专利名称：多态性检测方法
多态性检测方法本发明涉及一种用于一全测特定核酸序列的方法，该方法尤其适用于 鉴定含有多态性或突变的序列，此外，本发明还涉及实施此类分析的试剂盒。越来越多的不同方法能用于检测特定的核酸序列，尤其是用于测定 核酸的精确序列。在这些方法中，很多是基于核酸扩增反应，比如多聚酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)。这些方法用于种类繁多的方法中以检测或诊断例如由于诸如细菌 和病毒等病原导致的疾病。这些方法还尤其适用于存在多态性的遗传分析或诊断，所以多态性尤其是能够导致疾病状态、或者能导致特定疾病 状态倾向(predisposition)的单核苷酸多态性(SNPs )。随着人类基因组测序的完成，以及日益增多的关于特定多态性和特 定疾病或特定疾病倾向之间关系的知识，正在进^亍的以i貪断为目的的分 析数量也日益增加。连接酶链反应是一种特别有用的检测多态性的方法。在该反应中， 将一对互补探针加入到待测试样品中，该对探针在合适模板存在的情况 下能在模板上相互杂交。在此种杂交可发生的条件下，它们进行杂交， 然后在核苷酸存在的情况下，使用连接酶进行连接，该核苷酸通常为三 磷酸腺苷(ATP),但尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)也可以使用。在该过程中，发生了三步连接事件，例如在J.M. Pascal等的文章 [Nature, (2004)432, pp473-478]中有实例说明，在每一个连接事件中，有 一分子的单磷酸腺苷(AMP)作为副产物被释放出来。被连接的探针和原始模板然后充当另 一轮杂交和连接的另外的模 板。这通过以下来实现，首先对混合物加热，使核酸《连发生变性，例如， 加热到8 0 - 9 0 。C的温度，合适的温度为8 5 。C左右；随后，将混合 物冷却到一定温度，例如4 0 - 6 0 。C,典型的温度为5 0 。C左右，此 时探针退火，连接发生。当随后的循环进行时，只有样品中包含合适模 板时才能得到扩增。通过使用4个探针，每一对探针对应于原始双链模板分子的一条 链，可以导致指数扩增的发生。在这种情况下，在起始步骤要对双链 DNA模板进行变性。靠近，但相互之间并不直接毗邻。在这种情况下，还需要在反应混合物 中加入使上游探针延伸通过探针之间小的缺口 (一般为2 - 3碱基对) 所必需的聚合酶、核苷酸和其它试剂，使得在连接之前上游探针(其随 后作为聚合酶延伸反应的引物)能延伸通过该缺口。只有在上游探针的 3'端碱基和模板的相应碱基匹配的情况下，延伸反应才会发生。如果 不匹配，例如因多态性或类似原因所致，随后的连接反应将不会发生。随后，探针连接的产物可以通过根据大小分离产物，例如在电泳凝 胶上，并对凝胶染色以检测它们来进行检测。对应于已连接探针的条带 要比单一的探针大，因此，出现这样的条带就表明连接反应已经发生， 在样品中有合适的模板存在。但是，该分离步骤和检测步骤完成起来比较慢，而且复杂。只有在 试验室条件下才能进行，对操作者的操作技能水平要求高，并且需要好 几个单独的反应阶段。在某些情况下，在反应混合物中可能会加入同双链DNA结合的荧改变。如^扩增反应已经进行，就会通^t染料的萸光信^特性检测出 来。但在这种情况下，需要使用荧光计才能检测到信号，荧光计是一种 相对复杂的仪器。必须为样品提供特定波长的萸光，然后对不同波长的 发射信号进行检测。根据本发明，提供了 一种用于检测样品核酸序列中特定位置上是否 存在多态性的方法，该方法包4舌i) 在基本不含有ATP的反应混合物中，使一对探针与该核酸序列 退火，该对探针被设计为在退火时能相互邻近，并且仅能对一种形式的 序列完全退火；ii) 在NAD和核酸连接酶存在时，将任何完全退火的成对探针连接 起来，该连接酶以NAD为底物；iii) 将连接事件中释放的任何AMP磷酸化成ATP; iv )在得到的反应混合物中4全测ATP。