专利名称：蛋白质多态性与冠心病的关联的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定提高的冠心病风险的方法以及适用于所述方法的探针、引物、多肽或多核苷酸。
背景技术：
在西方世界，心血管疾病是两种性别的首要死亡原因，而冠心病(特别是冠状动脉疾病)是心血管疾病的主要原因。绞痛(又称为心绞痛)是心肌没有接收到足够氧时发生的暂时性胸痛或压力感。当动脉变窄或被阻塞使得流向肌肉的血不能提高以满足更多氧需求的时候，可发生局部缺血，引起疼痛(即绞痛)。
心绞痛通常由冠状动脉疾病引起，但其也可由其他冠心病引起。并非每个局部缺血患者都经历心绞痛。无绞痛的局部缺血称为无症状心肌缺血。无症状心肌缺血的危险在于心脏组织经受损伤时患者不会注意。因此，对心脏的可能损伤通常直到最终引起心肌梗塞时才被患者或医师识别。因此，非常需要用于识别血管和(特别是)冠状动脉退化(下文中称为冠心病)的诊断原则使(人们)能够进行早期诊断并从而采取早期治疗措施或预防措施。
发明内容
因此，本发明的目的为提供用于诊断和治疗冠心病的改进的方法。
这通过鉴定个体中提高的冠心病风险的方法完成，其中在样品中确定Kir6.2蛋白质位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非缬氨酸的其他氨基酸的存在。
在下文中，核苷酸和氨基酸的标准缩写(例如氨基酸的三字母或单字母密码)等同于全长术语使用。
Kir6.2蛋白质序列中多态性的鉴定可用于预测提高的或正常的冠心病(优选冠状动脉疾病和/或心绞痛)风险，所述多态性包含Kir6.2蛋白质中位置23上的氨基酸改变(特别是从谷氨酸到赖氨酸)和/或位置337上的氨基酸改变(特别是从缬氨酸到异亮氨酸)。其可用于例如1)基于测序目的蛋白质区域的方法(例如标准蛋白质降解、质谱法分析蛋白质序列片段)；2)基于使用针对目的区域的抗Kir6.2抗体的方法(例如ELISA)；3)基于使用例如人、动物、细菌或酵母细胞在体外测定中分析Kir6.2功能活性的方法。
本发明还涉及鉴定个体中提高的冠心病风险的方法，其中在样品中确定Kir6.2基因的一个或两个(优选两个)等位基因核苷酸序列上存在变异化，所述变异在Kir6.2蛋白质中产生含有23位非谷氨酸的其他氨基酸和/或337位非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列。
Kir6.2基因一个或两个等位基因核苷酸序列上多态性的鉴定可用于预测正常个体中(优选糖尿病患者中)提高的冠心病(优选冠状动脉疾病，更优选心绞痛)风险，所述多态性引起Kir6.2蛋白质中位置23上的氨基酸改变(特别是从谷氨酸到赖氨酸)和/或位置337上的氨基酸改变(特别是从缬氨酸到异亮氨酸)。其可用于例如1)基于测序目的核苷酸区域的方法(例如焦磷酸测序、使用放射性标记核苷酸或用荧光染料标记的核苷酸的测序方法、用质谱法分析序列片段)；2)基于核苷酸序列与目的区域杂交的方法(例如DNA微阵列)；3)基于分析目的核苷酸区域扩增产物的方法(例如TaqManTM分析)。
K+内向整流通道Kir6.2(KCNJ11或Bir)是胰岛ATP敏感钾通道(IKATP)的一个亚单位。Kir6.2基因已被绘制于染色体11p15.1，而Kir6.2蛋白质由390个氨基酸组成。由于其在葡萄糖刺激的胰岛素分泌中的关键作用，Kir6.2被假定为涉及II型糖尿病发作的遗传缺陷的候选基因(Yamada等(2001)Diabetes Metab Res Rev 17213-216)。
Kir6.2的若干蛋白质、基因组多核苷酸序列和编码多核苷酸序列为本领域知识水平公知。例如，若干个人蛋白质/基因组DNA/编码序列可从NCBI(国家生物技术信息中心；国家医学图书馆，38A楼，Bethesda，MD20894，USA；www.ncbi.nhm.nih.gov)数据库以登录号XP006398(Seq.IDNo.3)、(Seq.ID No.5)(蛋白质序列)XM006398(Seq.ID No.4)、(Seq.ID No.6)(编码序列)公开获得。一个基因组Kir6.2序列可从以NCBI登录号NT 009307(人类染色体11基因组连续序列；大小8665930 bp)公布的基因组连续序列公开获得。mRNA/编码/基因组Kir6.2序列的比对可使用下列因特网链接公开获得http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？SendTo＝on&db＝nucleotide&dispmax＝1&extrafeat＝-1&list_uids＝NT_009307.12&showndispmax＝1&view＝graph&_from＝5656500&_to＝565 9500&_sfrom＝5657000&_font＝default&_llen＝60&_slen＝4000。
如可从这样的比对获得的那样，从位置5656500到5659500的序列串(SEQ ID No.13)包含基因组Kir6.2基因座。如图2和图3所示，不同的Kir6.2序列在蛋白质序列位置23和/或337以及编码序列的相应位置上(分别为67/68/69和1009/1010/1011)不同。由于编码序列由基因组DNA的转录产物产生，就位置5657106/107/108和5657478/79/80而言的基因组序列的若干个不同变体也一定存在。
术语Kir6.2是指Kir6.2蛋白质和核酸。术语蛋白质包含多肽和由多于一条多态性链组成的蛋白质，例如通过已知键(例如S-S桥)相互连接形成一个蛋白质单元的多肽。术语Kir6.2蛋白质可指任何Kir6.2蛋白质或多肽或其功能性片段。Kir6.2片段可以是例如比Kir6.2蛋白质或具有根据SEQID 1到8或13之一序列的核酸短的任何Kir6.2蛋白质或核酸。Kir6.2片段优选为Kir6.2的功能性片段。Kir6.2蛋白质的功能性片段为具有至少一种Kir6.2功能(见例如上文)的蛋白质片段。Kir6.2功能性核酸是例如编码Kir6.2蛋白质或其功能性片段的Kir6.2核酸片段，或其能够与Kir6.2核酸特异性杂交。
术语蛋白质序列、氨基酸序列和多肽序列在本申请上下文中同义使用。
令人惊奇的是，发明者的研究揭示Kir6.2多肽位置23的最常见变体为Glu(谷氨酸，E)。另外，他们揭示位置337的最常见变体为Val(缬氨酸，V)。因此，在本申请范围内将各个位置上的这些氨基酸视为Kir6.2“野生型”。因此，如果在本申请上下文中涉及氨基酸序列中的改变或突变或较不常见变体，是指从该“野生型”位置23和/或337的野生型氨基酸衍生。
根据SEQ ID No.1(NCBI登录号D50582；见图1A)和2(NCBI登录号D50582；见图1B)的序列代表多肽序列位置23和337(分别为编码序列的位置67/68/69或位置1009/1010/1011和基因组序列的位置5657106/07/08和5657478/79/80)的Kir6.2野生型。序列SEQ ID No.3(NCBI登录号XP006398；图2A)、SEQ ID No.4(NCBI登录号XM006398，图2B)来自NCBI数据库，另一方面，新序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6在多肽序列的位置23或位置337各含有一个较不常见的氨基酸(以及核苷酸序列分别在位置67或位置1009的序列变异)。新序列SEQ ID No.7(图4A)和8(图4B)在氨基酸链的位置23和337均含有较不常见的变体氨基酸序列位置23的赖氨酸(编码序列位置67/68/69为AAG)和位置337的异亮氨酸(编码序列位置1009/1010/1011为ATC)。
单核苷酸多态性性(SNP)代表在单一核苷酸位置含有改变的给定核苷酸序列的变体；SNP为本领域公知的。
一些单核苷酸多态性(SNP)已在Kir6.2基因中得到鉴定，其导致翻译蛋白质中氨基酸发生改变，例如E23K(蛋白质位置23从谷氨酸交换为赖氨酸)、L270V(位置270从亮氨酸改变为缬氨酸)和V377I。
在最近的研究中，Kir6.2变体E23K与高加索人种群中II型糖尿病连锁(Hani等(1998)Diabetologia 411511-1515)。
然而，到目前为止，没有获得关于Kir6.2变体在患有心血管病症的人中临床效应的数据。令人惊奇的是，发明者的研究第一次鉴定了Kir6.2蛋白质氨基酸序列中位置23和/或337上突变的存在与冠心病素因的密切关系。
通过分析人DNA或Kir6.2蛋白质检测Kir6.2基因中遗传多态性[特别是Kir6.2-23-KK(在Kir6.2基因两个等位基因上相应位置作为多态性结果在蛋白质位置23具有赖氨酸(K)的Kir6.2变体)和Kir6.2-337-II(在Kir6.2基因两个等位基因上相应位置作为多态性结果在蛋白质位置337具有异亮氨酸(I)的Kir6.2变体)]可用作例如(a)预防治疗(特别是糖尿病患者中)冠心病(特别是冠状动脉疾病并且尤其是心绞痛)的遗传标记；(b)用于适应药物剂量的遗传标记；(c)用于药物筛选建立适应的遗传标记和(d)在阶段/临床研究中用于患者选择的遗传标记。
通过能够进行冠心病素因的早期鉴定，本发明的方法能够在诸如绞痛症状或对心脏组织损伤发生之前对患者进行早期预防或治疗对一个或两个上述氨基酸改变或它们在mRNA或基因组水平上的潜在核苷酸的鉴定给予治疗医师明确的指示，以筛选对冠心组织或血管已经持续的损伤或甚至在损伤和/或疼痛发生前开出预防性药物处方。
另外，所述氨基酸改变和冠心病发病之间令人惊奇的关联通过与未显示所述Kir6.2氨基酸改变的冠心病患者相比暗示需要更高剂量的某些药物或指出某些/不同类型药物疗法的必要性，能够更为有效地治疗冠心病。因此，本发明的另一实施方案涉及调适用于治疗和/或预防冠心病的药物剂量的方法，其中确定个体样品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白质位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因一个或两个等位基因上核苷酸序列的变异，其产生Kir6.2蛋白质位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
本发明的另一实施方案还涉及选择应答冠心病药物个体的方法，其中确定个体样品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a) Kir6.2蛋白质位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因一个或两个等位基因上核苷酸序列的变异，其产生Kir6.2蛋白质位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
