一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记，所述SNP位点位于水稻基因组11号染色体第6525745位核苷酸，该位点核苷酸由C突变为T，氨基酸由半胱氨酸（Cys）突变为酪氨酸（Tyr），由引物对SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2从水稻基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经特异性酶切之后电泳检测，与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的分子标记。还公开了所述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的检测方法及其应用，本发明的Pia功能特异性分子标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现了目标基因Pia在水稻种质资源以及育种后代中的鉴定，特别是等位基因之间的鉴别，且不受环境以及人为因素的影响。
【专利说明】一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其方法与应用，属于分子生物学和水稻育种领域。
【背景技术】
[0002]稻痕病是水稻最严重的病害之一。由子囊菌Magnaportheoryzae引起的稻痕病是一种世界性的水稻流行性病害，全球每年因稻瘟病水稻产量损失约占总产量的10%-15%，稻瘟病还导致稻米品质下降，每年经济损失高达50亿美元。稻瘟病是我国三大水稻病害之一，每年都有不同程度的发生。近年，在西南、长江中游和东北等稻区严重发生，年发病面积330万-570万公顷，产量损失达数亿公斤，严重影响我国水稻生产和粮食安全。防治稻瘟病最有效、最经济、最根本的控制措施是发掘水稻自身的抗性基因资源，培育和利用持久、高抗品种资源。
[0003]全基因组关联分析(Genome-wideAssociationStudy, GffAS)是一种对全基因组范围内的常见遗传变异(单核苷酸多态性和拷贝数)总体关联分析的方法，它能够在全基因组范围内进行整体研究，能够一次性对疾病进行轮廓性概览，适用于复杂疾病的研究。在全基因组层面上，开展大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，可以全面揭示疾病发生、发展与治疗相关的遗传基础。与图位克隆法(map-basedcloning)相比,全基因组关联分析具有以下几个方面优点:1) GWAS研究不再需要在研究之前构建任何假设；2)可用自然群体，无需一定是遗传群体，大大缩短了研究年限；3)能够一次性通过监测成千上万个SNPsji全基因组范围内整体研究；4) GWAS研究的精度大大提高，例如由玉米的作图精度10-30cM(Salvi, 2005)提高到GWAS的精度1500bp (Remington，2001 )。随着基因组测序技术的提高及测序成本的降低，并结合生物信息学的高度发展，GffAS成为挖掘和剖析水稻抗稻瘟病基因及其相关遗传机制最有效的方法之一。
[0004]水稻稻瘟病抗性基因按抗性表现程度可以分为完全抗性和部分抗性两种类型。前者由1-3对主效显性基因控制，也有隐性基因、不完全显性基因、修饰基因和各种基因互作的控制方式；表现为病菌不能侵染或不能繁殖产生孢子，具有小种特异性，如已报道的P1-b (Wang 等，1999)、P1-ta (Bryan 等，2000)、Pi_9 (Qu 等，2006)。而后者一般由多个微效基因控制，具有一效多因特征；表现为病叶面积较小，病斑数目较少以及病斑大小较小，具有部分抗性的水稻在一定程度上能控制病原菌的无限繁殖，避免毁灭性病害发生，无小种特异性，具有持久抗性，如p1-21 (Fukuoka等，2001)。截至2013年8月，已至少报道68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，其中P1-a、Pbl、P1-56等24个基因已被成功克隆，主要集中分布在11号、12号及6号染色体上，而在3号染色体至今尚未报道存在与稻瘟病抗性相关位点(www.ricedata.cn/gene)。
【发明内容】
[0005]为解决上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记。
[0006]本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的检测方法。
[0007]本发明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的应用。
[0008]本发明目的是通过如下技术方案来实现的:[0009]一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记，所述SNP位点位于水稻基因组11号染色体第6525745位核苷酸(Chrll_6525745)，该位点核苷酸由C突变为T，氨基酸由半胱氨酸(Cys)突变为酪氨酸(Tyr)，由引物对SEQ ID N0.1和SEQIDN0.2从水稻基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经特异性酶切之后电泳检测，与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的分子标记。
[0010]所述引物对的核苷酸序列如下所示:
[0011]SEQ ID N0.1:5’ -GCTCCTTCTTCAATTACTGGGAATGGTCGA-3’ ；
[0012]SEQ ID N0.2:5’ -CTTGCAGTATCTCAAACTGG-3’。
[0013]所述的特异性酶切为SalI酶切。
