辣椒分子标记及其多态性在鉴定辣椒花粉育性中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，辣椒分子标记及其多态性在鉴定辣椒花粉育性中的应用。

背景技术：

辣椒(capsicumannuuml.)属于常异花授粉植物，具有明显的杂种优势。杂交辣椒品种已大量应用于生产。利用辣椒雄性不育性培育一代杂种，可以降低生产成本，显著提高一代杂种的种子纯度。根据调控机理的不同，辣椒雄性不育主要分为细胞核雄性不育型(genicmalesterility,gms)、细胞质雄性不育型(cytoplasmicmalesterility,cms)，其中细胞核雄性不育仅由核基因控制，而细胞质雄性不育是由细胞核基因与细胞质基因共同调控，相比于gms，cms可获得100％的不育株，可以通过三系配套实现杂种优势育种，拥有广泛的应用前景。辣椒雄性不育的利用是迄今为止降低辣椒制种成本的最有效途径之一。

辣椒cms是由线粒体中的不育基因导致的不能产生正常功能花粉的现象，这种现象可以被细胞核中的恢复基因(restorer-of-fertility,rf)抑制或消除。利用辣椒细胞质雄性不育实现三系配套育种的关键之一就是找到具有恢复基因rf的恢复系材料。为此，国内外学者在rf基因的定位及连锁标记开发方面做了大量研究。在rf基因的定位方面，目前普遍将其作为单基因控制的质量性状来研究，目前已普遍认为，rf基因位于辣椒的第6号染色体上。在连锁标记开发方面，国内外学者开发了许多与rf基因连锁的分子标记，但在紧密连锁程度及适用性上还有待提高。

分子标记辅助育种作为当前育种工作的重要辅助手段，其关键就是开发出高效的分子标记。与目标性状紧密连锁并且稳定、检测方便快捷的分子标记直接对基因型进行选择,极大的提高育种中选择的准确性和效率，显著缩短育种周期。因此，开发高效的分子标记对于品种改良及新品种选育具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定辣椒花粉育性。

本发明首先提供了辣椒分子标记或其多态性在鉴定或辅助鉴定辣椒花粉育性中的应用；

所述辣椒分子标记为以辣椒基因组dna为模板，采用引物对pw6-126进行pcr扩增得到的dna分子；

所述引物对pw6-126由名称分别为pw6-126f和pw6-126r的单链dna组成，所述pw6-126f为辣椒基因组dna中与序列表中序列3的第85位的上游特异结合的单链dna，所述pw6-126r为辣椒基因组dna中与序列表中序列3的第108位的下游特异结合的单链dna。

所述pw6-126f具体可为序列表中序列1所示的单链dna，所述pw6-126r具体可为序列表中序列2所示的单链dna。

本发明还提供了鉴定辣椒基因型的方法，所述基因型为rfrf基因型、rfrf基因型和rfrf基因型；所述方法为下述o或p：

o、包括：检测待测辣椒基因组中对应于序列表中序列3的第85-108位的序列，如所述待测辣椒基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒；如所述待测辣椒基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒；如所述待测辣椒基因组中两条染色体一条为下述g1)的染色体、另一条为下述g2)的染色体，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒；

g1)对应于序列3的第85-108位为序列3的第85-108位；

g2)对应于序列3的第85-108位为序列4的第85-114位；

p、包括如下p1)和p2)：

p1)以待测辣椒基因组dna为模板，利用所述引物对pw6-126进行pcr扩增得到pcr产物；

p2)p2a)或p2b)：

p2a)检测步骤p1)得到的pcr产物的序列，如果所述pcr产物的序列为序列4，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒；如果所述pcr产物的序列为序列3和序列4，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒；如果所述pcr产物的序列为序列3，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒；

p2b)检测步骤p1)得到的pcr产物的大小，如果所述pcr产物含有153bp的dna片段且不含有147bp的dna片段，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒；如果所述pcr产物含有153bp和147bp的dna片段，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒；如果所述pcr产物含有147bp的dna片段且不含有153bp的dna片段，所述待测辣椒为rfrf基因型辣椒。

上述方法中，利用所述引物对pw6-126进行pcr扩增的反应体系中所述pw6-126f和所述pw6-126r的浓度均可为0.1μm。所述反应体系具体可含有待测辣椒基因组dna、含有datp、dttp、dctp和dgtp的dntps混合物、pcr反应缓冲液、dna聚合酶、所述pw6-126f、所述pw6-126r和水。所述dna聚合酶和所述pcr反应缓冲液(10×buffer缓冲液)均可为宝生物工程(大连)有限公司产品。

