一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法
【专利摘要】本发明酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，涉及用DNA重组技术制备微生物，是一种运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，构建异丁醇产量高的酿酒酵母菌株的方法，步骤是：第一步，过量表达酿酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWF1基因质粒的构建；第二步，高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103的构建。本发明方法克服了现有技术存在的产异丁醇酿酒酵母细胞中由于过量表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的不平衡等因素而制约异丁醇产量进一步提高的缺陷。
【专利说明】一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明的技术方案涉及用DNA重组技术制备微生物，具体地说是一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法。
【背景技术】
[0002]异丁醇具有较小的挥发性、腐蚀性、较高的辛烷值和能量密度，且易于储存和运输，是一种新型的具有巨大市场潜力的生物燃料。酿酒酵母由于其对异丁醇的耐受性较好、具有利用纤维素水解物的优势和自身具有合成异丁醇的优势基因的优势，可以作为生产异丁醇的优势宿主菌株。
[0003]现有技术中，产异丁醇酿酒酵母细胞中由于过量表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的不平衡，制约了异丁醇产量进一步的提高，这些缺陷在图6中显示出来。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是:提供一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，是一种运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，构建异丁醇产量高的酿酒酵母菌株的方法，克服了现有技术存在的产异丁醇酿酒酵母细胞中由于过量表达ILV2、ILV3和ILV5基因导致从丙酮酸到2-酮异戊酸中辅酶NADPH/NADP+的不平衡等因素而制约异丁醇广量进一步提闻的缺陷。 [0005]本发明解决该技术问题所采用的技术方案是:一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，宿主菌为酿酒酵母菌，同时转入过量表达ILV2、ILV3、ILV5、ZffFl基因的质粒YEplacl95-PGKlp-1LV2、YEplacl81_PGKlp_ILV3 和 YEplacl 12-PGKlp-ZWFl_PGKlp-1LV5，其具体步骤是:
[0006]第一步，过量表达酿酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWFl基因质粒的构建
[0007](1.1)酵母W303-1A染色体的制备:将酵母菌W303-1A接种于5mL的YPD培养基中，在30°C振培过夜得培养液，将该培养液分装到2个1.5mL的离心管中，用离心机转速为12000rpm离心30s，取上清，加0.5mL水重悬，枪头反复抽吸以分散菌体沉淀，然后用离心机转速为12000rpm离心30s，收集菌体，于每支离心管中加入200 μ L破菌缓冲液重悬细胞，再于每支离心管中加入200 μ L体积的玻璃珠和ρΗ>7的200 μ L酚/氯仿液体，用6000rpm的速度振荡4min，再加200 μ L缓冲液TE，快速振荡，用离心机转速为12000rpm离心5min，取上清，重复酚抽提至无中间沉淀相，然后加入ImL无水乙醇，颠倒混匀，用离心机转速为12000rpm离心3min,弃上清，沉淀用0.4mL TE缓冲液溶解，然后加3 μ L的lmg/mL的RNA酶混合，于37°C温育5min,再加入10 μ L的4mol/L的NaAc溶液及ImL的无水乙醇,颠倒混匀，于室温下离心机转速为12000rpm离心3min，弃上清，干燥沉淀DNA，再用100 μ L的TE缓冲液溶解，得到酵母W303-1A染色体；
