一种鉴定荔枝真杂种的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于荔枝遗传育种技术领域，具体涉及一种鉴定荔枝真杂种的分子标记及其应用。

背景技术：

荔枝(litchichinensissonn.)起源于中国，为典型的无患子科(sapindaceae)荔枝属(litchisonn.)亚热带常绿果树，因果实形、色、香、味俱佳和营养丰富而誉称“岭南果王”、“人间仙果”以及“佛果”等美誉驰名中外。我国是荔枝的最大生产国，主产区主要分布在广东、广西以及海南，福建、云南、四川、贵州等省份有少量种植，然而随着荔枝产业的快速发展，很多产业结构突出问题开始大量显现，其中一个主要问题是各主产区品种栽培结构不够合理：特早熟和特晚熟品种所占比例特小，而中熟品种所占比例得多，造成荔枝产期过于集中，在6、7月份大量上市，常造成广大果农丰产年而不丰收，严重影响了我国荔枝产业经济效益的提高，消减了果农栽培荔枝的积极性，出现荔枝果园无人管理现象，大片果园荒废令人惋惜。造成以上结果的一个主要原因是现有的荔枝品种已经很难满足荔枝生产发展的需求，缺乏品质优良的特早熟和特晚熟荔枝品种。因此，培育优质的荔枝新品种刻不容缓，特别是特早熟和特晚熟优良品种的选育，进而为荔枝不同品种栽培结构比例的优化提供品种支撑，以达到延长荔枝产期的目的。

杂交育种有利于综合双亲的优良性状，可以针对目标性状进行有目的的育种，在荔枝育种方法中，人工杂交育种是最要的方法之一。然而荔枝是长寿命木本果树，童期长，一般从实生种子播种到开花需要5年左右，造成荔枝杂交育种周期在10年以上，同时荔枝树体高大，占地面积多，管理上费工、费时，再加上荔枝基因组高度杂合、遗传背景不清、缺乏有效的杂种鉴别技术以及我国荔枝人工杂交育种起步晚，以上原因导致荔枝杂交育种的成效至今甚微。分子标记辅助育种是植物杂交育种中一个重要技术手段，可以在幼苗阶段对真杂种进行早期鉴定，能够显著缩短育种周期。因此，针对以上问题，借助分子标记辅助育种手段在荔枝杂交育种上尤为重要。

毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)是20世纪80年代问世的一种高效液相分离法，是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物，被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究课题。毛细管电泳技术因其分离效率高、分析速度快、样品用量少、易于自动化等特点而广泛应用于分子生物学、医学、药学、高分子等领域，尤其在生物分析及生命科学相关研究中显示广阔的应用前景。

发明人通过人工设施栽培在夏季对荔枝开展反季节低温诱导实验，有力证明了低温是诱导荔枝成花的关键环境因子，对荔枝的叶片和顶芽开展局部低温诱导实验，证明了荔枝的叶片是感受低温诱导信号的关键器官，为此申请工作人员对低温处理0h、8h、32h、9d、27d、47d和61d的叶片开展rna-seq和小rna高通量深度测序。其中通过rna-seq筛选到一个荔枝成花关键基因lcft1，进一步研究证明低温是通过诱导荔枝叶片中lcft1基因的表达进而导致其成花，并且lcft1基因启动子存在两个类型，早花荔枝属于一个类型，晚花荔枝属于另一个类型，这种启动子差异导致诱导早、晚花荔枝lcft1基因表达所需低温量不同，进而导致早花荔枝易成花并早于晚花荔枝(相关结果以promoterdifferenceoflcft1isaleadingcauseofnaturalvariationoffloweringtimingindifferentlitchicultivars(litchichinensissonn.)发表在plantscience,2015,241:128-137)。早花品种(如“三月红”、“褐毛荔”、“妃子笑”等)仅需要较短时间的低温就能够完成成花诱导(十月中下旬)，因而易成花，一般在2月左右开花；而晚花品种(如“马贵荔”、“桂味”、“糯米糍”等)必须经过整个冬天的低温才能完成成花诱导(一月上中旬)，因而难成花，一般在4月左右开花，两者相差两个多月。研究调查发现早花品种和晚花品种起源不同，早花品种起源于北方地区如云南等地，而晚花品种起源于南方地区如海南等地，由于开花时间的不同造成它们之间存在生殖上的隔离。一般而言荔枝花期早晚与熟期早晚是相关联的，即早花品种是早熟品种，晚花品种是晚熟品种，当然不同品种果实发育的快慢也与熟期有关。

