专利名称：染色体rs1333049多态性位点基因分型引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单核苷酸多态性位点基因分型引物，尤其涉及一种用于染色体rsl333049多态性位点基因分型的引物。
背景技术：
单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism, SNP)是指基因组 DNA 中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化，它与许多疾病直接相关是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。SNP具有数量多、分布广和稳定遗传，是继限制 性片段长度多态性和微卫星多态性这两种遗传标记之后，成为第三代分子标记。通常认为SNP只有两种类型，即等位基因，因此在对已知突变位点检测时只需要对SNP进行两种不同类型碱基的确认分析，而无需对DNA片段全序列测定。据估计，大约有IO5个SNP分子标记将被用于基因功能及与疾病相关性的关联研究，如此庞大的分析工作，对检测技术提出了极高的要求。因此，一种理想的SNP测定方法应该具备如下优点。I)准确——新方法必须经的起标准方法加以验证，而且准确率必须> 99%。2)可靠——此技术稳定，以免重复进行实验使花费上升，耽误结果，浪费宝贵的样品O3)简便一步骤简单，操作时间短，这样可以降低时间及金钱上的花费。4.)经济——时间及金钱上的花费要少越好，例如试剂费，设备需求，使用费等，花费过高就无法测试大量的样品。目前单核苷酸多态性的基因分型有多种方法，如Sanger测序、限制性内切酶法、Taqman探针法、Massarray法,但是这些基因分型方法要么耗时、效率低(限制性内切酶法，每个位点需要1-3元，需要6-12小时)，要么成本高(测序法,每个位点需要24小时，20元)或者需要其他大型设备(如Taqman探针法需要突光定量PCR仪,每个位点需要5_10元，需要2小时)。多态性位点rsl333049位于染色体9p21区域多态性，至2007年Nature、Science杂志报道9p21区域与冠心病发病率相关以来，已有近百个研究显示全世界多民族冠心病、糖尿病、早老性痴呆、脑卒中、主动脉瘤等疾病发病率均与该区域相关。9p21区域的多态性位点以rsl333049位点与疾病相关性研究最多，与疾病相关性也最强；2008年，研究者在韩国和日本人群中对染色体9p21区域的rsl333049位点进行了研究，发现该位点与冠心病显著相关。人群中rsl333049最小等位基因频率为O. 17-0. 5，在中国人群中MAF约O. 478，发明人前期工作也揭示该位点与中国人群急性心肌梗死明确相关。因此，该在普通人群或者病人中分型rsl333049,对评估病人的病情及遗传异质性十分有意义。rsl333049位点无法用内切酶分型，目前研究一般采用的方法是Taqman探针法，该探针可从ABI公司购买，也可由公司合成，基因分型如果采用ABI7900实时定量PCR仪(384孔板)，I个位点需要4-5元。采用其他实时定量PCR仪(96孔板)，I个反应需要7-9元。ABI7900该仪器一般需要15万美元，目前上海市仅有不到10台同类型机器。因此，采用该方法需要研究平台高，且费用高。
发明内容
本发明所要解决的是现有的rS1333049位点基因分型方法成本高的问题。本发明的目的是提供一种染色体rs1333049多态性位点基因分型的引物、包括所述引物的试剂盒、以及进行基因分型的方法。
本发明的第一个方面是提供一种染色体rsl333049多态性位点基因分型引物，其中，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的任意一种或两种序列作为上游引物，以SEQ ID No. 3序列作为下游引物。5’-ATACTAACCATATGATCAACAGTCC-3’ SEQ ID No. I5’-ATACTAACCATATGATCAACAGTCG-3’ SEQ ID No. 2
5’- TTTTCTAGCGCAATACCACA-3’SEQ ID No. 3