[0008](1.2)质粒 YEplacl95-PGKlp'YEplacl81-PGKlp 和 YEplacl l2_PGKlp 的构建[0009]扩增PGKlpromoter基因:根据酵母W303-1A染色体上PGKl基因序列设计引物，引物 PGKlpromoter-U (BamH I )的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGGATCCAGGCAITTGCAAGAATTACTC3’，引物PGKlpromoter-D (Sal I )的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTMA AAGTAG3PCR反应体系为:引物PGKlpromoter-U (BamH I )和PGKlpromoter-D (Sal I )为各I μ L、200 μ M的dNTP为4 μ L、10 X聚合酶缓冲液为5 μ L、酵母W303-1A染色体为模版0.5 μ L、双蒸水38.25 μ L和聚合酶0.25 μ L ；PCR反应条件为:94°C变性4min, 94°C变性30s, 58°C退火 30s, 72°C 延伸 lmin,得到 PCR 扩增产物 PGKlpromoter 基因；将 YEplacl95、YEplacl81、YEplacll2和扩增的PGKlpromotor基因分别用限制性内切酶Sal I和BamH I消化，消化体系为:DNA5 μ L，Sal I和BamH I为各0.25 μ L，10X酶缓冲液2 μ L，加无菌水 12.5μ L，在 37°C条件下消化 IOmin ;用 T4 连接酶将 YEplacl95、YEplacl81、YEplacll2和PGKlpromotor基因的连接:在三个1.5mL离心管中分别加入YEplacl95、YEplacl81和YEplacl 12各(λ 5μ L~I μ L，再分别加入10 X T4连接酶缓冲液2 μ L、T4连接酶0.2 μ L、PGKlpromotor基因片段8 μ L,最后分别加无菌水至20 μ L总体积,在16°C条件下连接I~2h得到连接产物；取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到 YEplacl95-PGKlp、YEplacl81_PGKlp 和 YEplacl 12-PGKlp 质粒;
[0010](1.3)质粒 YEplacl95-PGKlp-1LV2 的构建
[0011]根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV20RF-U的寡核苷酸序列为:5’ GGGCCCGTCGACATGATCAGACAATCTACGCT3’，引物 ILV20RF-D 的寡核苷酸序列为:5’ GGGCCCCTGCAGCGTTTAGCTGGCTCCTGATG3’ ；PCR 反应体系为:引物 ILV20RF-U和ILV20RF-D各为1μ?，200μΜ的dNTP为4 μ L，IOX聚合酶缓冲液为5 μ L，酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5 μ L，双蒸水为38.25 μ L,聚合酶为0.25 μ L ；PCR反应条件为:94°C变性4min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，得到PCR扩增产物ILV20RF基因dfYEplacl95-PGKlp和扩增的ILV20RF基因片段分别用限制性内切酶Sal I和Pst I消化，消化体系为:DNA为5 μ L，用Sal I和Pst I各0.25 μ L，10 X酶缓冲液为2 μ L，加无菌水12.5μ L，在37°C条件下消化IOmin ;用T4连接酶将YEplacl95_PGKlp和ILV20RF基因连接:在1.5mL离心管中，加入10XT4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplacl95-PGKlp和ILV20RF基因片段的加入量分别为0.5 μ L~8 μ L，再用无菌水将总体积补至20 μ L，在16°C条件下连接I~2h得到连接产物，取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplacl95-PGKlp-1LV2 ；
[0012](1.4)质粒 YEplacl81-PGKlp_ILV3 的构建
[0013]根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV30RF-U的寡核苷酸序列为:5’ GGGCCCGTCGACATGGGCTTGTTAACGAAAGT3’，引物 ILV30RF-D 的寡核苷酸序列为:5’ GGGCCCCTGCAGGTAGAGGTGGCTTCGTCGTA3’ ；PCR 反应体系为:引物 ILV30RF-U和ILV30RF-D各为1μ?，200μΜ的dNTP为4 μ L，IOX聚合酶缓冲液为5 μ L，酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5 μ L，双蒸水为38.25 μ L,聚合酶为0.25 μ L ；PCR反应条件为:94°C变性4min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，得到PCR扩增产物ILV30RF基因dfYEplacl81-PGKlp和ILV30RF基因片段分别用限制性内切酶Sal I和Pst I消化，消化体系为:DNA为5 μ L，Sal I和Pst I各0.25 μ L，10 X酶缓冲液2 μ L，加无菌水12.5 μ L，在37°C条件下消化IOmin ;用T4连接酶将YEplacl81_PGKlp和ILV30RF基因连接:在1.5mL离心管中，加入IOXT4连接酶缓冲液2 μ L、T4连接酶0.2μ L、YEplacl81-PGKlp和ILV30RF基因片段的加入量分别为0.5μ L~8μ L，再加无菌水至总体积为20μ L，在16°C条件下连接I~2h得到连接产物；取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplacl81-PGKlp-1LV3 ；