步骤(i)可以釆用此类反应的常规方法进行。至此，如果探针的相 邻末端同模板完全匹配，探针就会以直接相互毗邻的方式结合在模板链 上，导致步骤(11)中连接反应的发生。或者，探针可以结合使得二者之间会有一小的缺口，前提是在该缺 口区域没有腺。票呤碱基。在这种情况下，反应混合物中包含必需的聚合 酶、腺。票呤以外的核苷酸和任何其它试剂，从而只有在探针的3，端能 够和模板的对应碱基完全匹配的情况下，使上游引物延伸填补此缺口 ， 并允许连接发生。如果该碱基不匹配，则探针不能延伸填补缺口，步骤(ii)的连接反应就不会发生。使用这种方法，只有样品中包含有两个探针都能完全结合的序列 时，步骤(11)的连接反应才会发生。在步骤(iv),通过片全测ATP,就可以测定是否有导致此种匹配的 核酸序列存在，该ATP来源于连接反应中所释放的AMP。如果形成检测靶标的核酸序列中发生突变或变化，尤其是在探针相 互毗邻结合的位置出现这种情况时，其中 一个探针的末端不能和靶序列 结合，则步骤(ii)的连接事件就不会发生。结果就没有AMP产生，而 步骤(iii)的磷酸化也不会产生任何ATP。在步骤(iv)的反应混合物 中缺乏ATP则表明，样品中不包含靶核酸，因此可能存在不同的形式。能够以NAD和ATP或者代替ATP作为底物的核酸连4妄酶是已知 的。这种连接酶的一个特殊例子是Eco/z'连纟妄酶。连接反应的副产物AMP可以在步骤(iii)中通过酶促反应直接磷 酸化成ATP，或者通过产生二磷酸腺苷(ADP)的途径而磷酸化成ATP。用于将产生的AMP转化成ATP(上述步骤(iii))的一种或多种酶可 以选自，例如磷酸烯醇式丙酮酸合酶，该酶在-岸酸和磷酸烯醇式丙酮酸 存在时能由AMP直接产生ATP,磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸也要作为试 剂被加入到反应混合物中。另一种选择是，三磷酸核苷-腺苷酸激酶和 NTP的组合会产生二磷酸腺苷(ADP),后者在包含或加入像腺普酸激酶 的酶时会转化为ATP。其它适合的酶的实例包括，比如Eisaki等在Biochem. et Biophys Acta 1431(1999) 363-373中描述的丙酮酸石粦酸二激酶。通过使用NAD替代常规用于LCR的ATP ,可以使用基于ATP检 测的信号系统的可能性增加了 。关于该类型反应的系统已经知道很多种。但是这些反应系统一般能 快速进行，可以《会出，例如清晰的可见的原位信号。因此，可以以均质
的方式对连接反应进行测定，而不需要对连接产物的大小进4于分析。尤其是可以使用生物发光系统对ATP进行检测。使用此类检测系统 的实例，例如在WO 96/02665中有描述。能和存在的ATP反应的特别合适的生物发光试剂包括荧光素和荧 光素酶，在需要的情况下还伴有镁离子源，例如醋酸镁。在ATP存在时， 这些试剂产生发光信号，其可以很容易地被监测到，例如使用常规的发 光检测仪设备。这些操作和应用起来一般要比荧光计更筒单。在产生信号的时候，这些试剂重新产生了 AMP分子，在存在步骤 (in)的酶和/或试剂时，AMP可以重新被转化成ATP。因此信号就以 指数形式积累，可以很容易和快速地被检测到。Sakakibara等在 Analytical Biochemistry, 268, 94-101 (1999)中描述了这种系统的一个实 例。这种信号的指数增长意味着可以直接进行检测，而这种情况在以前 则可能需要扩增反应。生物发光信号系统(signalling system )比荧光系统更敏感。此外，通过使用简单的光检测器例如相机，可以简单和容易地对该 反应进行检测。因此避免了使用复杂设备，例如在广泛应用的荧光信号 系统中用于检测信号所必需的荧光计和类似设备。上面描述的方法可以合适地成为连接酶链反应(LCR)的一部分。这 种扩增反应可以以通常的方式进行，例如通过使用变性和退火/连接温度 使反应混合物循环进行反应。