[0014]所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaSNP的检测方法，通过805，158个高质量的SNP对IN366群体进行全基因组关联分析，获得能与稻瘟病抗性基因Pia紧密连锁的I处SNP位点(Chrll_6525745)，再通过引物设计分别得到SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，对水稻DNA扩增得到稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaSNP。
[0015]所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaSNP的方法，包含以下步骤:
[0016](I)通过常规PCR法扩增，获得稻瘟病抗性基因Pia的I个等位基因与I个感病等位基因序列；
[0017](2)利用多序列比对软件工具(如MegAlign)，将步骤(1)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到稻瘟病抗性基因Pia所特异的I处单碱基差异，该差异位于该基因的外显子，最终导致功能特异性氨基酸的改变；
[0018](3)根据步骤(2)所得到的I处SNP，设计出引物对SEQ ID N0.1和SEQIDN0.2 ;并用该引物对对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，所得扩增产物经特异性酶切之后电泳检测验证，获得与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的核苷酸片段；
[0019](4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同的水稻品种中进行验证，从而确定稻瘟病抗性基因Pia的功能特异性分子标记PiaSNP。步骤(3)中在上述SNP处设计带有错配碱基的功能特异性上游引物PiaSNP-F，如SEQ ID N0.1所示；在上述SNP下游100~200bp处设计功能特异性下游引物PiaSNP-RJn SEQ ID N0.2所示；
[0020]进一步的，所述PiaSNP的PCR扩增反应体系如下:
[0021]
【权利要求】
1.一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记，其特征在于:所述SNP位点位于水稻基因组11号染色体第6525745位核苷酸(Chrll_6525745)，该位点核苷酸由C突变为T，氨基酸由半胱氨酸(Cys)突变为酪氨酸(Tyr)，由引物对SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2从水稻基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经特异性酶切之后电泳检测，从而确定稻瘟病抗性基因Pia的功能特异性分子标记PiaSNP。
2.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下所示:
SEQ ID N0.1:5’ -GCTCCTTCTTCAATTACTGGGAATGGTCGA-3’ ；
SEQ ID N0.2:5’ -CTTGCAGTATCTCAAACTGG-3’。
3.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记，其特征在于:所述的特异性酶切为SalI酶切。
4.根据权利要求2或3任一项所述的稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记检测方法，其特征在于:使用805，158个高质量的SNP对IN366群体进行全基因组关联分析，获得能与稻瘟病抗性基因Pia紧密连锁的I处SNP位点(Chrll_6525745)，再通过引物设计分别得到SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，对水稻DNA扩增得到Pia功能特异性分子标记PiaSNP。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，具体包含以下步骤: (1)通过常规PCR法扩增，获得稻瘟病抗性基因Pia的I个等位基因与I个感病等位基因序列； (2)利用多序列比对软件工具，将步骤(1)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到稻瘟病抗性基因Pia所特异的I处单碱基差异，该差异位于该基因的外显子； (3)根据步骤(2)所得到的序列差异及dCAPS标记设计原理，设计出引物对SEQIDN0.1和SEQ ID N0.2 ;并用该引物对对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，所得扩增产物经特异性酶切之后电泳检测验证，获得与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的核苷酸片段； (4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同的水稻品种中进行验证，从而确定稻瘟病抗性基因Pia的功能特异性分子标记PiaSNP。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于:所述PiaSNP的PCR扩增反应体系如下:
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于:PCR结束后，利用限制性内切酶SalI对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下:
8.权利要求1所述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的应用，包括对水稻种质资源的筛选和鉴定，以及作为分子标记辅助育种方面的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103789306SQ201410033115
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】魏兴华, 王彩红, 徐群, 冯跃, 袁筱萍 申请人:中国水稻研究所