一种肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量pcr检测方法和检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法和检测试剂盒。这种试剂盒及检测方法以转基因调控元件CaMV35S启动子、NOS终止子以及标记基因NPTII为检测对象，同时针对多个基因片段进行检测，可以有效应对肉制品等深加工产品中DNA遭受破坏的问题，降低假阴性几率，而且解决了转基因源不确定性的问题，同时满足目前的快速、灵敏、操作简便、高通量、低成本的检测要求，实现对该类产品植物源性转基因成分有效分析、监控。
【专利说明】-种肉制品中植物源性转基因成分多重焚光定量PCR检测 方法和检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种本发明涉及一种肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR 检测方法和检测试剂盒，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 目前，我国肉制品产量和消费量均居世界首位。在现代肉类产品加工过程中，为 改善肉制品的品质、优化产品质量、确保营养均衡，植物源的成份如植物蛋白、淀粉、膳食纤 维、食用胶、植物油以及各种调味品等被运用到肉制品的加工中。随着转基因植物的大规模 商品化，多种转基因作物豆、水稻、玉米、油菜籽等及其加工产品已广泛应用于食品制造业， 因此，在肉制品年加工过程中植物源成分被添加的同时，转基因成分间接地、不可避免地会 渗入到肉制品的领域。因此，敏感、快速、准确的转基因食品定性及定量检测方法的研究日 益受到重视。核酸检测方法是最常用以及最适用的检测转基因食品的方法，主要有定性PCR 方法、荧光定量PCR，其中荧光定量PCR是近年来发展起来的一种分子生物学检测技术，由 于具有高灵敏度、高特异性、可计量性、自动化程度高，被广泛运用在转基因食品、病原微生 物、疾控等检测领域。但是，其检测皆是以单一的目标为检测对象，经过复杂的加工程序， DNA会受到物理、化学或酶因子等因素的影响，导致不同程度的破坏。这给目前现行的单 一检测对象的方法带来很大的挑战和风险，且被引入的转基因成分来源具有很大的不确定 性，采用单一的检测方法--进行，势必操作复杂、费时费力且成本较大。总之，单一目标的 检测方法在肉制品等深加工产品转基因检测中，具有很大的漏洞和弊端，很难有效地对这 类产品进行监测。多重荧光定量PCR在此基础上应运而生，但是目前的技术还不完善，其运 用领域也有很多空白。多重荧光定量PCR是基于Taqman探针法荧光定量PCR的基础上，通 过使用多对引物和相应的标记有不同的荧光信号的探针，在同一个反应体系中对多个目标 序列进行同时检测，实现高通量、低成本的检测需求。因此，针对转基因技术常用的通用元 件和标记基因，开发多重荧光PCR检测技术，对多个目标片段进行检测是当务之急，以弥补 目前的许多运用领域的空白。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供一种新的肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量 PCR检测方法和检测试剂盒。
[0004] 本发明的目的是提供一种肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测 方法，包括DNA提取和PCR检测两个步骤，其特征在于：所述的DNA提取步骤为将肉制品样 品经剪碎或研磨均质后，按照组织基因组DNA提取方法进行DNA抽提；所述的PCR检测步骤 为将CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因 NPTII的特异性引物和探针、预混荧光定量 PCR反应体系、DNA模板和CldH2O按一定比例用量加入荧光定量PCR反应管，再将荧光定量 PCR反应管放入荧光定量PCR仪进行扩增，扩增结束后搜集荧光信号，同时进行平行试验。
[0005] 进一步的，所述的CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因 NPTII的特异性引物 和探针的喊基排列顺序为： CaMV 35S 反向引物：5' - CGACAGTGGTCCCAAAGA - 3' 正向引物：5' - AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC - 3' 探针：5，FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA3' ； NOS 反向引物：5' - TCT TAAGATTGAA TCCTGTT - 3' 正向引物：5' - ATTGCGGGACTCTAATCATA - 3' 探针：5，HEX-CAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGTCC -TAMRA3，； NPT II 反向引物：5' - AGGATCTCGTCGTGACCCAT - 3' 正向引物：5' - GCACGAGGAAGCGGT - 3' 探针：5, R0X-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA3'。
[0006] 进一步的，所述的PCR检测步骤中各组分的加入量如下表所示：
【权利要求】
1. 一种肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法，包括DNA提取和 PCR检测两个步骤，其特征在于：所述的DNA提取步骤为将肉制品样品经剪碎或研磨均质 后，按照组织基因组DNA提取方法进行DNA抽提；所述的PCR检测步骤为将所属CaMV 35S 启动子、NOS终止子和标记基因 NPTII的特异性引物和探针、预混荧光定量PCR反应体系、 DNA模板和CldH2O按一定比例用量加入荧光定量PCR反应管，再将荧光定量PCR反应管放入 荧光定量PCR仪进行扩增，扩增结束后搜集荧光信号，同时进行平行试验。