所述pcr扩增的退火温度可为52℃。所述pcr扩增的反应条件具体可为94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min。

本发明还提供了鉴定辣椒花粉育性的方法，所述方法包括包括下述m1或m2：

m1、利用所述鉴定辣椒基因型的方法鉴定待测辣椒的基因型，rfrf基因型待测辣椒的花粉可育或候选可育，rfrf基因型待测辣椒的花粉可育或候选可育，rfrf基因型待测辣椒的花粉不育或候选不育；

m2、利用所述鉴定辣椒基因型的方法鉴定待测辣椒的基因型，rfrf基因型待测辣椒可育花粉比例大于或候选大于rfrf基因型待测辣椒；rfrf基因型待测辣椒可育花粉比例大于或候选大于rfrf基因型待测辣椒。

本发明还提供了所述辣椒分子标记。

本发明还提供了所述引物对pw6-126。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定花粉育性的系统，所述系统含有所述引物对pw6-126。

所述系统可仅由所述引物对pw6-126组成，也可由所述引物对pw6-126与进行pcr扩增所需的试剂和/或仪器组成。

上述系统中，所述进行pcr扩增所需的试剂可为含有datp、dttp、dctp和dgtp的dntps混合物、dna聚合酶和/或pcr反应缓冲液；所述进行pcr扩增所需的仪器可为pcr仪。所述dna聚合酶和所述pcr反应缓冲液(10×buffer缓冲液)均可为宝生物工程(大连)有限公司产品。

上述系统中的各试剂均可独立包装。

上述系统也可为仅含有试剂的试剂盒。

本发明还提供了所述引物对pw6-126的下述任一应用：

x1、在鉴定或辅助鉴定辣椒花粉育性中的应用；

x2、在制备鉴定或辅助鉴定辣椒花粉育性产品中的应用。

本发明还提供了所述鉴定辣椒基因型的方法在鉴定或辅助鉴定辣椒花粉育性中的应用。

本发明还提供了辣椒育种方法，所述方法包括：按照所述鉴定辣椒基因型的方法检测辣椒的基因型，选择rfrf或rfrf基因型的辣椒作为亲本进行育种。

本发明中，所述引物对pw6-126中的两条单链dna的摩尔比可为1:1。

本发明中，在检测pcr产物的大小时，可通过电泳与dna分子量标准进行检测，也可通过测序进行检测。

实验证明，本发明中的辣椒分子标记与辣椒花粉育性相关：含有序列3不含有序列4的dna片段的rfrf基因型辣椒花粉可育，含有序列3和序列4的dna片段的rfrf基因型辣椒花粉可育，含有序列4不含有序列3的dna片段的rfrf基因型辣椒花粉不育。利用本发明的辣椒分子标记检测花粉育新的准确性可达91.11％，表明，本发明的辣椒分子标记适用性较强，在育种实际应用中可以利用该标记对辣椒花粉育性进行快速鉴定。

附图说明

图1为上海圆b/426、上海圆c/427和f1的pcr产物的电泳结果。其中，a为上海圆b/426，c为上海圆c/427。

图2为45份辣椒的pcr产物的电泳结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的甜椒细胞质雄性不育系上海圆b/426和恢复系上海圆c/427(米志波等，辣椒恢复基因连锁标记的适用性评价与应用，中国蔬菜，2015(2)：25-29)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、利用辣椒分子标记鉴定辣椒花粉育性

1、辣椒分子标记

本实施例提供的辣椒分子标记为以辣椒的基因组dna为模板、采用引物对pw6-126进行扩增得到的dna分子。本发明的申请人发现该辣椒分子标记有两种序列：序列3和序列4。

其中，pw6-126由名称为pw6-126f和pw6-126r的单链dna组成，brch_f为序列表中序列1所示的单链dna，pw6-126r为序列表中序列2所示的单链dna。

将引物对pw6-126的pcr产物含有序列4所示的dna片段且不含有序列3所示的dna片段的辣椒的基因型记为rfrf基因型，将pcr产物含有序列3所示的dna片段且不含有序列4所示的dna片段的辣椒的基因型记为rfrf基因型，将pcr产物含有序列3和序列4所示的dna片段的辣椒的基因型记为rfrf基因型。