如此以来，可以对上述步骤(i)和(ii) 进行有效重复，直至达到预期的扩增水平。适合地，该反应使用两对探针进行， 一对探针对应于双链模板核酸 序列中的一条链，使得扩增以指数方式进行。在这种情况下，在步骤(i) 之前要对双链模板核酸序列进行变性。在这种情况下，至少上述的步骤(iv),合适的情况下包括步骤(iii) 和(iv)可能需要在反应结束时进行。这就提供了一种较好的终点检测 方法。必要时，磷酸化试剂和生物发光试剂可以存在于或被加入到扩增反 应中，从而可以监测反应的进程。 一般来说， 一些试剂例如萸光素酶的 热稳定性不足以支撑其存在于包含显著热循环的整个扩增过程中，因此 适合于在每个循环的末尾加入，而在下个循环开始之前进4于测定。但 是，选4奪使用热稳定荧光素酶，例如在EP-A-524448、 W095/25798、W099/14336、 WO00/24878、 WO01/31028和WO2003/0068801中所描述 的实例，可以更便利地监测LCR中连续进行的步骤(iv)的某些反应。 特别地，就为了达到预期效果所要求的热循环温度范围而言，如果 LCR中使用的反应条件或试剂能减小或最小化热循环程度的话，这将会 更便利。例如，加入像Betam (N,N,N-三甲基甘氨酸)等试剂或增加像二曱基 亚砜(DMSO)或二曱基甲酰胺(DMF)等溶剂的体积可能会降低所需的 变性温度。加入能使双链体不稳定的酶，例如拓朴异构酶或DNA旋转酶，也 可以有效降低变性温度，达到荧光素酶可以耐受的温度。如果温度降低 到去稳定性酶能完全发挥活性时，这些酶的加入量应足以确保反应的平 衡进行，使得退火和连接都能进行。在另一种替代方式中，可以在基本等温的情况下进行变性，例如对 反应混合物施加电化学电位，从而导致变性步骤的发生。此外， 一种荧光素再循环蛋白可以从氧化荧光素再生出焚光素，例 如在美国专利No. 5814504和WO 03/042693中所描述的蛋白，可以添 加到反应混合物中，以避免需要连续向反应混合物中加入荧光素。通过使用所属领域已知的算法等，这些信息可以被用于对样品中靶 核酸序列的定量。上述反应可以在很多种类的常规设备上进行。这些设备包括，例如 Pyrosequencer测序4义(可以/人5岛士 Pyrosequencing AB公司获《寻)，{亥 仪器已经配备了合适的信号检测手段。或者，反应也可在例如EP-A-0810030中所描述由Perkm-Elmer公司提供的千式加热装置、高速空气 浴热循环仪如 Idaho Technologys 司的 RapidCyclerTM和 LightCyclerTM、以及其它类型的如W098/24548中所描述的热循环^义中 进行。为了确保在检测前样品中没有或至少只有非常低水平的ATP存 在，优选进行预处理步骤以去除ATP。例如，如果使用腺苷三磷酸双磷 酸酶处理包含有核酸的样品以去除ATP,可以进4亍该才喿作，虽然如此才喿 作会导致产生一些AMP,因此优选使用脱氨基酶破坏腺嘌呤残基。无论 如何，在珠子洗涤步骤，应确保核酸和腺苷酸有效分离，因为DNA对 其的结合增强，因此该过程可以在没有该步骤的情况下进行。
该方法可以用于LCR目前适用的任何用途中，包括序列检测如微生物、病毒或其它病原，以及用于疾病诊断。因此合适的情况是，样品 为基因样品。在另一方面，本发明提供了实施上述方法的试剂盒，该试剂盒包括以NAD为底物的核酸连接酶、磷酸化试剂、和一种或多种能产生生物 发光信号的试剂。合适的磷酸化试剂包括，例如上文所述的酶，其中包括磷酸烯醇式 丙酮酸合酶、磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的组合；三磷酸核苦-腺苷酸激 酶、NTP和腺苦酸激酶的组合；或者丙酮酸"奔酸二激酶。能够产生生物发光反应系统的合适试剂包括荧光素酶和/或荧光 素。任选地，该试剂盒也可能包括镁盐，用于激活荧光素酶/荧光素系统， 4旦也可以用于LCR。