2. 根据权利要求1所述的肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法， 其特征在于：所述的所属CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因 NPTII的特异性引物和 探针的喊基排列顺序为： CaMV 35S 反向引物：5' - CGACAGTGGTCCCAAAGA - 3' 正向引物：5' - AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC - 3' 探针：5，FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA3' ； NOS 反向引物：5' - TCT TAAGATTGAA TCCTGTT - 3' 正向引物：5' - ATTGCGGGACTCTAATCATA - 3' 探针：5，HEX-CAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGTCC -TAMRA3，； NPT II 反向引物：5' - AGGATCTCGTCGTGACCCAT - 3' 正向引物：5' - GCACGAGGAAGCGGT - 3' 探针：5, R0X-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA3'。
3. 根据权利要求1所述的肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法， 其特征在于：所述的PCR检测步骤中各组分的加入量如下表所示：
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4. 根据权利要求1所述的肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法， 其特征在于：所述的DNA模板为标准品或提取的DNA ;所述DNA模板为标准品时作为阳性对 照管；所述DNA模板为提取的DNA时作为测试管。
5. 根据权利要求1所述的肉制品中植源性转基因成分的多重荧光定量PCR检测方法， 其特征在于：所述标准品序列应包含以下序列： CaMV 35S ：AAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCT CGTGGGTGGG GGTCCATCTTTGGGACCACTGTCG ； NOS:TCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATTAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCA TGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA TTAGAGTCCC GCAATTA ； NPT II ：GCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCA CGGGTAGCCAACGCTA TGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATA TTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTC ACGACGAGAT CCT〇
6. 根据权利要求1所述的肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法， 其特征在于：所述的荧光定量PCR仪设置的反应参数为95°C变性lmin30s，以95°C 5s， 58°C 30s，72°C 30 s扩增40个循环，设置58°C结束后开始收集荧光信号。
7. -种权利要求1所述的肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法 中使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括转基因调控元件、预混荧光定量PCR反应体 系、标准品和CldH2O ;所述的转基因调控元件包括所属CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记 基因 NPTII的特异性引物和探针；所述的标准品包括CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记 基因 NPTII的目标扩增片段。
8. 根据权利要求7所述的肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法 中使用的试剂盒，其特征在于：所述的所属CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因 NPTII 的特异性引物和探针为肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法中的所 属CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因 NPTII的特异性引物和探针。
9. 根据权利要求7所述的肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法中 使用的试剂盒，其特征在于：所述的CaMV 35S启动子、NOS终止子和标记基因 NPTII的目标 扩增片段为肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法中的CaMV 35S启动 子、NOS终止子和标记基因 NPTII的目标扩增片段。
【文档编号】C12Q1/68GK104388539SQ201410033119
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】邵彪, 黄伟东, 季葛振, 罗鑫 申请人:南通市产品质量监督检验所