[0014](1.5)质粒 YEplacll2-PGKlp-1LV5 的构建
[0015]根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV50RF-U的寡核苷酸序列为:5’ GGGCCCGTCGACATGTTGAGAACTCAAGCCGC3’，引物 ILV50RF-D 的寡核苷酸序列为:5’ GGGCCCCTGCAGACGTGACTTGACGAGTTG5’ ；PCR 反应体系为:引物 ILV50RF-U 和ILV50RF-D各为1 μ L, 200 μ M的dNTP为4 μ L, 10 X聚合酶缓冲液为5 μ L，酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5 μ L，双蒸水为38.25 μ L，聚合酶为0.25 μ L ;PCR反应条件为:94°C变性4min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，得到PCR扩增产物ILV50RF基因；将YEplacl 12-PGKlp和ILV50RF基因片段用限制性内切酶Sal I和Pst I消化，消化体系为:DNA为5yL，Sal I和Pst I各为0.25 μ L，10X酶缓冲液为2 μ L，加无菌水12.5 μ L，在37°C条件下消化IOmin ;用T4连接酶将YEplacl 12-PGKlp和ILV50RF基因连接:在1.5mL离心管中，加入IOXT4连接酶缓冲液2 μ L、T4连接酶0.2μ L、YEplacll2-PGKlp和ILV50RF基因片段的加入量分别为0.5μ L~8μ L，再加无菌水至总体积为20μ L，在16°C条件下连接I~2h得到连接产物；取10 μ L连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplacl 12-PGKlp-1LV5 ；
[0016](1.6)质粒 YEplacl 12-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5 的构建
[0017]质粒YIplac211_PGKlp (Sal I /Xba I )的构建:扩增 PGKlpromoter 基因:根据酿酒酵母W303-1A染色体上PGKl基因序列设计引物，引物PGKlpromoter-U (Sal I )的寡核苷酸序列为 5’ GGGCCCGTCGACAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，引物 PGKlpromoter-D (Xba I )的寡核苷酸序列为 5’GGGCCCTCTAGATGTTTTATATTTGTTGTAAA AAGTAG3’;用酿酒酵母 W303-1A染色体为模版，用引物 PGKlpromoter-U(Sal I )和 PGKlpromoter-D (Xba I )做 PCR,得到PCR扩增产物PGKlpromoter基因片段；将YIplac211和PGKlpromotor基因用限制性内切酶Sal I和Xba I在37°C条件下消化IOmin后失活；用1；连接酶将YIplac211和PGKlpromotor在16 °C条件下连接I~2h得到连接产物；取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YIplac211-PGKlp(Sal I /Xba I );扩增ZWFl-ORF基因:根据酿酒酵母W303-1A染色体上ZWFl基因序列设计引物，引物 ZWFIORF-U 的寡核苷酸序列为 5’ GGGCCCTCTAGAATGAGTGAAGGCCCCGTCAA3’，引物 ZWF10RF-D 的寡核苷酸序列为:5’ GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’ ；用酿酒酵母W303-1A染色体为模版，用引物ZWF10RF-U和引物ZWF10RF-D做PCR，得到PCR扩增产物ZffFl-ORF 基因片段；将 YIplac211-PGKlp 和 ZffFlORF 基因片段用 Xba I 和 BamH I 在 37°C条件下消化IOmin后失活；用T4连接酶将Hplac211-PGKlp和ZWF10RF基因片在16°C条件下连接I~2h，把10 μ L连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证得到质粒nplac211-PGKlp-ZWFl ;以质粒Hplac211-PGKlp-ZWFl为模板，用引物序列为 5’GGGCCCGGATCCAGGCAITTGCAAGAATTACTC3’的 PGKlpromoter-U (BamH I )和序列为5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’ 的 ZWF10RF-D 做 PCR，得到两端都含有 BamH I 酶切位点的PCR产物，将此PCR产物和质粒YEplacll2-PGKlp-1LV5同时用BamH I消化IOmin后失活，用T4连接酶将两片段在16°C条件下连接I~2h得到连接产物，取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到质粒YEplacll2-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV50
