
【文档编号】C12N1/20GK103834590SQ201410033904
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】黄志勇, 王兴彪, 徐爽, 王曼曼 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所