本发明的第二个方面是提供一种包括上述引物的染色体rsl333049多态性位点基因分型试剂盒，其中，包括SEQ ID No. I和/或SEQ ID No. 2序列作为上游引物，包括SEQ IDNo. 3序列为下游引物。根据本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，包括SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2序列作为上游引物。本发明所述的任意试剂盒，还可以包括Taq酶。本发明所述的任意试剂盒，还可以包括，MgCl2, dNTP、缓冲液中的任意一种或几种。本发明的第三个目的是提供一种检测染色体rsl333049多态性位点基因分型方法，其中，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的任意一种序列作为上游引物，以SEQ ID No. 3序列作为下游引物，进行PCR反应，然后对PCR产物进行检测(可以是DNA测序、凝胶电泳等检测方法);如果与引物对应PCR有反应产物，就证明该模板含有该等位基因，否则没有该等位基因。其中，SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2序列中3’末端分别为C和G碱基，SEQ IDNo. I、SEQ ID No. 3 的 PCR 产物代表具有 C 等位基因，SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 的 PCR 产物代表具有G等位基因；即
与SEQ ID No. I反应而不与SEQ ID No. 2反应，则该模板基因型为CC型，与SEQ IDNo. 2反应而不与SEQ ID No. I反应，则该模板基因型为GG型，同时与引物I、引物2反应，则为GC或CG型。经过试验证实，本发明提供的引物，能够准确分型染色体rsl333049多态性位点，特异性高，假阳性率低于1% ;而且需要条件简单，普通PCR仪和普通PCR试剂即能用于基因分型(一个位点分型仅需要O. 5元);此外检测方法简单、所需时间短，PCR反应后直接电泳，基因分型仅需要3小时。
图I为采用本发明所述引物进行PCR反应，不同基因型PCR产物电泳结果；
图2为66条DNA的PCR扩展产物电泳结果；图3为66条DNA的PCR扩展产物Sanger测序结果。
具体实施例方式等位基因特异PCR (allele specific PCR，AS-PCR)成本低，仅需要三条PCR引物和普通PCR仪，直接PCR+电泳即能完成分型，每个位点分型仅需要O. 5元。等位基因特异PCR原理PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置。如果这个碱基与模板互补，则引物能从不间断延伸，PCR可以正常进行，得到特定长度扩增带。反之，亦然。所以只要将突变与正常等位基因所不 同的那个碱基安排在3’最末端，当用某一含突变序列的引物进行PCR时，如果得到特异扩增带，表明被测基因含有该种突变。没有特异扩增带出现，则表示没有这种突变。该方法中需要严格设计引物，以达到引物和模板的正确配对。否则引物和其它基因型模板发生非特异性结合，发生非特异PCR，进而不能有效进行基因分型或者基因分型假阳性率高，因此限制了该方法应用。申请人:在提供了一对高特异性等位基因特异PCR引物，该引物能有效对人染色体多态性位点rsl333049分型。该引物不仅特异性高，假阳性率低于(1%)，而且需要条件简单，普通PCR仪和普通PCR试剂即能用于基因分型(一个位点分型仅需要O. 5元)，此外方法简单，PCR电泳后直接电泳，基因分型仅需要3小时。引物扩增片段287bp，全部序列信息如下
ATACTAACCATATGATCAACAGTTGAAAAGCAGCCACTCGCAGAGGTAAGCAAGATATATGGTAAATACTGT
GTTGACAAAAGTATGCAGAAGCAGTCACATTTATACAGTAGTGAAGGAAATGTAAATTGGACAAACTTTTTGGAAGA
TAAGTTGAGAATGTCAAAAATCAAAACACACTTTCTGTTTTATTCAGCAATTATGAGCCCTTTGTTTTACAGCTATG
CTCACAAATATATACAAACATGTATGCACAATTATGTTCACTGTGGTATTGCGCTAGAAAA
下面通过具体实施例对本发明所述基因分析引物、试剂盒以及基因分型PCR检测方法，进行详细的介绍和描述，以使更好的理解本发明内容，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。实施例I 弓I物I:
上游引物5’-ATACTAACCATATGATCAACAGTCC-3’ SEQ ID No. I 下游引物5’_ TTTTCTAGCGCAATACCACA-3’SEQ ID No. 3
PCR反应体系
H2O10. 5 μ I
Buffer2 μ I
MgCl2I. 5μ I