2、辣椒分子标记与辣椒花粉育性

利用甜椒细胞质雄性不育系上海圆b/426及其恢复系上海圆c/427为试验材料，进行杂交，得到f1，f1自交构建f2群体。其中上海圆b/426与上海圆c/427为近等基因系。获得包含500个单株的f2群体，鉴定各个f2单株以及亲本上海圆b/426、上海圆c/427和f1的基因型，并单株统计花粉育性。基因型鉴定方法如下：

提取各单株的基因组dna，利用引物对pw6-126进行pcr扩增。

pcr扩增反应体系(20μl)为：基因组dna2μl、10×buffer缓冲液2μl、dntps0.8μl、dna聚合酶0.4μl、pw6-126f和pw6-126r(10μm各0.2μl，用14.4μlddh2o将总体积补齐至20μl。其中，10×buffer缓冲液和dna聚合酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品。

pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min。

pcr扩增产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。并对pcr扩增产物进行测序。部分植株电泳结果如图1所示。结果显示，所有植株的pcr产物在140-160bp间共有三种类型，第一种类型为含有序列4所示的dna片段且不含有序列3所示的dna片段(即含有153bp的dna片段不含有147bp的dna片段)，第二种类型为含有序列3和序列4的所示的dna片段(即含有153bp和147bp的dna片段)，第三种类型为含有序列3所示的dna片段且不含有序列4所示的dna片段(即含有147bp的dna片段不含有153bp的dna片段)。pcr产物为第一种类型的植株即为步骤1的rfrf基因型植株，pcr产物为第二种类型的植株即为步骤1的rfrf基因型植株，pcr产物为第三种类型的植株即为步骤1的rfrf基因型植株。

花粉育性统计方法如下：

在盛花期对每个单株的育性进行调查，为避免对表型的错判，每株均进行3次以上的育性调查(可育植株花未开裂的雄蕊十分饱满，盛开后花药开裂充分；而不育植株花的雄蕊干瘪，盛开后也没有花粉或花粉量极少)，同时结合植株的坐果情况进一步佐证其育性(不育植株表现为不结实或单性结实，与可育植株的果实相比，单性结实的果实显著小于正常果实，并存在畸形，而且内无种子)。

结果显示，上海圆b/426花粉不育，其基因型为rfrf基因型；上海圆c/427花粉可育，其基因型为rfrf基因型；子代(即f1代)花粉可育，基因型为rfrf基因型；f2群体中rfrf基因型植株花粉均可育，rfrf基因型植株花粉也均可育，rfrf基因型植株花粉均不育。表明，本实施例的辣椒分子标记与辣椒的花粉育性相关。

实施例2、利用实施例1的辣椒分子标记鉴定辣椒花粉育性

1、试验材料

45份辣椒自交系和品种(表1)。

2、试验方法

采用实施例1中的花粉育性统计方法统计45份辣椒自交系和品种的花粉育性，其结果见表1。

利用实施例1的辣椒分子标记鉴定各辣椒自交系和品种的花粉育性：

提取各辣椒自交系和品种的基因组dna，利用引物对pw6-126进行pcr扩增，pcr扩增反应体系和pcr扩增反应程序同实施例1，pcr扩增产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(图2)，硝酸银染色后观察照相。图2中，泳道1-45分别为表1的编号为1-45的辣椒。根据pcr产物的大小确定各辣椒自交系和品种的基因型：含有153bp的dna片段不含有147bp的dna片段的植株的基因型为rfrf基因型，含有153bp和147bp的dna片段的dna片段的植株的基因型为rfrf基因型，含有147bp的dna片段不含有153bp的dna片段的dna片段的dna片段的植株的基因型为rfrf基因型。根据实施例1中基因型与辣椒育新的对应关系确定各辣椒的花粉育性，结果如表1所示。

表1、45份辣椒花粉育性的鉴定

结果显示，利用本发明的辣椒分子标记鉴定45份辣椒自交系和品种的花粉育性中，有4份辣椒的花粉与其实际育性不一致，正确率为91.11％，表明，实施例1的辣椒分子标记适用性较强，在育种实际应用中可以利用该标记对辣椒花粉育性进行快速鉴定。

<110>中国农业大学

<120>辣椒分子标记及其多态性在鉴定辣椒花粉育性中的应用

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