该试剂盒可能还包括一对探针，该探针适合与靶核酸退火，优选两 对才笨针，每一对可以同目标双《il核酸相对链中的对应区域退火。该试剂盒可能还包括其他适合完成LCR的试剂，例如NAD、緩冲 液(例如250mM EPPS[N画2 -羟乙基)哌,画N-(3-丙石黄酸)或钾盐。此外，该试剂盒也可能包括腺普三磷酸双磷酸酶，或者更合适地， 包括脱氨基酶，用于完成上述的预处理步骤。现在通过所附示意图以实例的方式对本发明进行具体描述，该示意 图对本发明的方法进行了图解说明。在该反应图解中，步骤1到3代表LCR反应中的一个常规循环，唯 一例外的是使用NAD作为连接酶的底物(NH2-Lys-Lig )。在第一阶段， NAD同酶结合，并同AMP (在该阶段不被磷酸化)分离。焦磷酸(Ppi) 在此过程中被释放。在存在模板DNA(l)、能同模板杂交的上游探针 (2 )和下游探针(3 )情况下，该酶将AMP转移到下游探针(3 )的5， 端，后者然后同上游探针(2) 3'末端的游离羟基基团连接，形成连接 物(4 ),并释放游离的AMP (步骤3 )。在该阶段存在或加入磷酸化酶将导致游离AMP向ATP转化，后者 随后可以被步骤4中所描述的常规荧光素酶/荧光素生物发光反应检测 到。该反应体系因此提供了 一种可靠且容易操作的分析方法，尤其适用 于冲全测多态性，例如SNPs,在实施例1中有具体描述。实施例1 A.样品制备该步骤可以在4义器中进行，例如在Thermo Labsystems KingFisher machine上进行。将血样(200jul)加入300jul 3.8M盐酸胍中。在室温下混合1分 钟，使细胞材料裂解，释放出DNA。加入Promega MagneSil KF顺磁颗 粒(20yl)(这些可以存储到包含第一洗涤液的小孔中(见下文)，然 后从那个小孔中转移)，混合2分钟。抽提出的DNA同硅胶颗粒结合。 使用磁力将结合有DNA的颗粒转移到第一个洗涤孔中，其中含有乙醇 和pH7.4TE緩冲液(TE緩冲液为10mM Tris.HCl和lmMEDTA)各500/0 的混合物。将珠子辨。汰，同第一洗涤液混合l分钟。使用相同的洗涤液 再洗涤两次。在第三次洗涤后，将珠子转移到pH8.3的TE緩冲液中， 在〉50。C的温度下混合12小时，此时DNA已孚皮从^圭基质上洗脱下来。 然后去除珠子，在其中一个洗涤孔中进行处理，制备的DNA用于下一 步骤。连接酶链反应(LCR)这一步骤可以在干热循环仪(block thermal cycler)中进行，例如 Perkm Elmer 9600.将DNA同等体积的LCR Assay Mix混合，加入pH7.6的20mM Tris.HCl緩冲液使终体积为50 ju 1,该緩冲液包含100 mM KC1, 100 mM MgCl2， ImMEDTA, 10 mM 二石克苏糖醇，10mMNAD+, 4 ju g/ml鲑鱼 精子DNA， 15单位J1, "，""cm连接酶和浓度分别为5 |u M的两种诊断 用寡核苷酸。反应在下面温度条件下进行94。C一分钟，65。C四分钟， 重复40个循环。对从NAD形成的AMP进行生物发光检测，以显示是 否有LCR发生。所设计的诊断用寡核苷酸的熔解温度比65。C高约2°C。生物发光一全测在室温下，该测定在96孔微滴定板上进行，反应体积为lOOjul, <吏用来自 Thermo Labsystems的Labsystems Luminoskan Ascent plate luminometer。加入的生物发光才企测混合物中包括在90mM Tns.HCl， 10 mM
MgCl2， lmM EDTA, 10 mM 二A乾苏糖醇中的20单位/ml腺苦酸激酶， 5mM乙酰磷酸，2单位/ml乙酸激酶，300 ng/ml焚火虫荧光素酶和lmM D-荧光素，最终pH值为7.9。在诊断用寡核苷酸同目标DNA的互补碱 基发生末端匹配时，发射光就强，例如提示单核苷酸多态性(SNP)阳 性检测结果的地方。