选择个体优选地涉及糖尿病患者药物优选用于预防或治疗冠状动脉疾病，且最优选用于心绞痛的药物。优选的，位置23的氨基酸改变为从谷氨酸到赖氨酸和/或位置337的氨基酸改变为从缬氨酸到异亮氨酸。样品优选为分离的蛋白质或核酸、生物样品(如组织学样品)、细胞提取物或组织提取物或细胞。
用于治疗或预防冠心病或心绞痛的大范围药物为本领域技术水平公知。
由于本研究第一次鉴定了Kir6.2涉及冠心病潜在的或相关的过程，本发明另一方面涉及使用Kir6.2用于鉴定适用于治疗和/或预防冠心病的药物。
术语“药物”是指能够用于治疗或预防个体疾病状态的任何物质或物质的组合。物质可以是任何生物的或化学的物质或天然产物的提取物，其可以是纯化的、部分纯化的、合成的或通过生物化学或分子生物学方法制备的。
被认为在预防或治疗本发明不同方面含义的冠心病中有用或有活性的药物可以是任何物质或物质的组合，所述物质或物质的组合对Kir6.2的功能之一或细胞中Kir6.2(蛋白质或核酸)的量或Kir6.2的表达有影响。
为此，物质可以调节Kir6.2的任何功能(例如上述功能)。物质可例如通过直接相互作用和干扰Kir6.2多肽/蛋白质或其片段调节Kir6.2蛋白活性。物质还可在例如转录(起始、延伸、加工等)、转录物稳定性、翻译水平调节Kir6.2表达。此外。其可以调节Kir6.2的翻译后修饰、蛋白质折叠等。物质可直接或间接(间接是指通过(正或负)干预影响Kir6.2功能/蛋白质活性/表达等的天然信号传导级联)行使上述效应。
本发明的另一实施方案涉及筛选适用于治疗和/或预防冠心病的药物的方法，包括步骤为a.提供含有Kir6.2的两个样品；b.将一个样品与潜在的药物接触；c.测定存在或不存在潜在药物时的Kir6.2活性或Kir6.2结构；d.比较存在和不存在潜在药物时的Kir6.2活性。
还可以将存在可能药物物质时的活性或结构(即Kir6.2蛋白质的折叠)与野生型Kir6.2蛋白质的活性或结构相比较。
优选的，样品含有或为分离的Kir6.2蛋白质或蛋白质片段或分离的Kir6.2核酸或核酸片段。
在本发明上下文中，关于“分离的蛋白质”、“分离的核酸”等的术语“分离的”是指从天然来源纯化的蛋白质/核酸以及重组的蛋白质/核酸(当然其也可是纯化的)。
由于鉴定与冠心病相关联的Kir6.2中氨基酸改变非常可能影响冠心病治疗和/或预防，用于上述用途或方法之一的Kir6.2可以是例如a)Kir6.2蛋白质或其片段，其在Kir6.2蛋白质中含有位置23上的非谷氨酸氨基酸和/或位置337上的非缬氨酸氨基酸；b)Kir6.2核酸或其片段，其在Kir6.2基因的一个或两个等位基因核苷酸序列中含有变异，所述变异产生Kir6.2蛋白质中位置23上的非谷氨酸氨基酸和/或位置337上的非缬氨酸氨基酸；或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
可通过筛选潜在药物能够修复Kir6.2的蛋白质功能和/或折叠的能力鉴定用于治疗和/或预防冠心病的药物活性物质，所述Kir6.2相对于野生型蛋白质含有一个或两个所述氨基酸改变。
药物筛选方法和体系，尤其是使用分离的蛋白质或蛋白质片段、表达所述蛋白质的细胞等以高通量形式使用的药物筛选方法和体系为本领域技术水平公知的。
合适的分析方法或分析体系、用于测量确定的靶分子活性或浓度的所谓测定法、在本发明上下文中作为潜在药物化合物效应参数的Kir6.2(所谓的靶标，主要是蛋白质或核酸)的活性或折叠为本领域技术水平公知。测定可以是例如使用分离的或部分分离的组分的生物化学分析方法或系统，其中可检测潜在药物化合物的效应，所述组分在确定的空间和时间中汇总为反应混合物。测定的另一实例包括生物化学分析方法或系统，其中靶分子的活性和可能影响该活性的效应可在细胞内确定。
测定为监测生物学过程的任何类型的分析方法或系统。代表生理学代谢途径和病理学条件的分子级联和机制在细胞或生物化学(体外)系统中被适当地复制。因此可根据潜在药物化合物干预或调节这些级联或机制的能力确定其药物学活性。
为了用于药物筛选(特别是新药物化合物的高通量筛选)，测定需要是可重复的并优选还是可规模化和稳定的。测定优选适用于高通量筛选能够调节所研究靶分子活性的化学物质。测定的类型取决于使用的靶分子(例如多肽或多核苷酸)类型和“读出”(即参数)，根据所述参数确定靶分子活性(见下文)。
不同类型的这类测定通常为本领域技术水平公知并可从供应商处购得。
用于不同目的的合适测定法包括放射性同位素或荧光测定法，例如用于测量标记成员与未标记成员间相互作用(例如标记的蛋白质受体与它们的未标记配体间的相互作用)的荧光偏振测定法(例如由Panvera商业提供的那些)或Packard BioScience(HTRF；ALPHAScreenTM)更多的实例包括基于细胞的测定法，其中细胞系稳定(可诱导的或非可诱导的；染色体或附加体的)或瞬时表达目的重组蛋白质。这些测定法包括例如报告基因测定法，其中根据报道酶的活性测量某启动子或信号转导级联成员的信号转导途径的调节，所述酶的表达处于所述某启动子的控制下。对于该类型的测定法，必须构建含有处于确定启动子控制下的报道基因的重组细胞系，所述启动子自身被研究或其被研究的信号级联所调节。合适的报道酶通常为本领域技术水平公知并包括萤火虫荧光素酶、海肾(renilla)荧光素酶(例如可从Packard reagents商购的)、β-半乳糖苷酶。合适的细胞系依赖于测定的目的，但包括大多数容易转染并容易培养的细胞系，例如HeLA、COS、CHO、NIH-3T3等。
测量细胞内离子水平的测定法包括例如FLIPR(荧光成像板读数器，可从Molecular Devices商购)测定法，其中氩激光器光源与冷CCD照相机组合使得能够平行测量384孔板中细胞(例如神经元细胞或其他细胞(例如重组或天然表达某些离子通道的细胞))内的瞬间离子信号(例如Ca2+等)。FLIPR测定法使得能够使用某些荧光染料(例如Fluo-3、Fluo-4)监测细胞内钙，或使用BCECF或BCPCF或特定FLIPR测定试剂盒监测细胞内pH，或使用例如DiBAC或特定FLIPR测定试剂盒检测膜电位改变，或监测膜极性化。可使用本领域技术水平公知的其他染料监测其他细胞内离子，如锌或钠。其他类型的测定法和其他类型的读出器通常为本领域技术人员公知。
为了确定离子通道活性如Kir6.2(其控制细胞内的离子浓度并因此可以用于测量细胞内的离子浓度)活性，可使用如膜电位敏感测定法和染料，例如DiBAC或基于FLIPR技术的Molecular Devices的膜电位测定试剂盒；使用FLIPR技术测量线粒体膜极化的JC-1染料；离子敏感染料等。基于膜片钳的测定法或基于原子吸收光谱的铷离子流出测量特别适用于确定细胞内钾浓度等。其他的自动设备和用于探测细胞内某些变化和状态的设备为本领域技术人员公知并包括例如ACUMEN bioscience的Acumen检测器(允许三维重建适当标记物质分布的基于荧光的激光扫描读数器)。其他类型的测定法和其他类型的“读出器”为本领域技术水平公知。
就上述筛选方法或用途而言，优选Kir6.2蛋白质包含或具有根据SEQID No.3、5或7的序列。还优选根据上述方法或用途的蛋白质片段包含或具有根据SEQ ID No.3、5或7的序列。根据上述筛选方法的核酸优选包含或具有根据SEQ ID No.4、6或8的序列。根据所述筛选方法的核酸片段优选包含或具有根据SEQ ID No.4、6或8的序列。
非常可能Kir6.2位置23上野生型变体谷氨酸和/或位置337上野生型变体缬氨酸的所有的氨基酸改变影响冠心病的素因。因此，野生型的氨基酸改变基本上可以是任何类型。优选位置23和/或337的氨基酸改变涉及分别具有与野生型氨基酸Glu23和Val337性质不同的氨基酸掺入。因此，优选将非极性或碱性氨基酸置于位置23代替酸性谷氨酸。甚至更优选碱性氨基酸，特别是赖氨酸(Lys，K)。至于在野生型多肽中带有非极性氨基酸缬氨酸(Val，V)的位置337，优选将带有比缬氨酸侧链更大侧链的非极性氨基酸、碱性或酸性氨基酸置于位置337。在本发明的范围内，更优选将带有比缬氨酸侧链更大侧链的非极性氨基酸置于位置337。上述方法的最优选的实施方案包括Kir6.2的位置23带有赖氨酸和/或Kir6.2的位置337带有异亮氨酸的变体。
由于遗传密码的不稳定，存在若干种可能的引起上述氨基酸改变的核苷酸改变。遗传密码是公知的(作为参考，还参阅Alberts等MolecularBiology of the Cell，第三版)。就多肽中氨基酸位置23而言，可由根据SEQ.ID No.1的编码序列位置67/68/69的一个或多个突变引起从谷氨酸到其他氨基酸的改变。就氨基酸位置337而言，可由根据SEQ.ID No.1的DNA序列位置1009或1010的一个或两个突变引起从缬氨酸到其他氨基酸的改变。由于，如上所述，某些类型的氨基酸改变是优选的，关于核苷酸序列优选的也是引起所述优选氨基酸改变的那些核苷酸改变。更优选的为引起E23K(多肽序列位置23从谷氨酸变为赖氨酸)和/或V337I改变(位置337从缬氨酸变为异亮氨酸；也参阅图7)的核苷酸改变。最优选的SNP为G67A(编码序列位置67从G变为A)和/或G1009A(编码序列位置1009从G变为A)。优选的实施方案还包括影响Kir6.2蛋白质中位置23和/或337氨基酸序列的基因组序列内的相应核苷酸改变。
根据本发明不同方面优选的实施方案，个体为糖尿病患者；更优选糖尿病为II型糖尿病(糖尿病diabetes mullitus)。还优选冠心病为心绞痛。
位置23的氨基酸改变为从谷氨酸到赖氨酸和/或位置337的氨基酸改变为从缬氨酸到异亮氨酸是有利的。样品优选为分离的蛋白质或核酸、组织学样品、细胞提取物或组织提取物或细胞。还优选样品从人体中分离。
本发明另一优选的实施方案涉及上述方法之一，其中确定样品中Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II的存在。样品可以是例如生物学(如组织学)样品、细胞提取物或组织提取物或细胞，并且样品还优选从人体中分离。
生物材料和生物样品包括例如细胞、组织和器官(例如脑、血、肝、脾、肾、心、血管等)制品或部分，优选来自脊椎动物，更优选来自哺乳动物包括人。还包括来自细胞培养物的细胞，优选包括来自多细胞生物和组织(如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3)或单细胞生物如酵母(例如裂殖酵母(s.pombe)或酿酒酵母(s.cerevisiae))细胞的真核细胞培养物，或原核细胞培养物，优选毕赤酵母(Pichia)或大肠杆菌。来自组织的细胞和样品可通过公知的技术获得，例如抽血、组织穿刺或外科技术。重组分子的制备和从细胞或组织中纯化天然存在分子如DNA或蛋白质，以及细胞或组织提取物的制备为本领域技术人员公知(参阅例如下文所列标准文献)。