[0018]第二步，高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103的构建
[0019]将第一步中构建的质粒YEplacl95-PGKlp_ILV2、YEplacl81_PGKlp_ILV3 和YEplacl 12-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5共同转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-uraci 1/Tryptophan/Leucine固体培养基上培养2~3天后,筛选同时带有这三个质粒的转化子，构建得到高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103 (MATa leu2-3, 112ura3-ltrpl-92his3-ll, 15ade2-lcanl-100YEplacl95-PGKlp-1LV2YEplacl81-PGKlp-1LV3YEplaclI
2-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5)0
[0020]大量实验证明:经上述方法一定能构建出一种高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103ο
[0021]上述一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，所用的原料物均是公知的并从商购获得，其中:
[0022]大肠杆菌E.coli ToplO购自北京天根生化科技有限公司。
[0023]宿主菌酿酒酵母菌为酿酒酵母菌株W303-1A (MATa leu2_3, 112ura3-ltrpl_92his
3-11，15ade2-lcanl_10 0(Thomasand Rothstein, 1989))。
[0024]质粒Hplac211、YEplacl95、YEplacl81:YEplacll2 购自北京天根生化科技有限公司。
[0025]引物来自北京奥科鼎盛生物科技有限公司。
[0026]担体DNA (Single-stranded DNA)来自 Sigma-Aldrich 公司。
[0027]PEG400 为 50%PEG80% (v/v)UOxTE (ρΗ7.5) 10% 和 IOx 乙酸锂贮存液 10%
[0028]LB (Luria-Bertani)液体培养基:1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物和l%NaCl，用NAOH调pH=7.5，于121°C下灭菌15min，冷却至室温加入氨苄青霉素，至终浓度为Ig氨苄青霉素/L，得到LB液体培养基。
[0029]LB固体培养基:在调好pH值为7.5的LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，于121 °C下灭菌15min，冷却至室温加入氨苄青霉素，至终浓度为Ig氨苄青霉素/L，得到LB固
体培养基。
[0030]YPD液体培养基:1%酵母提取物和2%蛋白胨，在pH自然条件下，于121°C下灭菌15min,再加入单独灭菌的40%葡萄糖至终浓度为2%。
[0031]YPD固体培养基:在YPD液体培养基中加入1.5% (w/v)琼脂粉，于121°C下灭菌15min。
[0032]完全极限培养基(CM):0.67%YNB(Bacto Yeast Nitrogen Base without AminoAcids (Difco))和 0.83g/L Dropout Power，其中 Dropout Power 由以下成分构成:腺票呤50mg/L、亮氨酸100m/L、精氨酸20mg/L、赖氨酸30mg/L、天冬氨酸100mg/L、甲硫氨酸20mg/L、谷氨酸100mg/L、苯丙氨酸50mg/L、组氨酸100mg/L、丝氨酸150mg/L、异亮氨酸30mg/L、苏氨酸150mg/L、色氨酸100mg/L、酪氨酸30mg/L、尿嘧唳50mg/L、缴氨酸150mg/L。
[0033]省却特定的氨基酸成分，可做成选择培养基。液体培养基调节pH为5.6，固体培养基调节pH为6.5，再加入1.5%的琼脂，于121°C灭菌15min。
[0034]上述涉及的％，除特别注明的之外，均为质量百分比。