权利要求
1.一种用于检测样品中靶核酸序列内特定位置上是否存在多态性的方法，该方法包括i)在基本不含有ATP的反应混合物中，使一对探针与该核酸序列退火，该探针被设计为在退火时相互邻近，并且仅与一种形式的序列完全退火；ii)在NAD和核酸连接酶存在时，将任何完全退火的成对探针连接起来，该核酸连接酶以NAD为底物；iii)将连接事件中释放的任何AMP磷酸化成ATP；和iv)在得到的反应混合物中检测ATP。
2. 根据权利要求l所述的方法，其中ATP的检测使用生物发光系统。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中生物发光系统是荧光素酶/ 荧光素系统。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中作为预处理步骤， 含有该核酸序列的样品被处理，以去除其中的ATP。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中的样品为基因样品。
6. 根据前述任何权利要求中任一项所述的方法，其中的核酸连接 酶为热稳定连接酶，该方法构成连接酶链反应的 一部分。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用两对探针， 每一对对应于双链輩巴核酸的一条《连。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中成对的探针在靶 核酸《连上退火时直4妾相互毗邻。
9. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中的成对探针发生结 合，使得存在小的缺口，在缺口之间不含有任何腺嘌呤碱基，反应混合 物中还包含聚合酶和核苷酸，该聚合酶和核苷酸适合于使上游探针延伸 通过该缺口前提是上游探针的3，端同靶核酸上对应的碱基匹配。
10. 用于完成前面权利要求中任一项所述方法的试剂盒，该试剂盒 包含使用NAD作底物的核酸连接酶、磷酸化试剂、和一种或多种能够 产生生物发光信号的试剂。
11. 根据权利要求10所述的试剂盒，其中磷酸化试剂为磷酸烯醇 式丙酮酸合酶、磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的组合；三磷酸核苷-腺普酸激酶、NTP和腺苷酸激酶的组合；或者丙酮酸-岸酸二激酶。
12. 根据权利要求10或11所述的试剂盒，其中该一种或多种能 够产生生物发光信号的试剂包括荧光素酶和/或荧光素。
13. 根据权利要求10至12中任一项所述的试剂盒，其中还包括适 合于和靶核酸退火的探针对。
14. 根据权利要求13所述的试剂盒，其中包含两对探针，每一对 能和双4连革巴核酸相对《连上的对应区域退火。
15. 根据权利要求10至14中任一项所述的试剂盒，其中还包含镁扑jhl 。
16. 根据权利要求10至15中任一项所述的试剂盒，其中还包含 NAD、緩冲液或钾盐中的一种或多种。
17. 根据权利要求10至16中任一项所述的试剂盒，其中还包含脱 氨基酶。
全文摘要
一种用于检测样品中核酸序列内某一特定位置是否存在多态性的方法，该方法包括i)在基本不含有ATP的反应混合物中，使一对探针与该核酸序列退火，该对探针被设计为在退火时相互邻近，并且仅同一种形式的序列完全退火；ii)在NAD和核酸连接酶存在时，将任何完全退火的成对探针连接起来，该连接酶以NAD为底物；iii)将连接事件中释放的任何AMP磷酸化成ATP；iv)在得到的反应混合物中检测ATP，特别是使用生物发光反应。对实施该方法的试剂盒也进行了描述，并提出了权利要求。
文档编号C12Q1/68GK101163801SQ200680013089
公开日2008年4月16日 申请日期2006年3月22日 优先权日2005年3月22日
发明者D·J·斯奎雷尔 申请人:恩尼格马诊断有限公司