氨基酸改变的存在可例如通过分析个体基因组DNA确定。合适的技术为本领域公知并包括例如不同的PCR技术、芯片杂交、狭线/斑点或Southern印迹。
PCR(聚合酶链式反应)为能够特异扩增序列串的体外技术，所述序列串在其5’和3’邻近处有已知序列的核苷酸串。为了扩增给定序列，待扩增序列5’区域的序列已知便足够了。在该情况下，应首先产生待扩增多核苷酸的片段(这可通过已知技术如用限制性内切酶消化完成)。然后通过连接酶(例如可从不同供货商处购得的T4 DNA连接酶)将已知序列的DNA分子(接头)偶联到产生的多核苷酸片段3’端。因此产生的序列被两个已知序列包围——已知的5’序列和3’已知接头序列，使能够通过PCR特异扩增(在该情况下为接头介导的PCR＂ImPCR＂)。
为了扩增选择的序列，使用短的单链DNA分子(引物)，其与组成待扩增多核苷酸序列的序列串互补。多核苷酸模板可以是DNA或RNA。然后将引物与标准单链模板退火并在确定和公知的条件下通过特异酶——所谓的聚合酶(识别DNA作为模板并产生互补DNA多核苷酸的DNA聚合酶或识别RNA作为模板并产生互补DNA多核苷酸的反转录酶)延伸，从而产生与模板链序列互补的新DNA链。通过选择确定序列在确定温度和确定时间间隔下周期性重复的温育步骤，产生变性/退火/聚合步骤的序列，其最后引起目的多核苷酸的指数式扩增。为了能够应用必须的退火温度而不破坏聚合酶，使用良好耐受高达95℃和更高温度的热稳定酶，例如Taq-DNA聚合酶(来自嗜热水生菌(thermus aquaticus)的DNA聚合酶)、PFU等，二者均可从不同的供应商处购得。合适的聚合酶选择取决于使用目的(例如用于通过PCR克隆时，优选选择有校对能力的聚合酶如PFU)并属于本领域技术人员能力范围之内。
典型的PCR反应包含多核苷酸模板(例如0.01到20ng)、两种合适的引物(浓度例如各0.2到2μM)、dNTP(浓度例如各200μM)、1到2mMMgCl2和1到10单位热稳定聚合酶如Taq。典型的组分和缓冲液是本领域技术人员所熟知的并通常可通过商业供货商获得。
合适的引物可通过根据公知方案的化学合成产生。这类引物也可通过不同的供应商如MWG Biotech等商业获得。
DNA和RNA模板以及cDNA模板可通过公知的标准操作(参阅例如下文标准文献)产生并且还可从如Promega和Stratagene等商业供应商处购得。
含有基因组DNA(和/或RNA和/或蛋白质)的生物样品的制备方法为本领域公知。作为参考参阅例如Sambrook等，或Current Protocols inMolecular Biology或Protein Science。
根据本发明优选的实施方案，通过包括或由下列步骤组成的方法确定氨基酸改变的存在e.从个体制备含有基因组DNA的生物样品。
F.如果不用原位方法直接分析靶序列，来自根据a)的样品的基因组DNA必须是分离的或至少部分纯化的，所述原位方法例如原位PCR或直接使用上述样品(例如组织样品或细胞)的直接基因组测序；g.使用能够扩增多核苷酸片段的引物通过使用PCR反应扩增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含对应于编码序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的基因组kir6.2序列的核苷酸位置，h.测序根据c)的多核苷酸片段。
就根据SEQ ID No.13的基因组Kir6.2序列而言，上述基因组序列内的“相应位置”分别为5657106/5657107/5657108和5657978/5657979/5657980(见图8)。
基因组序列中一个或多个核苷酸改变的存在引起蛋白质中一个或多个上述氨基酸改变，可随后根据已知的标准方法鉴定(例如使用标记的测序引物并进行放射自显影或荧光检测信号)。
用于扩增上述多核苷酸片段的合适引物的选择和设计在本领域技术人员能力之内。作为参考，参阅例如Sambrook等或Current Protocols inMolecular Biology。这同样适用于制备所述引物，其也可从供应商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)处定购。优选地，至少使用根据SEQ.IDNo.9、10、11或12的引物之一(见图5)用于测序和/或扩增。
根据本发明另一优选的实施方案，通过包括或由下列步骤组成的方法确定氨基酸改变的存在a.制备含有染色体/基因组DNA的生物样品。
b.从根据a)的样品中分离染色体DNA。
c.将其固定在载体上。
d.用一个或多个探针与固定的DNA杂交，所述探针在严格条件下能够与含有一个或多个核苷酸改变的Kir6.2序列以与野生型Kir6.2序列相比更高的亲和力杂交，所述核苷酸改变引起一个或两个所述氨基酸改变。
杂交可根据标准方法如放射自显影法或荧光使用相应标记的探针成像。
基因组Kir6.2序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改变的核苷酸改变的存在或不存在可随后通过将来自患者样品的杂交模式和/或强度与含有野生型基因组DNA的对照样品的杂交模式和/或强度比较来确定。
分离的多核苷酸和寡核苷酸可用于在不同严格度条件下杂交。
严格度描述了影响两个单链核酸分子杂交或退火特异性的反应条件。严格度和由此的反应特异性取决于(特别是)用于反应的温度和缓冲液条件可通过例如提高反应温度和/或降低反应缓冲液离子强度来提高严格度和由此的特异性。低严格度条件(以及由此的低反应特异性和杂交特异性)存在于例如在室温2×SSC溶液中进行杂交。高严格度条件包括例如在68℃0.1×SSC和0.1％SDS溶液中的杂交反应。
本发明不同方面中严格条件下杂交优选理解为1)在65℃将标记的探针与待分析的核酸样品杂交，或在寡核苷酸探针情况下在比由寡核苷酸和样品组成的双链体退火或解链温度(退火和解链温度在下文中理解为同义)低5℃，于50mM Tris pH7.5、1M NaCl、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、0.5mg/ml变性的鲑鱼精DNA或鲱鱼精DNA中过夜。
2)室温在2×SSC中洗涤10分钟。
3)65℃(或在寡核苷酸情况下低于退火温度5℃)在1×SSC/0.1％SDS中洗涤30分钟。
4)65℃(或在寡核苷酸情况下低于退火温度5℃)在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤30分钟。
寡核苷酸为多核苷酸并优选具有15到30，优选20个核苷酸长度的DNA片段。退火温度根据公式Tm＝2×(A+T的数目)+4×(G+C的数目)℃确定。
为了制备2×SSC或0.1×SSC(或任何其他种类SSC稀释液)，相应地稀释例如20×SSC溶液。20×SSC包括3M NaCl/0.3M柠檬酸钠×2H2O。
进行杂交反应前，(如果需要)在进行电泳分离后(然后Southern印迹(DNA)或Northern印迹(RNA))或不进行电泳分离(然后狭线或斑点印迹)将多核苷酸转移至适当的膜上，例如尼龙膜或硝酸纤维素膜。使用适当标记的探针进行杂交。合适的标记技术为例如放射标记或使用荧光染料标记。探针为单链的聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，其为天然单链的或通常是双链并已通过变性成为单链的。该探针通过碱基配对与DNA或RNA样品(其也为单链状态)结合。
DNA可例如直接固定在芯片基质上(例如Affymetrix Chips等)或于适当的膜上(例如硝酸纤维素、尼龙或其他适用于斑点或狭线印迹的)，或其可转移至凝胶基质上、电泳分离并印迹在合适的膜上(例如硝酸纤维素、尼龙或其他适用于Southern印迹的)。合适的芯片或膜以及相应的方法为本领域技术水平公知。上述方法如芯片杂交、斑点/狭线或Southern印迹为本领域公知(作为参考涉及例如下文所列文献)。
合适探针的选择和设计为本领域公知(参阅例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。这同样适用于所述探针的制备，其也可从供应商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)处获得。合适的为例如与基因组Kir6.2序列部分有更高亲和力的任何探针，所述序列部分包含对应于编码序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的那些核苷酸位置，所述编码序列含有至少一个引起Kir6.2蛋白质位置23和/或位置337的至少一个上述氨基酸改变的核苷酸改变。合适的探针为例如可能覆盖根据图6的基因组核苷酸三联体的探针。
氨基酸交换的存在还可通过分析个体RNA确定。合适的技术为本领域公知并包括例如RT PCR技术、芯片杂交或Northern印迹。
根据本发明另一优选的实施方案，通过包括或由下列步骤组成的方法确定氨基酸改变的存在a.提供来自个体的含有RNA的生物样品。
b.如果不直接分析RNA(例如通过原位PCR)，该RNA是从根据a)的样品中分离的或至少部分纯化的。
c.使用能够扩增多核苷酸片段的引物通过RT-PCR反应扩增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含Kir6.2 cDNA序列的位置67和/或1009。
d.测序根据c)的多核苷酸片段。
测序可根据标准操作进行。产生的序列梯的成像可通过例如使用荧光或放射性标记的引物或核苷酸进行。
Kir6.2编码序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改变的一个或多个核苷酸改变的存在或不存在可随后通过分析获得的序列并将其与野生型Kir6.2序列比较确定。
合适引物的选择和设计为本领域公知(参阅例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。这同样适用于所述引物的制备，其也可从供应商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)处获得。合适的为例如能够扩增至少包含Kir6.2编码序列部分的多核苷酸的任何引物集合，所述部分跨越位置67到69和/或位置1009到1011。优选的引物为例如根据SEQ ID No9到12的引物。
根据本发明另一优选的实施方案，通过包括或由下列步骤组成的方法确定氨基酸改变的存在a.从个体制备含有RNA的生物样品。
b.从根据a)的样品中分离RNA。
c.将RNA固定在载体上。