[0035]上述一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，所述酿酒酵母细胞的转化方法是:
[0036](I)将平板上的酿酒酵母菌株接入5ml液体YPD中，30°C，200rpm振荡培养过夜；
[0037](2 )将担体DNA (2mg/ml)于沸水浴煮5分钟后，置于冰上；
[0038](3)取1.5ml酿酒酵母培养液，13000rpm离心30sec,收集菌体,弃上清；
[0039](4)往离心管中加入360 μ I的转化混合物，在漩涡分离器上高速振荡混匀。转化混合物的配置如下:
【权利要求】
1.一种酿酒酵母异丁醇高产菌株的构建方法，其特征在于:宿主菌为酿酒酵母菌，同时转入过量表达ILV2、ILV3、ILV5、ZffFl基因的质粒YEplacl95_PGKlp_ILV2、YEplacl81-PGKlp-1LV3 和 YEplacl 12-PGKlp-ZWFl_PGKlp-1LV5，其具体步骤是: 第一步，过量表达酿酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWFl基因质粒的构建(1.0酵母W303-1A染色体的制备:将酵母菌W303-1A接种于5mL的YPD培养基中，在30°C振培过夜得培养液，将该培养液分装到2个1.5mL的离心管中，用离心机转速为12000rpm离心30s，取上清，加0.5mL水重悬，枪头反复抽吸以分散菌体沉淀，然后用离心机转速为12000rpm离心30s，收集菌体，于每支离心管中加入200 μ L破菌缓冲液重悬细胞，再于每支离心管中加入200 μ L体积的玻璃珠和ρΗ>7的200 μ L酚/氯仿液体，用6000rpm的速度振荡4min，再加200 μ L缓冲液TE，快速振荡，用离心机转速为12000rpm离心5min，取上清，重复酚抽提至无中间沉淀相，然后加入ImL无水乙醇，颠倒混匀，用离心机转速为12000rpm离心3min,弃上清，沉淀用0.4mL TE缓冲液溶解，然后加3 μ L的lmg/mL的RNA酶混合，于37°C温育5min,再加入10 μ L的4mol/L的NaAc溶液及ImL的无水乙醇,颠倒混匀，于室温下离心机转速为12000rpm离心3min，弃上清，干燥沉淀DNA，再用100 μ L的TE缓冲液溶解，得到酵母W303-1A染色体；
(1.2)质粒 YEplacl95-PGKlp、YEplacl81_PGKlp 和 YEplacl 12-PGKlp 的构建扩增PGKlpromoter基因:根据酵母W303-1A染色体上PGKl基因序列设计引物，引物PGKlpromoter-U(BamH I )的寡核苷酸序列为:5’ GGGCCCGGATCCAGGCAITTGCAAGAATTACTC3’，引物PGKlpromoter-D (Sal I )的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTMA AAGTAG3PCR反应体系为:引物PGKlpromoter-U (BamH I )和PGKlpromoter-D (Sal I )为各I μ L、200 μ M的dNTP为4 μ L、10 X聚合酶缓冲液为5 μ L、酵母W303-1A染色体为模版0.5 μ L、双蒸水38.25 μ L和聚合酶0.25 μ L ；PCR反应条件为:94°C变性4min, 94°C变性30s, 58°C退火 30s, 72°C 延伸 lmin,得到 PCR 扩增产物 PGKlpromoter 基因；将 YEplacl95、YEplacl81、YEplacll2和扩增的PGKlpromotor基因分别用限制性内切酶Sal I和BamH I消化，消化体系为:DNA5 μ L，Sal I和BamH I为各0.25 μ L，10X酶缓冲液2 μ L，加无菌水 12.5 μ L，在 37°C条件下消化 IOmin ;用 T4 连接酶将 YEplacl95、YEplacl81、YEplacl 12和PGKlpromotor基因的连接:在三个1.5mL离心管中分别加入YEplacl95、YEplacl81和YEplacl 12各(λ 5μ L~I μ L，再分别加入10 X T4连接酶缓冲液2 μ L、T4连接酶0.2 μ L、PGKlpromotor基因片段8 μ L,最后分别加无菌水至20 μ L总体积,在16°C条件下连接I~2h得到连接产物；取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到 YEplacl95-PGKlp、YEplacl81_PGKlp 和 YEplacl 12-PGKlp 质粒; (1.3)质粒 YEplacl95-PGKlp-1LV2 的构建 根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV20RF-U的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGTCGACATGATCAGACAATCTACGCT3’，引物 ILV20RF-D 的寡核苷酸序列为:5，GGGCCCCTGCAGCGTTTAGCTGGCTCCTGATG3，；PCR反应体系为:引物 