技术实现要素：

本发明首次根据早花荔枝lcft1基因启动子属于一个类型，晚花荔枝lcft1基因启动子属于另一个类型，开发一种基于毛细管电泳技术的用于鉴定早、晚花荔枝杂交后代真杂种的分子标记。本发明提供的分子标记可显著缩短荔枝熟期杂交育种周期，节省人力、物力及土地。

本发明目的之一是提供一种鉴定早、晚花荔枝杂交后代真杂种的分子标记开发的原理。

本发明目的之二是提供上述分子标记的检测方法。

本发明目的之三是提供上述分子标记在早、晚花荔枝杂交育种中的用途。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴定荔枝真杂种的分子标记lccezw1，其由下列引物对经pcr扩增获得，所述引物对的上游引物为seqidno.1所示的序列，所述引物对的下游引物为seqidno.2所示的序列。

seqidno.1：5’-aacaaagtggttctagtttcaga-3’；

seqidno.2：5’-attaatggtaacaattccaagtg-3’。

本发明还提供了一种所述的鉴定荔枝真杂种的分子标记lccezw1的设计方法：根据早、晚花荔枝lcft1基因启动子的差异，早花荔枝lcft1基因启动子存在4处smallindels差异，在早、晚花荔枝lcft1基因启动子前两个smallindels差异序列两端相同的区域设计一对引物lccezw1。

本发明还提供一种对早、晚花荔枝杂交f1代进行真杂种检测的试剂盒，所述的pcr检测试剂盒反应体系共25μl，具体组成如下：dna模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×taqpcrmastermix(tiangen)12.5μl，ddh2o9.5μl。

作为优选，所述的上游引物为seqidno.1所示的序列，所述的下游引物为seqidno.2所示的序列。

本发明还提供了所述的分子标记lccezw1用于鉴定早、晚花荔枝杂交后代的方法，包括以下步骤：以早花荔枝dna为模板进行pcr扩增，通过毛细管电泳扩增的目的片段大小在444bp处左右出现峰值；以晚花荔枝dna为模板进行pcr扩增，通过毛细管电泳扩增的目的片段大小在432bp处左右出现峰值；以早、晚花荔枝杂交f1代dna为模板进行pcr扩增，通过毛细管电泳如果在444bp和432bp处左右都出现峰值则表明为真杂种，如果在444bp和432bp处左右只出现其中一个峰值则表明为假杂种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了一个基于毛细管电泳技术的分子标记lccezw1，用以鉴定早、晚花荔枝杂交后代的真假性。本发明提供的分子标记及其鉴定方法不仅分离效率高、分析速度快、样品用量少、易于自动化、鉴定结果精确等特点，同时不受环境影响，选择目标明确。对于木本果树的荔枝来说，可在幼苗阶段进行早期鉴定，在早、晚花荔枝间杂交育种上具有重要的意义，可显著缩短育种周期，大大节省人力、物力及土地，具有很高的社会经济价值和广泛的应用前景。

(2)本发明所提供的分子标记及鉴定方法能够在dna水平上对早、晚花荔枝杂交后代进行真假性鉴定，有助于建立早、晚花荔枝的分子标记辅助育种体系，便于快速、高通量的应用于早、晚花荔枝间杂交育种实践中。

附图说明

图1为早、晚花荔枝lcft1基因启动子序列比对图；

其中，‘z’为早花荔枝lcft1基因启动子序列；‘w’为晚花荔枝lcft1基因启动子序列；三角形为早花荔枝lcft1基因启动子4处smallindels差异：横线标注部分为分子标记上下游引物所在位置；方框为lcft1基因开放阅读框(orf)起始密码子atg。

图2为以早花荔枝dna为模板扩增的目的片段毛细管电泳图，在444bp处左右出现目的片段峰值(横坐标表示扩增片段大小，纵坐标表示信号强度)；

图3为以晚花荔枝dna为模板扩增的目的片段毛细管电泳图，在432bp处左右出现目的片段峰值(横坐标表示扩增片段大小，纵坐标表示信号强度)；

图4为以早、晚花荔枝杂交f1代真杂种dna为模板扩增的目的片段毛细管电泳图在444bp和432bp处左右都出现目的片段峰值(横坐标表示扩增片段大小，纵坐标表示信号强度)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：分子标记lccezw1鉴定“三月红”和“桂味”杂交f1代真杂种的方法(注：“三月红”为早花荔枝，作为母本；“桂味”为晚花荔枝，作为父本)。