d.用一个或多个探针与固定的RNA杂交，所述探针在严格条件下能够与编码在位置23上含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337上含非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA以与编码在位置23上含谷氨酸和/或在位置337上含缬氨酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA相比更高的亲和力杂交。
杂交可根据标准方法如放射自显影法或荧光使用相应标记的探针成像。
Kir6.2编码序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改变的核苷酸改变的存在或不存在可随后通过分析杂交模式和/或信号强度并与含有Kir6.2野生型RNA的对照样品的杂交模式和/或信号强度比较确定。RNA可在杂交前例如直接固定在芯片基质上或合适的膜上，或其可以置于凝胶基质上并在进行凝胶电泳后印迹在合适的膜上(Northern印迹)。作为参考参阅例如下文所列文献。
合适探针的选择和设计为本领域公知(参阅例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。这同样适用于所述探针的制备，其也可从供应商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)处获得。合适的为例如与包含位置67到69和/或1009到1011的Kir6.2 RNA序列部分有更高亲和力的任何探针，所述部分含有至少一个引起Kir6.2蛋白质位置23和/或位置337的至少一个上述氨基酸改变的核苷酸改变。
氨基酸改变的存在还可通过分析个体的蛋白质组(即个体中表达的蛋白质)确定。合适的技术为本领域公知并包括例如蛋白质组学芯片分析、来自蛋白质、细胞或组织样品的免疫组织学或免疫化学技术或Western印迹分析。作为参考例如参考下文所列文献。
根据本发明另一优选的实施方案，通过包括或由下列步骤组成的方法确定氨基酸改变的存在a.从个体制备含有蛋白质的生物样品。
b.从根据a)的样品中分离蛋白质。
c.将其固定在载体上。
d.使用能够与其多肽链上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337含非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比与其多肽链上位置337含谷氨酸和/或在位置337含缬氨酸的Kir6.2更高的亲和力结合的抗体进行结合反应(在不允许与野生型蛋白质结合或以更小亲和力结合的条件下)；e.使抗体对蛋白质的结合成像(例如通过标记的第一抗体或标记的第二抗体等)。
蛋白质可例如直接固定在芯片基质上或合适的膜上或其他类型载体如ELISA板上。还可将蛋白质置于凝胶上并在进行凝胶电泳后转移并固定在载体(如合适的膜)上(Western印迹)。
根据本发明另一优选的实施方案，通过包括或由下列步骤组成的方法确定氨基酸改变的存在a.从个体制备组织学样品。
b.使用能够与其多肽链上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337含非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比与其多肽链上位置337含谷氨酸和/或在位置337含缬氨酸的Kir6.2更高的亲和力结合的抗体进行结合反应(在不允许与野生型Kir6.2蛋白质结合或以更小亲和力结合的条件下)；c.使得抗体对蛋白质的结合成像(例如通过标记的第一抗体或标记的第二抗体)。
突变的存在或不存在可通过分析标记的组织学样品并将信号强度与对照样品(例如来自用假的第一抗体或抗血清(即第一抗体或抗血清不与含有突变的Kir6.2反应，或与含有突变的Kir6.2以与特异的第一抗体或抗血清相比小得多的程度反应)或特意于野生型Kir6.2蛋白质的第一抗体处理的相同患者的样品和/或已知仅含有野生型Kir6.2蛋白质的对照样品)的比较来确定。
检测结合优选通过免疫组织化学或免疫放射测定方法进行。
根据上述方法优选的实施方案，位置23的氨基酸改变为从谷氨酸(野生型)到赖氨酸；也优选位置337的氨基酸改变为从缬氨酸(野生型)到异亮氨酸。
根据本发明的不同方面，冠心病优选冠状动脉疾病，并还更优选其为心绞痛。
根据本发明不同方面的另一优选的实施方案，在样品中确定Kir6.2-23-KK(在Kir6.2基因两个等位基因上作为核苷酸多态性结果蛋白质的位置23中具有赖氨酸(K)的Kir6.2变体)和/或Kir6.2-337-II(在Kir6.2基因两个等位基因上作为核苷酸多态性结果蛋白质的位置337中具有异亮氨酸(I)的Kir6.2变体)的存在。
样品可以是含有包括相应多态性的Kir6.2的任何样品。以允许容易检测相应多态性的方式制备样品是有利的。适当的实例取决于应用的检测方法并且是例如组织学样品、细胞提取物或组织提取物或细胞，优选分离自人体。适当的用于鉴定各多态性的技术例如PCR、以核酸或蛋白质为基础的阵列技术、使用适当抗体的免疫组织学或免疫化学技术为本领域技术人员公知。这同样适用于合适的引物集合和抗体或抗血清的选择和制备。这类技术参考例如下列文献。
本发明的另一方面涉及用于检测Kir6.2蛋白质、Kir6.2-23-KK或Kir6.2-337-II中位置23非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337非缬氨酸的其他氨基酸的存在的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一种用于在蛋白质中检测所述存在的工具。在本发明上下文中，试剂盒部件(简称试剂盒)应理解为本申请中鉴定的组分的任何组合，其空间地共存组合为功能单元，其中所述试剂盒可包含其他组分。
所述工具可以是例如对位置23含谷氨酸和/或位置337含缬氨酸的Kir6.2与位置23并非谷氨酸和/或位置337并非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2之间的结合特征有区别的抗体。特异抗体的制备为本领域公知。作为参考例如参考下文所列文献。另外，优选试剂盒含有标记的第二抗体。试剂盒还可含有合适的试剂、缓冲液等用于进行结合和/或标记反应等。如果包括使用说明(例如公开优选的反应条件、缓冲液组分等的手册或纸张)也是合适的。
根据优选的实施例，所述工具为对野生型Kir6.2和位置23和/或337所含氨基酸改变的Kir6.2之间结合性质有区别的抗体(即单克隆抗体、多克隆抗血清或重组抗体)。这类抗体可以例如与位置23和/或337为野生型的Kir6.2蛋白质以更高亲和力结合，或与位置23和/或337的一个或多个较不常见变体以更高亲和力结合。检测试剂盒中包含一组抗体也是有利的，其中各抗体能够特异地检测一种多态性；实践中也包括仅识别野生型蛋白质的对照抗体(还可能是用于确定背景信号的假抗体或抗血清)，也可包含用于进行所选检测技术(例如蛋白质印迹、阵列技术或其他免疫或免疫组织化学技术)有用的或必须的其他试剂。合适抗体的使用或制备和用于组装检测试剂盒的有用或必须试剂为本领域公知。另外具有期望的结合特性的抗体的制备由不同的供货商如BioTrend，Cologne，Germany商业进行。
本发明的另一方面涉及用于检测Kir6.2核苷酸序列中一个或两个Kir6.2基因的等位基因上存在改变的检测试剂盒，所述改变产生Kir6.2蛋白质中位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列，其中所述试剂盒包括用于检测核苷酸序列中所述变异的至少一种工具。
其他工具为例如合适的测序引物，或仅用于特异扩增野生型Kir6.2的DNA或RNA的引物集合，和/或仅用于扩增含有位置23和/或337突变的Kir6.2的DNA或RNA的引物集合。选择和使用合适引物，能够用于特异性测序或扩增某些序列是本领域技术人员的能力(参阅例如根据实施例2的引物和条件)。检测试剂盒中也可包括用于进行测序反应或扩增的有用和必须试剂，如聚合酶、缓冲液、核苷酸等(参阅例如根据实施例2的引物和条件)。如果试剂盒包含组装的对不同Kir6.2多态性特异的不同测序引物和PCR引物集合从而可以确定Kir6.2中不同类型多态性的存在，是非常有利的。
根据另一优选的实施方案，所述工具为识别野生型Kir6.2和/或在位置23和/或337含有突变的Kir6.2的核酸探针。用于进行所选检测技术的有用探针的使用和选择(例如所有种类的核酸印迹、阵列技术或其他种类的芯片技术)也在本领域技术人员范围之内。也可包括在检测试剂盒中的合适试剂的选择也是如此。优选地，一组识别不同多态性的不同探针也包括在测试试剂盒中。
位置23的氨基酸优选为赖氨酸而位置337的氨基酸优选为异亮氨酸。
优选Kir6.2的核苷酸序列在编码序列的位置67带有G。还优选Kir6.2的核苷酸序列在编码序列的位置1009带有A。
根据优选的实施方案，检测试剂盒含有能够扩增多核苷酸片段的引物集合，所述片段含有Kir6.2编码序列的位置67和/或1009。优选的引物为例如根据SEQ ID No.9到12的引物。
根据另一优选的实施方案，检测试剂盒含有能够扩增多核苷酸片段的至少一种引物集合，所述片段包含根据SEQ ID No.13的基因组Kir6.2序列的位置5657106/7/8和/或5657978/79/80。优选的引物为例如根据SEQ IDNo.9到12的引物。
根据另一优选的实施方案，检测试剂盒包含在严格条件下特异性识别Kir6.2基因组DNA或RNA的一种或多种核酸探针，所述基因组DNA或RNA带有编码位置23并非谷氨酸和/或位置337并非缬氨酸的其他氨基酸的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及带有多肽序列位置23的赖氨酸和位置337的异亮氨酸的分离的Kir6.2多肽或其片段。本发明优选的实施方案涉及分离的根据SEQ ID No.7的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和/或337的氨基酸。
本发明的另一方面还涉及分离的多核苷酸，其编码上述K23/I337-Kir6.2多肽或其包含位置23和337的片段之一。本发明优选的实施方案涉及分离的根据SEQ ID No.8的Kir6.2多核苷酸或其片段，或分离的与上述DNA序列或它们的互补链在高严格度条件下杂交的多核苷酸，所述片段包括核苷酸位置67和1009(还优选包括位置68、69、1010和1011)。
本发明的另一方面涉及含有多肽序列位置23的谷氨酸和位置337的异亮氨酸的分离的Kir6.2多肽或其片段。本发明优选的实施方案涉及分离的根据SEQ ID No.5的Kir6.2多肽或其包括氨基酸位置23和/或337的片段。