ILV20RF-U和 ILV20RF-D各为IyLJOOyM的dNTP为4yL，IOX聚合酶缓冲液为5 μ L，酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5 μ L，双蒸水为38.25 μ L，聚合酶为0.25 μ L ;PCR反应条件为:94°C变性4min，94°C变性 30s，58°C退火30s，72°C延伸 2min，得到 PCR扩增产物 ILV20RF基因；将 YEplacl95_PGKlp和扩增的ILV20RF基因片段分别用限制性内切酶Sal I和Pst I消化，消化体系为:DNA为5 μ L，用Sal I和Pst I各0.25 μ L，10 X酶缓冲液为2 μ L，加无菌水12.5 μ L，在37°C条件下消化IOmin ;用T4连接酶将YEplacl95-PGKlp和ILV20RF基因连接:在1.5mL离心管中，加入IOXT4连接酶缓冲液2 μ L、T4连接酶0.2μ L、YEplacl95-PGKlp和ILV20RF基因片段的加入量分别为0.5μ L~8μ L，再用无菌水将总体积补至20μ L，在16°C条件下连接I~2h得到连接产物，取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplacl95-PGKlp-1LV2 ； (1.4)质粒 YEplacl81-PGKlp-1LV3 的构建 根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV30RF-U的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGTCGACATGGGCTTGTTAACGAAAGT3’，引物 ILV30RF-D 的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCCTGCAGGTAGAGGTGGCTTCGTCGTA3，；PCR反应体系为:引物 ILV30RF-U和 ILV30RF-D各为IyLJOOyM的dNTP为4yL，IOX聚合酶缓冲液为5 μ L，酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5 μ L，双蒸水为38.25 μ L，聚合酶为0.25 μ L ;PCR反应条件为:94°C变性4min，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min，得到 PCR扩增产物 ILV30RF基因；将 YEplacl81_PGKlp和ILV30RF基因片段分别用限制性内切酶Sal I和Pst I消化，消化体系为:DNA为5 μ L，Sal I和Pst I各0.25 μ L，IOX酶缓冲液2 μ L，加无菌水12.5 μ L，在37 °C条件下消化IOmin ;用1\连接酶将YEplacl81-PGKlp和ILV30RF基因连接:在1.5mL离心管中，加入IOXT4连接酶缓冲液2 μ L、T4连接酶0.2 μ L、YEplacl81_PGKlp和ILV30RF基因片段的加入量分别为0.5 μ L~8 μ L，再加无菌水至总体积为20 μ L，在16°C条件下连接I~2h得到连接产物；取10μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YEplacl81-PGKlp-1LV3 ； (1.5)质粒 YEplacl 12-PGKlp-1LV5 的构建 根据酿酒酵母W303-1A染色体上ILV5基因序列设计引物，引物ILV50RF-U的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCGTCGACATGTTGAGAACTCAAGCCGC3’，引物 ILV50RF-D 的寡核苷酸序列为:5’GGGCCCCTGCAGACGTGACTTGACGAGTTG5’ ;PCR 反应体系为:引物 ILV50RF-U和 ILV50RF-D 各为1 μ L, 200 μ M的dNTP为4 μ L，10 X聚合酶缓冲液为5 μ L，酿酒酵母W303-1A染色体为模版0.5 μ L,双蒸水为38.25 μ L,聚合酶为0.25 μ L ；PCR反应条件为:94°C变性4min, 94°C变性30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min，得到 PCR扩增产物 ILV50RF基因 ^fYEplacl 12-PGKlp 和ILV50RF基因片段用限制性内切酶Sal I和Pst I消化，消化体系为:DNA为5μ L，Sal I和Pst I各为0.25 μ L，IOX酶缓冲液为2 μ L，加无菌水12.5 μ L，在37°C条件下消化IOmin ；用T4连接酶将YEplacl 12-PGKlp和ILV50RF基因连接:在1.5mL离心管中，加入10 X T4连接酶缓冲液2μL、T4连接酶0.2μL、YEplaC112-PGKlp和ILV50RF基因片段的加入量分别为0.5 μ L~8 μ L，再加无菌水至总体积为20 μ LA 