dNTP2 μ I
上游引物Ιμ I
下游引物Ιμ
DNA 模板I μ I I
Taq 酶I μ I
总体积20 μ I
PCR反应条件95°C，3min- (95°C,30s-60°C,30s-72°C,30s) 35 次循环。结果分析
PCR产物电泳以I. 2%琼脂糖电泳，引物I与引物2产物分开点胶电泳，紫外灯下拍照。不同基因型PCR电泳结果见图I。实施例2 引物2
上游引物5’-ATACTAACCATATGATCAACAGTCG-3’ SEQ ID No. 2 下游引物5’_ TTTTCTAGCGCAATACCACA-3’SEQ ID No. 3
PCR反应体系
H2O10. 5 μ I
Buffer2 μ I
MgCl2I. 5μ I
dNTP2 μ I
上游引物Ιμ I
下游引物Ιμ
DNA 模板I μ I I
Taq 酶I μ I
总体积20 μ I
PCR反应条件
95°C，3min- (95°C, 30s-60°C,30s-72°C,30s) 35 次循环。结果分析
PCR产物电泳以I. 2%琼脂糖电泳，引物I与引物2产物分开点胶电泳，紫外灯下拍照。不同基因型PCR电泳结果见图I。图I中给出了三种不同DNA模板，与引物I和引物2进行PCR反应的结果，其中，电泳结果中，最左侧的DNA样品检测到与引物I的PCR反应产物、而无与引物2的PCR反应产物，因此，为CC型样本；而最右侧的DNA样品检测到与引物2的PCR反应产物、而无与引物I的PCR反应产物，因此，为GG型样本；中间的DNA样品与引物I和引物2均有反应产物，因此为GC型样本。通过Sanger测序,证实了上述检测结果是正确的，Sanger测序结果如图3所示。实施例3
随机选取(不同浓度和不同纯度的)66个DNA标本，分别以上述PCR反应条件、与引物I和引物2进行扩增反应，先将引物I的PCR产物电泳30分钟，随后将对应模板引物2的PCR产物在相同泳道电泳30分钟，结果显示扩增效果及特异性极高。根据电泳结果、以及上述判断方法，可以很容易判断每个标本的基因型，如图2所示(图中，Γ66为样品编号，引物I和引物2箭头所指的条带分别为引物I的PCR产物和引物2的PCR产物)，样品I为CC型；样品2为GC型；样品3为GC型；样品4为GG型；样品5为GC型......。 通过Sanger测序，证实了上述检测方法是正确的，并且特异性高，没有出现假阳性检测结果。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内
权利要求
1.一种染色体rsl333049多态性位点基因分型引物，其特征在于，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的任意一种或两种序列作为上游引物，以SEQ ID No. 3序列作为下游引物。
2.一种包括权利要求I所述引物的染色体rsl333049多态性位点基因分型试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID No. I和/或SEQ ID No. 2序列作为上游引物，包括SEQ ID No. 3序列为下游引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括SEQID No. I和SEQ ID No. 2序列作为上游引物。
4.一种检测染色体rsl333049多态性位点基因分型方法，其特征在于，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的任意一种序列作为上游引物，以SEQ ID No. 3序列作为下游引物，进行PCR反应，然后对PCR产物进行检测，如果与引物对应PCR有反应产物，就证明该模板含有该等位基因，否则没有该等位基因； 其中，SEQ ID No. I、SEQ ID No. 3的PCR产物代表具有C等位基因，SEQ ID No. 2、SEQID No. 3的PCR产物代表具有G等位基因。
全文摘要
本发明提供了一对高特异性等位基因特异PCR引物，该引物能有效对人染色体多态性位点rs1333049分型。该引物不仅特异性高，假阳性率低于(1%)，而且需要条件简单，普通PCR仪和普通PCR试剂即能用于基因分型(一个位点分型仅需要0.5元)，此外方法简单，PCR电泳后直接电泳，基因分型仅需要3小时。
文档编号C12Q1/68GK102643911SQ201210104418
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者庄剑辉, 彭文辉, 徐亚伟, 李海玲 申请人:上海市第十人民医院