本发明的另一方面还涉及分离的多核苷酸，其编码上述E23/I337Kir6.2多肽或其包括位置23和337的片段之一。本发明优选的实施方案涉及分离的根据SEQ ID No.6的Kir6.2多核苷酸或其片段，或分离的与上述DNA序列或它们的互补链在高严格度条件下杂交的多核苷酸，所述片段包括核苷酸位置67和1009(还优选包括位置68、69、1010和1011)。
本发明的另一方面涉及用于检测Kir6.2基因或RNA内核苷酸变异的探针，所述探针包含或由Kir6.2序列的至少17个，优选19到100个连续核苷酸组成，所述连续核苷酸跨越Kir6.2编码序列位置67和/或1009或跨越基因组Kir6.2序列位置5657106/07/08和/或5657978/79/80。
本发明的另一方面涉及用于扩增Kir6.2多核苷酸的引物或引物集合，其中扩增的多核苷酸至少包含编码Kir6.2序列的位置67和/或1009和/或基因组Kir6.2序列的位置5657106/07/08和/或5657978/79/80。
在下文中，通过若干实施例更详细地解释本发明，所述实施例并非旨在限制本发明的范围。
实施例在患有I和II型糖尿病的患者群(主要为II型，即糖尿病)中分析Kir6.2蛋白质位置23和位置337的Kir6.2多态性(野生型蛋白质序列NCBI登录号D 50582(SEQ.ID No1；图1A)；编码序列的NCBI登录号D 05852(SEQ.ID No.2；图1B))。
实施例1研究受试者(研究人群)筛选335位患者基因组DNA在产生蛋白质变体Kir6.2-E23K和Kir6.2-V337I的Kir6.2基因中的SNP(单核苷酸多态性)。纳入标准为德国祖先的高加索人个体，稳定的临床状况和冠状动脉造影照片。排除标准为除ACS外的急性病、慢性非心脏性疾病(即风湿性关节炎)和过去五年间有恶性病史。该患者群的基本特征在表2中概述。所有的患者签署了书面知情同意书。
实施例2通过测序和分析检测SNP2.1扩增具有目的多态性的基因组区域扩增引物A用于检测登录号NT 009307的Kir6.2基因序列位置5657978/79/80上的核苷酸改变。
正向引物M675’-AGGTGGAGGTAAGGAAGAG-3’(SEQ ID.No.9)反向引物M675’-GGTGAAGATGAGCAATGTG-3’(SEQ ID.No.10)B用于检测登录号NT 009307的Kir6.2基因序列位置5657106/07/08上的核苷酸改变。
正向引物M10095’-GGGTGGCAACAGCATCTTC-3’(SEQ ID.No.11)反向引物M10095’-TGGCTCAGGACAGGGAATC-3’(SEQ ID.No.12)引物也可用于扩增Kir6.2编码序列。
用于扩增的PCR方案所有的试剂均来自Applied Biosystems(Foster City，USA)20ng基因组DNA、1单位TaqGold聚合酶、1×Taq聚合酶缓冲液、500μM dNTP、2.5mM MgCl2、200nM各种扩增引物对(序列参阅上文的扩增引物对1.A和1.B)、加H2O至5μl。
用于PCR/基因型分型的扩增程序95℃×10分钟×1循环95℃×30秒70℃×30秒×2循环；95℃×30秒65℃×30秒×2循环；95℃×30秒60℃×30秒×2循环；95℃×30秒56℃×30秒72℃×30秒×40循环；72℃×10分钟4℃×30秒×1循环；2.2鉴定目的多态性多态性的微测序和检测方案所有的试剂来自Applied Biosystems(Foster City，USA)。2μl纯化的PCR产物、1.5μl BigDye终止子试剂盒、200nM一种测序引物(序列参阅上文的正向或反向扩增引物1.A和1.B)、加H2O至10μl。
用于测序的扩增程序96℃×2分钟×1循环；96℃×10秒55℃×10秒65℃×4分钟×30循环；72℃×7分钟4℃×30秒×1循环；分析测序产物
首先用测序分析软件(Applied Biosystems，Foster City，USA)进行原始数据提取并用Phred(碱基调用)、Phrap(汇编)、Polyphred(SNP调用)和Consed(结果评价)进行加工来分析序列。Phred、Phrap、Polyphred和Consed是在WashU由Phil Green设计的软件(http://www.genome.washington.edu)。
PCR反应导致鉴定编码序列位置67从G到A的改变和位置1009从A到G的改变。
2.3Kir6.2蛋白质中氨基酸改变与冠心病的关联为了分析Kir6.2多态性对患有心血管疾病和代谢性疾病患者临床结果的影响，发明者在335个患有I型或II型糖尿病个体的患者群内进行了Kir6.2多态性E23K、L270V和I337V的相关分析。在350个临床参数中，心绞痛与Kir6.2蛋白质位置23赖氨酸(K)和/或位置337缬氨酸(V)纯合的患者显著相关。
Kir6.2-23-EE(位置23为野生型)定义了这样的个体群，其中两个Kir6.2等位基因编码引起Kir6.2蛋白质位置23谷氨酸(Glu或E)的Kir6.2基因变体，该组对Kir6.2蛋白质位置23的该Kir6.2多态性是纯合的。
Kir6.2-23-EK定义了这样的个体群，其中两个Kir6.2等位基因之一编码引起Kir6.2蛋白质位置23谷氨酸(Glu或E)的Kir6.2基因变体，而另一Kir6.2等位基因编码引起Kir6.2蛋白质位置23赖氨酸(Lys或K)的Kir6.2基因变体，该组对Kir6.2蛋白质位置23的Kir6.2多态性是杂合的。
Kir6.2-23-KK定义了这样的个体群，其中两个Kir6.2等位基因均编码引起Kir6.2蛋白质位置23赖氨酸(Lys或K)的Kir6.2基因变体，该组对Kir6.2蛋白质位置23的该Kir6.2多态性是纯合的。Kir6.2-23-KK还定义了患者这样的生物样品，其中两个Kir6.2等位基因均编码引起Kir6.2蛋白质位置23赖氨酸(赖氨酸或K)的Kir6.2基因变体。
Kir6.2-337-II定义了这样的个体群，其中两个Kir6.2等位基因均编码引起Kir6.2蛋白质位置337异亮氨酸(Ile或I)的Kir6.2基因变体，该组对Kir6.2蛋白质位置337的该Kir6.2多态性是纯合的。Kir6.2-337-II还定义了患者这样的生物样品，其中两个Kir6.2等位基因均编码引起Kir6.2蛋白质位置337异亮氨酸(异亮氨酸或I)的Kir6.2基因变体。
Kir6.2-337-IV定义了这样的个体群，其中两个Kir6.2等位基因之一编码引起Kir6.2蛋白质位置337异亮氨酸(Ile或I)的Kir6.2基因变体，而另一Kir6.2等位基因编码引起Kir6.2蛋白质位置337缬氨酸(Val或V)的Kir6.2基因变体，该组对Kir6.2蛋白质位置337的Kir6.2多态性是杂合的。
Kir6.2-337-VV(位置337为野生型)定义了这样的个体群，其中两个Kir6.2等位基因均编码引起Kir6.2蛋白质位置337缬氨酸(Val或V)的Kir6.2基因变体，该组对Kir6.2蛋白质位置337的该Kir6.2多态性是纯合的。
基因型/表型关联的统计学途径所有的分析都用SAS统计软件包(6.12版，SAS Institute GmbH，Heidelberg/Germany)完成。为了检测遗传多态性和大量临床相关参数之间的关联，计算描述统计学(中位数，四分位数)并进行Wilcoxon秩和检验。Wilcoxon秩和检验用于比较两个独立的样本。测试统计值的计算基于汇合样本的等级。以类似方式搜索SNP和风险因子以及疾病之间的关联。进行卡方检验并计算数字和百分比以描述数据。卡方检验为计算两个变量依赖性的统计学检验。变量值包含于两个或更多组中。为了分析那些变量的关联，使用列联表。该列联表包含与第一变量的实现值数量一样多的行和与第二变量的实现值数量一样多的列。每个单元含有特定的患者特征。为了构建检验统计值，计算出计算频率和观察频率的差异。检查结果后选择相关的变量。考虑到混杂的共变量，使用逻辑斯特回归(logistic regression)验证结果。使用逻辑斯特回归方法分析若干说明变量对某一应答变量的影响。关联的统计检验给出p值。该p值解释为对关联的说明变量有显著影响。
对于二元变量，计算比值比。比值比是事件在一个集合中发生的比值与事件在另一集合中发生的比值的比。
实施例3分析表2中显示了Kir6.2变体E23K和V337I在335个个体中的分布。如表3到8中所列的，可以看到Kir6.2-23-KK与Kir6.2-337-II、Kir6.2-23-EK与Kir6.2-337-VI以及Kir6.2-23-EE与Kir6.2-337-VV之间的强连锁。因此，对例如Kir6.2-23-KK获得的所有统计学数据应与Kir6.2-337-II的那些类似。
带有Kir6.2-23-KK和Kir6.2-337-II的糖尿病患者显示与心绞痛的提高关联。使用卡方检验对糖尿病患者中Kir6.2-23-KK基因型与心绞痛关联的统计学显著性计算为p值＝0.015，而糖尿病患者中Kir6.2-337-II基因型与心绞痛关联为p值＝0.012(图2A和图3A)。
用于分析致混杂因素(例如心肌梗塞和高血压)影响的逻辑斯特回归，产生糖尿病患者中Kir6.2-23-KK基因型与心绞痛关联的p值＝0.0088，而糖尿病患者中Kir6.2-337-II基因型与心绞痛关联的p值＝0.0072(图2B和图3B)。
糖尿病患者中提高的心绞痛风险的比值比为Kir6.2-23-KK基因型1.061而Kir6.2-337-II基因型1.615(图2C和图3C)。
本文显示的数据说明Kir 6.2基因中由位置23从谷氨酸到赖氨酸的改变引起的突变(特别是Kir6.2-23-KK)和Kir6.2基因中引起位置337从缬氨酸到异亮氨酸的氨基酸改变的突变(特别是Kir6.2-337-II)，代表了糖尿病患者中心绞痛的风险标记物。由于心绞痛是冠心病的征兆，可以预期这些标记物通常是冠心病的指征。另外，可以预期Kir6.2基因中引起Kir6.2蛋白质中位置23氨基酸改变的其他突变(特别是将酸性谷氨酰酸改变为非极性的或优选碱性氨基酸的突变)具有相同或者类似的效应。可对位置337的氨基酸改变做相同预期，所述改变将缬氨酸改变为其他的，特别是酸性或碱性的或更大的脂肪族氨基酸。很可能这些氨基酸改变还与非糖尿病患者的冠心病(特别是心绞痛)发病非常密切地相关。
参考文献Yamada Y，Kuroe A，Li Q，Someya Y，Kubota A，lhara Y，Tsuura Y1 SeinoY(2001).Genomic variation in pancreatic ion channel genes in Japanesetype 2 diabetic patients.Diabetes Metab Res Rev 17213-216.