(1)引物的设计原理

所述分子标记lccezw1开发的原理是根据早、晚花荔枝lcft1基因启动子的差异：早花荔枝lcft1基因启动子存在4处smallindels差异(图1)，在早、晚花荔枝lcft1基因启动子前两个smallindels差异序列两端相同的区域设计一对引物lccezw1(图1)。

所述分子标记lccezw1是由seqidno.1所示的核苷酸碱基序列和seqidno.2所示的核苷酸碱基序列组成。以“三月红”dna为模板扩增的目的片段大小为444bp，其具有如seqidno.3所示的序列；以“桂味”dna为模板扩增的目的片段大小为432bp，其具有如seqidno.4所示的序列，比早花荔枝少12bp。

所述分子标记lccezw1是由seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物扩增得到；

seqidno.1：5’-aacaaagtggttctagtttcaga-3’；

seqidno.2：5’-attaatggtaacaattccaagtg-3’。

(2)待检测荔枝基因组dna的提取

采集母本“三月红”和父本“桂味”以及它们杂交f1代幼苗植株健康的叶片，采用改良ctab法提取待检测荔枝叶片基因组dna，具体步骤如下：

(1)将叶片材料洗净放入液氮冷冻的研钵中，加少许不溶性的pvp，加液氮研磨成粉末；

(2)取0.5g粉末转移至10ml离心管中并加入3ml65℃水浴的ctab提取液，剧烈震荡，65℃水浴30-60min，每隔10min轻轻震荡一次；

(3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(v/v/v：25：24：1)轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min；

(4)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(v/v：24：1)轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min；

(5)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(v/v：24：1)，轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入2/3v预冷的异丙醇轻柔颠倒混匀，-20℃沉淀dna30min；

(6)12000rpm离心20min，弃上清，加70％乙醇洗涤沉淀2次；

(7)加100-300μlte缓冲液，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，紫外分光光度计检测其浓度与纯度，最终将dna稀释到50ng/μl，放入-20℃冰箱备用。

(3)pcr扩增筛选

分别以母本“三月红”和父本“桂味”以及它们杂交f1代植株的dna为模板进行pcr扩增，其标准pcr反应体系为25μl，具体组成如下：

dna模板1μl，seqidno.1上游引物1μl，seqidno.2下游引物1μl，2×taqpcrmastermix(tiangen)12.5μl，ddh2o9.5μl。

pcr具体扩增程序如下：

94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35循环，72℃延伸10min，10℃停止。

(4)毛细管电泳检测扩增dna片段

从荧光选择扩增的pcr产物中取1μl加入到96孔板的各孔中，再分别加入9μl去离子甲酰胺，1μlgs3730-500分子量内标，95℃预变性5min，4℃保温10min后3000rpm离心1min，然后通过abi3730xldna分析仪进行毛细管电泳30min，电压2kv，进样时间5s，荧光6-fam，用abidatacollection2.1软件收集原始数据，再用genemarkerv1.91demo软件对收集的原始数据进行分析，系统将各峰值的位置与其泳道中gs3730-500分子量内标做比较确定片段大小，生成图像。

(5)“三月红”和“桂味”杂交f1代植株真杂种鉴定

分子标记lccezw1用于鉴定母本“三月红”和父本“桂味”以及它们杂交f1代植株，如图2所示一样，以母本“三月红”dna为模板，扩增的目的片段通过毛细管电泳在444bp左右处出现峰值；如图3所示一样，以父本“桂味”dna为模板，扩增的目的片段通过毛细管电泳在432bp处左右出现峰值；如图4所示一样，以“三月红”和“桂味”杂交f1代植株dna为模板，扩增的目的片段通过毛细管电泳在444bp和432bp处左右都出现峰值，表明为真杂种，否则为假杂种。

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<110>广西壮族自治区农业科学院园艺研究所

<120>一种鉴定荔枝真杂种的分子标记及其应用

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