16°C条件下连接I~2h得到连接产物；取10 μ L连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到 YEplacl 12-PGKlp-1LV5 ； (1.6)质粒 YEplacl 12-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5 的构建 质粒YIplac211-PGKlp(Sal I /Xba I )的构建:扩增PGKlpromoter基因:根据酿酒酵母W303-1A染色体上PGKl基因序列设计引物，引物PGKlpromoter-U (Sal I )的寡核苷酸序列为 5’GGGCCCGTCGACAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，引物 PGKlpromoter-D (Xba I )的寡核苷酸序列为 5’GGGCCCTCTAGATGTITTATAITTGTTGTAAA AAGTAG3’;用酿酒酵母W303-1A染色体为模版，用引物 PGKlpromoter-U (Sal I )和 PGKlpromoter-D (Xba I )做 PCR，得到 PCR 扩增产物PGKlpromoter基因片段；将Hplac211和PGKlpromotor基因用限制性内切酶Sal I和Xba I在37°C条件下消化IOmin后失活；用T4连接酶将YIplac211和PGKlpromotor在16°C条件下连接I~2h得到连接产物；取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到YIplac211_PGKlp (Sal I /Xba I );扩增ZffFl-ORF基因:根据酿酒酵母W303-1A染色体上ZWFl基因序列设计引物，引物ZWF10RF-U的寡核苷酸序列为 5’ GGGCCCTCTAGAATGAGTGAAGGCCCCGTCAA3’，引物 ZWF10RF-D 的寡核苷酸序列为:5 ’ GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3 ’ ；用酿酒酵母 W303-1A 染色体为模版，用引物ZWF10RF-U和引物ZWF10RF-D做PCR，得到PCR扩增产物ZWFl-ORF基因片段；将YIplac211-PGKlp和ZWF10RF基因片段用Xba I和BamH I在37°C条件下消化IOmin后失活；用T4连接酶将YIplac211-PGKlp和ZWF10RF基因片在16 °C条件下连接I~2h，把IOuL连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证得到质粒YIplac211-PGKlp-ZffFl ;以质粒 Hplac211-PGKlp-ZWFl 为模板，用引物序列为 5’GGGCCCGGATCCAGGCAITTGCAAGAATTACTC3’的 PGKlpromoter-U (BamH I )和序列为 5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’的ZWF10RF-D做PCR，得到两端都含有BamH I酶切位点的PCR产物，将此PCR产物和质粒YEplacl 12-PGKlp-1LV5同时用BamH I消化IOmin后失活，用T4连接酶将两片段在16°C条件下连接I~2h得到连接产物，取10 μ L该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞进行培养，然后提取质粒，通过酶切验证，构建得到质粒YEplacll2-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV50 第二步，高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103的构建 将第一步中构建的质粒 YEplacl95-PGKlp-1LV2、YEplacl81_PGKlp_ILV3 和YEplacl 12-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5共同转化入酿酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-uraci 1/Tryptopha n/Leucine固体培养基上培养2~3天后,筛选同时带有这三个质粒的转化子，构建得到高产异丁醇的酿酒酵母菌株HBGDAL-103 (MATa leu2-3, 112ura3-ltrpl-92his3-ll, 15ade2-lcanl-100YEplacl95-PGKlp-1LV2YEplacl81-PGKlp-1LV3YEplaclI2-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5)0
【文档编号】C12N15/81GK103789341SQ201410033944
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】张爱利, 李杨, 高玉菡 申请人:河北工业大学