Hani EH，Boutin P，Durand E，lnoue H1 Permutt MA，Velho G，Froguel P(1998).Missense mutations in the pancreatic islet beta cell inwardlyrectifying K+channel gene(KIR6.2/BIR)a meta-analysis suggests a rolein the polygenic basis of Type Il diabetes mellitus in Caucasians.Diabetologia 411511-1515.
实验室方法的标准文献如果没有另外说明，根据下列标准文献进行标准实验室方法Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual.第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.545页；Current Protocols in Molecular Biology；常规更新的，例如2000卷；Wiley&Sons，Inc；编辑Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert Eg.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics；常规更新的；Wiley&Sons，Inc；编辑Nicholas C.Dracopoli，Honathan L.Haines，Bruce R.Korf，Cynthia C.Morton，Christine E.Seidman，J.G.Seigman，Douglas R.Smith.
Current Protocols in Protein Science；常规更新的；Wiley&Sons，Inc；编辑John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，PaulT.Wingfield.Molecular Biology of the Cell；第3版；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；Garland Publishing，Inc.New York&London，1994；Short Protocols in Molecular Biology，第5版，Frederick M.Ansubel(编辑)，Roger Brent(编辑)，Robert E.Kingston(编辑)，David D.Moore(编辑)，J.G.Seidman(编辑)，John A.Smith(编辑)，Kevin Struhl(编辑)，October2002，John Wiley&Sons，Inc.，New York＂
图1在位置23(谷氨酸)和位置337(缬氨酸)包含最常见多肽链变体(对应于编码序列位置67/68/69的密码子GAG和位置1009/1010/1011的GTC)的Kir6.2(KCNJ 11)的蛋白质序列和编码核苷酸序列。这些变体被称为Kir6.2-23K-337V(或KK和/或VV，如果两个等位基因就位置23和/或337而言是相似的)。该Kir6.2变体的蛋白质登录号(NCBI蛋白质数据库)为D50582。多肽序列的位置23和337以及相应的核苷酸位置和编码序列中的ATG标有下划线。
图2在位置23上含有变体赖氨酸和在位置337为最常见变体缬氨酸(对应于编码序列的位置67/68/69上密码子AAG和位置1009/1010/1011上GTC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白质序列和编码核苷酸序列。该Kir6.2变体的蛋白质序列登录号(NCBI蛋白质数据库)为XP_006398(图2A；SEQ ID No.2)。核苷酸序列登录号(NCBI核苷酸数据库)为XM_006398(图2B；SEQ ID No.4)。多肽序列的位置23和337和编码序列中相应的核苷酸位置标有下划线。
图3在位置23上含有最常见变体谷氨酸和在位置337含有变体异亮氨酸(对应于编码序列的位置67/68/69上密码子GAG和位置1009/1010/1011上ATC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白质序列和编码核苷酸序列。蛋白质序列除位置337外对应于根据序列登录号D50582的“野生型”Kir6.2，所述位置337带有异亮氨酸而非缬氨酸。编码序列除位置1009外对应于根据序列登录号D50582的“野生型”Kir6.2，所述位置1009带有腺苷而非鸟苷。多肽序列的位置23和337和编码序列中相应的核苷酸位置标有下划线。
图4在位置23含有变体赖氨酸和在位置337含有变体异亮氨酸(对应于编码序列位置67/68/69的密码子AAG和位置1009/1010/1011的ATC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白质序列和编码核苷酸序列。除位置23带有赖氨酸而非谷氨酸和位置337带有异亮氨酸而非缬氨酸外，该蛋白质序列对应于根据序列登录号D50582的“野生型”Kir6.2的蛋白质序列。除位置67带有腺苷而非鸟苷和位置337带有腺苷而非鸟苷外，该编码序列对应于根据序列登录号D50582的“野生型”Kir6.2的编码序列。多肽序列的位置23和337和编码序列中相应的核苷酸位置标有下划线。
图5DNA引物M67正向(SEQ ID No.9)和反向(SEQ ID No.10)用于检测Kir6.2基因组序列中对应于Kir6.2编码序列的位置67/68/69的核苷酸改变，而DNA引物M1009正向(SEQ ID No.11)和反向(SEQ ID No.12)用于检测Kir6.2基因组序列中对应于根据序列登录号的Kir6.2编码序列的位置1009/1010/1011的核苷酸改变。就SEQ ID No.25而言，位置分别为5657106/107/108和5657978/79/80。
引物集合也可用于特异性扩增根据NCBI序列登录号D50582的Kir6.2 cDNA。引物M67(正向(SEQ ID No.9)和反向(SEQ ID No.10)扩增包含Kir6.2 cDNA核苷酸67/68/69的区域，用于在RNA水平上检测Kir6.2基因中的核苷酸改变。引物M1009(正向(SEQ ID No.11)和反向(SEQ IDNo.12)扩增包含Kir6.2 cDNA核苷酸1009/1010/1011的区域，用于在RNA水平上检测Kir6.2基因中的核苷酸改变。
图6一些Kir6.2变体的基因组和编码序列的相应核苷酸位置概况。基因组序列内位置的编号来自NCBI登录号NT 009307下人类染色体11基因组连续序列(包含Kir6.2基因组基因座连续序列的部分也参阅图10)。
图7引起多肽链位置23从谷氨酸到赖氨酸和位置337从缬氨酸到异亮氨酸氨基酸改变的Kir6.2核苷酸序列的改变。核苷酸位置是指Kir6.2编码序列。这些位置与根据SEQ ID No.25的基因组Kir6.2序列的位置5657106/7/8和5657978/79/80相关(其中SEQ ID No.25编码蛋白质序列位置337的缬氨酸)。最常见的变体(即野生型)用正常字母写出，核苷酸或氨基酸序列中自该野生型的衍变用粗体字母给出。对于氨基酸23，单核苷酸改变G67A产生掺入多肽链的赖氨酸，而单独的改变G69A并不引起氨基酸序列的改变。这一突变类型通常被称为沉默突变。另一方面，如果上述两个核苷酸改变同时发生，仍是赖氨酸掺入位置23。至于氨基酸链的位置337，单核苷酸改变C1011T、C1011A和C1011G是沉默突变，而单核苷酸改变G1009A使多肽链位置337掺入异亮氨酸，即使C1011T或C1011A与G1009A一起共同发生也是如此。位置67/68/69和/或1009/1010/1011的其他改变是可能的，分别引起其他氨基酸掺入多肽链代替位置23的G或K或位置337的V或I(这些遗传密码引起的关联通常为本领域技术水平公知)。
图8在位置5657106/107/108含有核苷酸GAC(对应于编码序列位置1009/1010/1011的密码子GTC并因此编码多肽链位置337含有氨基酸缬氨酸的蛋白质变体)和位置5657978/79/80含有核苷酸CTT(对应于编码序列位置67/68/69的密码子AAG并因此编码多肽链位置23含有氨基酸赖氨酸的蛋白质变体)的Kir6.2(KCNJ11)基因座基因组序列。所示的核苷酸三联体打印为粗体并标有下划线。根据SEQ ID No.9到12的PCR引物的杂交位置也打印为粗体并标有下划线。如此选择引物序列以允许使用Kir6.2cDNA作为模板扩增多核苷酸。可公开获得的包含该Kir6.2基因组变体的人染色体11基因组连续序列的序列登录号为NT_009307(SEQ ID No.25)。
表格说明表1已进行所有分析的患者群的基本特征。
表2分析的糖尿病患者群中Kir6.2变体的分布。
表3卡方检验计算的糖尿病患者中蛋白质位置23的Kir6.2变体与心绞痛的关联。在心绞痛阳性组中能够观察到Kir6.2-23-KK携带者频率提高。
表4通过逻辑斯特回归计算糖尿病患者中Kir6.2-23-KK与心绞痛关联的统计学显著性。
表5计算与Kir6.2-23-EK和Kir6.2-23-EE携带者相比，Kir6.2-23-KK携带者的糖尿病患者心绞痛风险的比值比。
表6通过卡方检验计算糖尿病患者中Kir6.2在蛋白质位置337的变体与心绞痛的关联。心绞痛阳性组中能够观察到Kir6.2-337-II携带者频率提高。
表7通过逻辑斯特回归计算糖尿病患者中Kir6.2-337-II与心绞痛关联的统计学显著性。
表8计算与Kir6.2-337-VI和Kir6.2-337-VV携带者相比，Kir6.2-337-II携带者的糖尿病患者心绞痛风险的比值比。
表1
*中位数和四分位数(Q1-Q3)
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
序列表<110>塞诺菲-安万特德国有限公司<120>蛋白质多态性与冠心病的关联<130>DEAV2004/0064<140>04021528.7<141>2004-09-10<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>390<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Glu Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160
Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg165 170 175Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg180 185 190His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser195 200 205Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr210 215 220Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met225 230 235 240Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile245 250 255Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro260 265 270Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu275 280 285Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr290 295 300Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala305 310 315 320Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr325 330 335Val Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp340 345 350His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu355 360 365Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile370 375 380Ser Pro Asp Ser Leu Ser385 390<210>2<211>1173<212>DNA<213>智人
<400>2atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60cctgccgagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccgt caaagtgccc 1020acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173<210>3<211>390<212>PRT<213>智人<400>3Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Lys Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125
Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg165 170 175Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg180 185 190His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser195 200 205Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr210 215 220Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met225 230 235 240Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile245 250 255Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro260 265 270Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu275 280 285Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr290 295 300Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala305 310 315 320Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr325 330 335Val Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp340 345 350His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu355 360 365Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile370 375 380Ser Pro Asp Ser Leu Ser385 390
<210>4<211>1173<212>DNA<213>智人<400>4atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60cctgccaagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccgt caaagtgccc 1020acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173<210>5<211>390<212>PRT<213>智人<400>5Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Glu Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95
