一种鉴定红鳍东方鲀亲子关系的分子标记方法及其微卫星与试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供利用分子标记方法对红鳍东方纯亲子关系进行鉴定的方法及其微卫星引物与试剂盒，所选择的44对微卫星引物在红鳍东方纯PCR扩增反应稳定、扩增片段清楚、多态性高。运用本技术，可将混杂的不同家系的红鳍东方纯个体区分开来，有助于快速、准确鉴别不同家系的红鳍东方纯，对红鳍东方纯保种、繁殖配组和选择育种具有极大的应用价值。
【专利说明】—种鉴定红鳍东方鈍亲子关系的分子标记方法及其微卫星与试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子标记【技术领域】，涉及利用分子标记方法对红鳍东方纯亲子关系进行鉴定的方法及其微卫星引物与试剂盒。
【背景技术】
[0002]红鳍东方纯(Takifugu rubripes)属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、纯形目(Tetraodontiformes)、纯亚目(Tetraodontoidei)、纯总科(Tetraodntoidea)、纯科(Tetraodontidae)、东方纯属(Takifugu),俗称为“河豚”,主要产于我国的渤海、黄海和东海，在国外则主要分布于日本沿海和朝鲜半岛。红鳍东方纯肉质细嫩、味道鲜美、高蛋白低脂肪、含有丰富的维生素和微量元素，素有“鱼中之王”的美誉。红鳍东方纯虽然具有较为全面的优良性状，但在现阶段实际养殖过程中无品种可言，有关红鳍东方纯的选择育种研究也相对较少。因此，通过遗传改良手段，培育出经济性状优良的红鳍东方纯新品种或新品系是十分重要的。
[0003]从目前的研究基础分析，改良红鳍东方纯的主要经济性状采用多家系选择育种技术是较为有效的方法。多家系选育技术主要为:以雌雄1:1配组建立多个全同胞家系，通过养殖对比实验，分析每个家系的生长、抗病、抗逆、品质等性状，经过多代优良性状组合，选育出经济性状更加优良的新品种或新品系。在养殖对此实验中，通常是将不同家系饲养在独立的水槽中，这就需要占用大用的养殖设施和水槽。目前，也可通过对个体进行电子标记，然后混合饲养在一个大的水泥池中，以减少环境对不同家系的影响，但此方法也存在一定的弊端:在个体进行电子标记钱仍需要将不同家系在独立水槽中饲养4-5个月，当个体体重达到50g左右才能进行电子标记。此外，养殖在独立水槽中的鱼苗比大池中养殖的鱼苗生长缓慢。另外，个体电子标记的成本也较高，平均一个电子标记牌要20元左右。
[0004]因此，在不影响鱼·体生长的情况下寻找到一种准确鉴定亲子关系，快速、准确的区分不同家系，将有效推动红鳍东方纯新品种的选育进程。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供利用分子标记方法对红鳍东方纯亲子关系进行鉴定的方法及其微卫星引物与试剂盒，有助于快速、准确鉴别不同家系的红鳍东方纯，在红鳍东方纯选择育种和遗传保种中有极大的应用价值。
[0006]本发明一方面涉及一种鉴定红鳍东方纯亲子关系的微卫星引物，其特征在于，所述引物针对红鳍东方纯基因组的不同连锁群。
[0007]优选地，所述引物选自如下引物对中的3-10对:
[0008]
【权利要求】
1.一种鉴定红鳍东方纯亲子关系的微卫星引物，其特征在于，所述引物针对红鳍东方纯基因组的不同连锁群。
2.根据权利要求1所述的微卫星引物，其特征在于，所述引物选自如下引物对中的3-10 对:
3.根据权利要求1或2所述的微卫星引物，其特征在于，所述引物由如下引物对组成:
4.一种鉴定红鳍东方纯亲子关系的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1_3中任一项所述的鉴定红鳍东方纯亲子关系的微卫星引物。
5.一种鉴定红鳍东方纯亲子关系的分子标记方法其特征在于采用以下步骤: (1)选择表1中44对特异微卫星引物进行PCR反应； (2)采集不同家系亲本和子代个体的鳍条，提取基因组DNA； (3)用步骤(2)的基因组DNA为模板，步骤⑴所选择的44对微卫星引物进行PCR扩增； (4)对步骤(3)的PCR产物用扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，硝酸银染色、显色后，凝胶在HP scanjet G4010扫描仪成像； (5)将PCR的电泳检测结果数字化处理，用遗传分析软件进行分析； (6)获得每个微卫星标记的排除率，统计3-10个标记的累积排除率；利用排除率前5位的标记组合使用，完成家系子代与亲本的亲子关系鉴定； (7)利用亲本与子代的亲子关系，就能将不同红鳍东方纯家系区分开来。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，在进行PCR扩增时，PCR反应总体积为 25 μ L,包括:10 X Buffer2.5 μ L, 25mmol/L 的 Mg2+I μ L，各 2mmol/L 的 dNTPsl μ L,ΙΟμ mol/L的正、反向引物各I μ L，50ng/μ L的模版DNAl μ L，Taq DNA聚合酶1U，加适量ddH20。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，退火30s—72°C延伸30s进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，使用的遗传分析软件为Gel-Pro Analyzer4.5 凝胶分析软件和 CERVUS Version3.0。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，用遗传分析软件对电泳谱带进行数字化处理，计算每个微卫星标记的排除率；按照排除率高低，挑选排序前10位的微卫星标记，3-10个微卫星标记的累积排除率范围为95.79% -99.99% ;利用5个排除率排序在前的微卫星标记完成了家系亲本与子代的亲子关系鉴定。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，排除率前5位的微卫星标记名称和序列信息如下:
【文档编号】C12Q1/68GK103866004SQ201410033662
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】刘永新, 周勤, 张红涛 申请人:中国水产科学研究院, 中国水产科学研究院北戴河中心实验站