His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ser Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg165 170 175Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg180 185 190His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser195 200 205Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr210 215 220Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met225 230 235 240Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile245 250 255Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro260 265 270Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu275 280 285Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr290 295 300Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala305 310 315 320Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr325 330 335Ile Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp340 345 350His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu355 360 365
Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile370 375 380Ser Pro Asp Ser Leu Ser385 390<210>6<211>1635<212>DNA<213>智人<400>6ctgaggctgg tattaagaag tgaagtggga cccaggtgga ggtaaggaag agtctggtgg 60ggagttatct cagaagtgag gccagcacag gctgagtgca gccccagggt gagaaggtgc 120ccaccgagag gactctgcag tgaggcccta ggccacgtcc gaggggtgcc tccgatgggg 180gaagcccctc cctgggggtc accggagcca tgctgtcccg caagggcatc atccccgagg 240aatacgtgct gacacgcctg gcagaggacc ctgccgagcc caggtaccgt gcccgccagc 300ggagggcccg ctttgtgtcc aagaaaggca actgcaacgt ggcccacaag aacatccggg 360agcagggccg cttcctgcag gacgtgttca ccacgctggt ggacctcaag tggccacaca 420cattgctcat cttcaccatg tccttcctgt gcagctggct gctcttcgcc atggcctggt 480ggctcatcgc cttcgcccac ggtgacctgg cccccagcga gggcactgct gagccctgtg 540tcaccagcat ccactccttc tcgtctgcct tccttttctc cattgaggtc caagtgacta 600ttggctttgg ggggcgcatg gtgactgagg agtgcccact ggccatcctg agcctcatcg 660tgcagaacat cgtggggctc atgatcaacg ccatcatgct tggctgcatc ttcatgaaga 720ctgcccaagc ccaccgcagg gctgagaccc tcatcttcag caagcatgcg gtgatcgctc 780tgcgccacgg ccgcctctgc ttcatgctac gtgtgggtga cctccgcaag agcatgatca 840tcagcgccac catccacatg caggtggtac gcaagaccac cagccccgag ggcgaggtgg 900tgcccctcca ccaggtggac atccccatgg agaacggcgt gggtggcaac agcatcttcc 960tggtggcccc gctgatcatc taccatgtca ttgatgccaa cagcccactc tacgacctgg 1020cacccagcga cctgcaccac caccaggacc tcgagatcat cgtcatcctg gaaggcgtgg 1080tggaaaccac gggcatcacc acccaggccc gcacctccta cctggccgat gagatcctgt 1140ggggccagcg ctttgtgccc attgtagctg aggaggacgg acgttactct gtggactact 1200ccaagtttgg caacaccatc aaagtgccca caccactctg cacggcccgc cagcttgatg 1260aggaccacag cctactggaa gctctgaccc tcgcctcagc ccgcgggccc ctgcgcaagc 1320gcagcgtgcc catggccaag gccaagccca agttcagcat ctctccagat tccctgtcct 1380gagccatggt ctctcgggcc ccccacacgc gtgtgtacac acggaccatg tggtatgtag 1440cccagccagg gcctggtgtg aggctgggcc agcctcagct cagcctcccc ctgctgctca 1500tccagggtgt tacaaggcac ttgtcactat gctatttctg gcctcagcag gaacctgtac 1560tgggttattt ttgtccctgc tcctcccaac ccaatttagg actggctcac ccctctcccc 1620cgcccaaggc tgcag 1635<210>7<211>390<212>PRT<213>智人<400>7Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15
Leu Ala Glu Asp Pro Ala Lys Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg165 170 175Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg180 185 190His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser195 200 205Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr210 215 220Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met225 230 235 240Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile245 250 255Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro260 265 270Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu275 280 285
Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr290 295 300Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala305 310 315 320Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr325 330 335Ile Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp340 345 350His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu355 360 365Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile370 375 380Ser Pro Asp Ser Leu Ser385 390<210>8<211>1173<212>DNA<213>智人<400>8atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60cctgccaagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccat caaagtgccc 1020acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173<210>9<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>9rwardrmrma ggtggaggta aggaagag 28<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>10rvrsrmrmgg tgaagatgag caatgtg27<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>11rwardrmrmg ggtggcaaca gcatcttc28<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>12rvrsrmrmtg gctcaggaca gggaatc 27<210>13<211>3102<212>DNA<213>智人<300>
<400>13stnsccaggt gctttttcag ggaccaagta gagctggggc ctgaccacag gcacttcttg 60gagccacaga cgcaaagcag cagccctcgg ggattgttct tccccagcca ccggcccaga 120gtgtggctgg tcaatcgtgg ggacccagga ctggctggac gcacagctct agggcccagt 180acctcccaca gcctctgcag ccttgggcgg gggagagggg tgagccagtc ctgaattggg 240ttgggaggag cagggacaaa aataacccag tacaggttcc tgctgaggcc agaaatagca 300tagtgacaag tgccttgtaa caccctggat gagcagcagg gggaggctga gctgaggctg 360gcccagcctc acaccaggcc ctggccgggc tacataccac atggtccgtg tgtacacacg 420cgtgtggggg gcccgagaga ccatggctca ggacagggaa tctggagaga tgctgaactt 480gggcttggcc ttggaccgag tcctgtccct tagmrvrscc atgggcacgc tgcgcttgcg 540caggggcccg cgggctgagg cgagggtcag agcttccagt aggctgtggt cctcatcaag 600ctggcgggcc gtgcagagtg gtgtgggcac tttgacggtg ttgccaaact tggagtagtc 660cacagagtaa cgtccgtcct cctcagctac aatgggcaca aagcgctggc cccacaggat 720ctcatcggcc aggtaggagg tgcgggcctg ggtggtgatg cccgtggttt ccaccacgcc 780ttccaggatg acgatgatct cgaggtcctg gtggtggtgc aggtcgctgg gtgccaggtc 840gtagagtggg ctgttggcat caatgacatg gtagatgatc agcggggcca ccaggaagat 900gctgttgcca cccacgccgt tctccatggg gatgtccact tctacgacaa cggtgggmrw 960ardcctggtg gaggggcacc acctcgccct cggggctggt ggtcttgcgt accacctgca 1020tgtggatggt ggcgctgatg atcatgctct tgcggaggtc acccacacgt agcatgaagc 1080agaggcggcc gtggcgcagg gcgatcaccg catgcttgct gaagatgagg gtctcagccc 1140tgcggtgggc ttgggcagtc ttcatgaaga tgcagccaag catgatggcg ttgatcatga 1200gccccacgat gttctgcacg atgaggatca ggatggccag tgggcactcc tcagtcacca 1260tgcgcccccc aaagccaata gtcacttgga cctcaatgga gaaaaggaag gcagacgaga 1320aggagtggat gctggtgaca cagggctcag cagtgccctc gctgggggcc aggtcaccgt 1380gggcgaaggc gatgagccac caggccatgg cgaagagcag ccagctgcac aggaaggaca 1440tggtgaagat gagccacttc tactccaatg tgtgtggcca cttgaggtcc accagcgtgg 1500tgaacacgtc ctgcaggaag cggccctgct cccgggttac amrvrsatgt tcttgtgggc 1560cacgttgcag ttgcctttct tggacacaaa gcgggccctc cgctggcggg cacggtacct 1620gggcttggca gggtcctctg ccaggcgtgt cagcacgtat tcctcgggga tgatgccctt 1680gcgggacagc atggctccgg tgacccccag ggaggggctt cccccatcgg aggcacccct 1740cggacgtggc ctagggcctc actgcagagt cctctcggtg ggcaccttct caccctgggg 1800ctgcactcag cctgtgctgg cctcacttct gagataactc cccaccagac tcttccttac 1860ctccacctgg gtcccacttc acttcttaat accagcgaga aggaatggag gtggamrwar 1920dctcaggccg ggcgcggtgg ctcacgcctg taatcccagt acgttgggag gctgaggagg 1980gcagatcact aggtcaggag ttcgagacca gcctgaccaa catggtgaaa ccccatctct 2040actaaaaata caaaagttag ccgggcatgg tggtgcgcac ctgtaatccc agctactcag 2100gaagctgagg caggagaatc gcttgaaccc gagaggcgga ggttgcagtg agccaagatc 2160acgccactgc actccagcct gggcgacaga gcgagactcc gtctcaaaaa caaaaaacaa 2220aacaaaaaaa acagcctcac ccttgagccc acctgcctgg cgcctaggga gcccccaacc 2280ctgccggctc tccacctggc cctgcgtcct cccccagctt cccccaccag ctgaccaccc 2340ctgggcctcc cgctaagagc ccttctcccc gcccagcctg ccttcccagc ccagctcaga 2400acttaacacc tccggatctc tcccactaac cggacctcac ccccacctcc gggtctcccg 2460cctcacctgt ctggccttcg ggctcccagg ctccagctca ggtcctggcc acccccgccc 2520cgtctctcct ccaggtgcgc cccctatgtc ctactccacc cctcccggag cgcccccgcc 2580gctttccgga tccccctcca gctctcgtcc tctctgtctc cttgggatcc tgcgttctct 2640ggagtcacca ccccacccgg ctcaaccgcg gctccccgga cctgcgcgcg acccggcggg 2700gctgactccg agtcgcggcc tcccggtccc tgccgcccgc ccgcgccgcg gctcccgctc 2760cgcgccgggt cccggccccg cccgccgccg ccgctgcacc tgctcctgct cctcacgcca 2820cggccgtcgc ctccccgccc cctcccgccg cccgggcgct cgcggctggc cgtcctcccg 2880tctgtctgtc cgtccgtggg tccgcggaga ccgacctggg ctaggcaggg gtctaggacg 2940gcgggagggg ggcgcacgag gagaggaacg gggccgggga ccgccagggg gagcccgacc 3000
tgcaccggag cgcagggggc ggggccggag caagcccccg cccctcccgc gcccctcccc 3060gcccccgccc tccacctccc ctcccgggac tcacaacccg gc310权利要求
1.鉴定个体中提高的冠心病风险的方法，其中确定样品中Kir6.2蛋白质位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非缬氨酸的其他氨基酸的存在。
2.鉴定个体中提高的冠心病风险的方法，其中确定样品中Kir6.2基因的一个或两个等位基因Kir6.2核苷酸序列上变异的存在，所述变异产生的Kir6.2多肽序列含有Kir6.2蛋白质位置23上非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337上非缬氨酸的其他氨基酸。
3.调适治疗和/或预防冠心病的药物剂量的方法，其中确定个体样品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白质中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因的一个或两个等位基因上核苷酸序列的变异，所述变异产生Kir6.2蛋白质中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
4.选择应答冠心病药物的个体的方法，其中确定个体样品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白质中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因的一个或两个等位基因上核苷酸序列的变异，所述变异产生Kir6.2蛋白质中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
5.Kir6.2蛋白质或核酸在鉴定适用于治疗和/或预防冠心病的药物中的用途。
6.筛选适用于治疗和/或预防冠心病的药物的方法，包括a.提供含有Kir6.2的两个样品；b.将一个样品与潜在的药物接触；c.确定存在或不存在潜在药物时的Kir6.2活性或结构；d.比较存在和不存在潜在药物时的Kir6.2活性或结构。
7.根据权利要求5的用途或根据权利要求6的方法，其使用a)Kir6.2蛋白质，其在Kir6.2蛋白质中含有位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸；b)Kir6.2核酸，其在Kir6.2基因的一个或两个等位基因核苷酸序列中含有变异，所述变异产生Kir6.2蛋白质中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非缬氨酸氨基酸；或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
8.根据权利要求5到8中任一项的方法或用途，其中Kir6.2为分离的Kir6.2蛋白质或蛋白质片段或分离的Kir6.2核酸或核酸片段。
9.根据权利要求8的方法或用途，其中所述蛋白质包含或具有根据SEQ ID No.3、5或7的序列。
10.根据权利要求8的方法或用途，其中所述蛋白质片段包含或具有对应于部分SEQ ID No.3、5或7的序列，所述部分包含氨基酸位置23和/或337。
11.根据权利要求8的方法或用途，其中核酸包含或具有根据SEQ IDNo.4、6或8的序列。
12.根据权利要求8的方法或用途，其中核酸片段包含或具有对应于部分SEQ ID No.4、6或8的序列，如果所述片段来自Kir6.2 cDNA，则所述部分包含位置67和/或1009，如果所述片段来自Kir6.2基因组DNA，则所述部分包含位置5657978和/或5657106。
13.根据权利要求1到12中任一项的方法或用途，其中蛋白质位置23的氨基酸为赖氨酸。
14.根据权利要求1到13中任一项的方法或用途，其中蛋白质位置337的氨基酸为异亮氨酸。
15.根据权利要求2到14中任一项的方法或用途，其中所述核苷酸序列在Kir6.2编码序列位置67带有A。
16.根据权利要求2到15中任一项的方法或用途，其中所述核苷酸序列在Kir6.2编码序列位置1009带有G。
17.根据前述权利要求中任一项的方法或用途，其中个体为糖尿病患者。
18.根据权利要求17的方法或用途，其中糖尿病为糖尿病diabetesmullitus。
19.根据前述权利要求中任一项的方法或用途，其中冠心病为心绞痛。
20.根据前述权利要求1到4或13到19中任一项的方法，其中确定样品中Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II的存在。
21.根据前述权利要求1到19中任一项的方法，其中样品为组织学样品、细胞提取物或组织提取物或细胞。
22.根据权利要求1到4或6到21中任一项的方法，其中样品从人体中分离。
23.根据权利要求1到4或13到22中任一项的方法，其中如下确定氨基酸改变的存在a.制备含有基因组DNA的生物样品；b.优选地从根据a)的样品中分离染色体DNA；c.使用能够扩增多核苷酸片段的引物通过PCR反应扩增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含基因组Kir6.2序列中对应于编码序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的核苷酸位置；d.测序根据c)的多核苷酸片段。
24.根据权利要求23的方法，其中使用至少一种或优选两个根据SEQID No.9到12的引物进行多核苷酸片段的扩增。
25.根据权利要求23或24的方法，其中使用根据SEQ ID No.9到12的引物之一进行测序反应。
26.根据权利要求1到4或13到22中任一项的方法，其中如下确定氨基酸改变的存在a.制备含有基因组DNA的生物样品；b.从根据a)的样品中分离基因组DNA；c.将其固定在载体上；d.用一个或多个探针在严格条件下与固定的DNA杂交，所述探针能够与含有一个或多个核苷酸改变的Kir6.2序列以与野生型Kir6.2序列相比更高的亲和力杂交，所述核苷酸改变引起一个或两个所述氨基酸改变。
27.根据权利要求26的方法，其中分离的基因组DNA被a.固定在芯片基质、合适的膜上或b.转移至凝胶基质上并印迹在合适的膜上。
28.根据权利要求1到4或13到22中任一项的方法，其中如下确定氨基酸改变a.提供来自个体的含有RNA的生物样品；b.优选地，从根据a)的样品中分离RNA；c.使用能够扩增多核苷酸片段的引物通过RT-PCR反应扩增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含Kir6.2 cDNA序列的位置67和/或1009；d.测序根据c)的多核苷酸片段。
29.根据权利要求28的方法，其中使用至少一种根据SEQ ID No.9到12的引物。
30.根据权利要求1到4或13到22中任一项的方法，其中如下确定氨基酸改变a.提供来自个体的含有RNA的生物样品；b.从根据a)的样品中分离RNA；c.将其固定在载体上；d.用一个或多个探针与固定的RNA杂交，所述探针在严格条件下能够与编码在位置23并非谷氨酸和/或在位置337并非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA以与编码在位置23含谷氨酸和/或在位置337含缬氨酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA相比更高的亲和力杂交。
31.根据权利要求30的方法，其中分离的RNA被a.固定在芯片基质或合适的膜上，或b.转移至凝胶基质上并随后印迹在合适的膜上。
32.根据权利要求1到4或13到22中任一项的方法，其中如下确定氨基酸改变a.提供来自个体的含有蛋白质的生物样品；b.从根据a)的样品中分离蛋白质；c.将其固定在载体上；d.使用抗体进行结合反应，所述抗体能够与其多肽链上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比其多肽链上位置337含谷氨酸和/或位置337含缬氨酸的Kir6.2更高的亲和力结合；e.使抗体对蛋白质的结合成像。
33.根据权利要求32的方法，其中分离的蛋白质被a.固定在芯片基质或合适的膜上；b.转移至凝胶基质上并随后固定在合适的膜上，或c.固定在ELISA板上。
34.根据权利要求1到4或13到22中任一项的方法，其中如下确定氨基酸改变a.提供来自个体的组织学样品；b.使用抗体进行结合反应，所述抗体能够与其多肽链上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比其多肽链上位置337含谷氨酸和/或在位置337含缬氨酸的Kir6.2更高的亲和力结合；c.使抗体对蛋白质的结合成像。
35.根据权利要求34的方法，其中通过免疫组织化学或免疫放射反应进行结合检测。
36.检测试剂盒，其用于检测Kir6.2蛋白质、Kir6.2-23-KK、Kir6.2-337-II中位置23非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337非缬氨酸的其他氨基酸的存在，其中所述试剂盒包括至少一种用于检测蛋白质中所述存在的工具。
37.检测试剂盒，其用于检测在一个或两个Kir6.2基因的等位基因上Kir6.2核苷酸序列中变异的存在，所述变异产生含有Kir6.2蛋白质中位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列，其中所述试剂盒包括至少一种用于检测核苷酸序列中所述变异的工具。
38.根据权利要求36或37之一的检测试剂盒，其中位置23的氨基酸为赖氨酸。
39.根据权利要求36到38中任一项的检测试剂盒，其中位置337的氨基酸为异亮氨酸。
40.根据权利要求36、38或39中任一项的检测试剂盒，其含有对位置23含谷氨酸和/或位置337含缬氨酸的Kir6.2与位置23并非谷氨酸和/或位置337并非缬氨酸的其他氨基酸的Kir6.2之间的结合特性有区别的抗体。
41.根据权利要求37到39中任一项的检测试剂盒，其中Kir6.2核苷酸序列在编码序列的位置67带有G。
42.根据权利要求37到39或41中任一项的检测试剂盒，其中Kir6.2核苷酸序列在编码序列的位置1009带有A。
43.根据权利要求37到39、41或42中任一项的检测试剂盒，所述试剂盒含有能够扩增多核苷酸片段的引物集合，所述片段含有Kir6.2编码序列的位置67和/或1009。
44.根据权利要求43的检测试剂盒，所述试剂盒含有至少一种根据SEQ ID No.9到12的引物。
45.根据权利要求37到39或41到43中任一项的检测试剂盒，所述试剂盒含有能够扩增多核苷酸片段的引物集合，所述片段包含根据SEQ IDNo.13的Kir6.2基因组序列的位置5657106/107/108和/或5657978/79/80。
46.根据权利要求45的检测试剂盒，其中所述试剂盒含有至少一种根据SEQ ID No.9到12的引物。
47.根据权利要求37到39、41或42中任一项的检测试剂盒，所述试剂盒含有在严格条件下特异识别Kir6.2基因组DNA或RNA的一种或多种核酸探针，所述Kir6.2基因组DNA或RNA带有编码位置23并非谷氨酸和/或位置337并非缬氨酸的其他氨基酸的核苷酸序列。
48.在多肽序列位置23带有赖氨酸而在位置337带有异亮氨酸的分离的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和337。
49.包含根据SEQ ID No.7的序列或由之组成的分离的Kir 6.2多肽或其片段，所述片段包括氨基酸位置23和/或337。
50.在多肽序列位置23带有谷氨酸而在位置337带有异亮氨酸的分离的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和337。
51.包含根据SEQ ID No.5的序列或由之组成的分离的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括氨基酸位置23和337。
52.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求51到54中任一项的Kir6.2蛋白质或其片段。
53.包括根据SEQ ID No.6或8的序列的分离的多核苷酸或其片段，所述片段包括核苷酸位置67和1009。
54.分离的多核苷酸，其在高严格条件下与根据权利要求54或55的DNA序列或它们的互补链杂交。
55.用于检测Kir6.2基因或RNA内核苷酸变异的探针，所述探针包含Kir6.2序列的至少17个，优选19到100个连续核苷酸或由之组成，所述连续核苷酸属于包括位置67和/或1009的Kir6.2编码序列或属于包括位置5657106/107/108和/或5657978/79/80的根据SEQ ID No.13的基因组Kir6.2序列。
56.用于扩增Kir6.2多核苷酸的引物，其中扩增的多核苷酸包含Kir6.2编码序列的位置67和/或1009和/或根据SEQ ID No.13的基因组Kir6.2序列的位置5657978和/或5657106。
全文摘要
本发明涉及在个体中鉴定提高的冠心病风险的方法，其中在样品中确定Kir6.2蛋白质位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非缬氨酸的其他氨基酸的存在。此外，还要求保护适用于所述方法的探针、引物、多肽或多核苷酸。
文档编号C12Q1/68GK101018873SQ200580030463
公开日2007年8月15日 申请日期2005年8月27日 优先权日2004年9月10日
发明者D·科齐安, H·戈盖莱因, K-E·西格勒, M·雅各布斯, J-F·德勒兹, S·里卡德, S·马赛 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司