一种用ApoI检测人胃癌易感基因IL17A rs3748067多态性的方法
【技术领域】
[000。 本发明属于生物技术领域，设及一种用Apo I检测人胃癌易感基因ILl 7A rs3748067多态性的方法。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸多态性（single nucleotide polymor曲ism,SNP)，主要是指在基因组水 平上由单个核巧酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一 种。占所有已知多态性的90% W上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基 对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。CAPs ( C1 eaved ampl if i cat ion POlymo;rphism sequence-tagged sites)CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态 性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再 用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制 性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量 和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。运种方法与RFLP相比，不同的是W扩增替代了 酶切，避免了 RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。
[0003] 全世界范围内，胃癌仍然是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。胃癌的发生是 一个多步骤，多因素，多阶段，多种机制共同作用的结果，包括基因因素，生物因素W及多种 环境危险因素。尽管近年来胃癌的死亡率已有显著的下降，但胃癌的五年生存率依旧很低。 炎症反应与肿瘤关系的研究一直是相关学者关注的热点，大量研究结果表明胃部幽口螺杆 菌感染与胃慢性炎症关系密切。幽口螺杆菌感染与免疫系统的细胞因子尤其是白介素家族 显著相关。越来越多的研究在胃癌组织W及幽口螺杆菌感染相关胃炎组织中发现多种炎性 细胞因子，如IL17AJL23R等的表达量显著升高。因此，研究胃癌基因遗传多样性很有必要。 作为一类重要的细胞因子，IL17家族基因可参与广泛的生理过程，其中一个重要的角色是 调节急性W及慢性炎症性疾病。IL17家族在幽口螺杆菌定植所引起的免疫反应中发挥重要 作用，同时也发挥着非常强的募集中屯、粒细胞的作用，参与多种慢性炎症疾病，是导致胃粘 膜萎缩等癌前病变的重要原因。许多研究发现IL17基因家族的基因多态性与胃癌易感性相 关。近年来IL17A在肿瘤领域的研究取得了较大进展，但其在胃癌领域的研究开展相对较 少，因此将一定功能相关的IL17A位点多态性与胃癌结合起来可W更好的探讨其对胃癌形 成过程的作用，掲示其与胃癌发生的关联性进而探讨其中的具体分子机制。
[0004] 序列特异性引物PCR也称等位基因特异性PCR(AS-PCR)，它的原理是基于Taq DNA 多聚酶不能修复DNA引物在y末端的单个碱基错配。所W，当引物的y端核巧酸与等位基因 变异部位序列互补，则模板被扩增。但是，当引物y端核巧酸与模板错配，则模板不会被扩 增或扩增效率极低。每个等位基因的检测，需设计两套引物，一套为等位基因特异性引物， 一套为普通引物。PCR产物凝胶电泳W后，DNA的存在与否通过紫外线透射来检测，DNA条带 的存在或缺失即可确定基因型。在同一反应中的另一对引物(通常扩增人生长激素基因的 一段)总会产生一个DM片断，与HPA基因型无关，作为PCR有效性的控制。
[000引基因特异性PCR(AS-PCR)的缺点是扩增效率较低，扩增特异性差，因此PCR产物的 特异性与稳定性无法保障，同时，分型结果也较容易误判，稳定性较差。
[0006] 化qMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的巧光 探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5/端标记有巧光 报告基团（Repoder，R)，如FAM、VIC等，3'端标记有巧光泽灭基团（Quencher，Q)，如TAMRA 等。当探针完整的时候，5/端报告基团经仪器光源激发的巧光正好被近距离的3/端巧光基 团泽灭，仪器检测不到5/端报告基团所激发的巧光信号（就是说5'巧光基团的发射波长正 好是3'巧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3'巧光基团而发出其它巧光）。随着 PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5/ -3/外切酶活性(此活性是 双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5/端报告基团游离于反应 体系中，远离3/端巧光泽灭基团的屏蔽，5/端报告基团受激发所发射的巧光信号就可W被 探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个巧光分子形成，实现了巧光信号的累积 与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
[0007] Taqman巧光探针法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高，难W在实验室中普 及使用。
[000引染料法基因定性分析化RM)的主要原理是根据DNA序列的长度、GC含量W及碱基互 补性差异，应用高分辨率的烙解曲线对样品进行分析，其极高的溫度均一性和溫度分辨率 使分辨精度可W达到对单个碱基差异的区分。
[0009] 染料法基因定性分析方法的缺点在于由于染料法特异性不强，只要是双链的DNA 都会结合发光，因此，特异性较差。
【发明内容】
[0010] 为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种用ApoI检测人胃癌易感基因 IL17A rs3748067多态性的方法，该方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段，然后 将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶 切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱(res化iction map)分析此段序列的特异切位点，藉 由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。简而言之，就是先PCR扩增相应目的片 断，而后进行限制性内切酶切反应，电泳后观察比较限制性图谱来分析序列之间的差异。此 方法重复性好，操作较简单，成本低，酶切结果容易辨识。因此，本发明的目的是提供一种操 作简单、成本低、适用范围广泛的检测人胃癌易感基因IL17A多态性rs3748067的方法及检 测试剂盒。
[0011] 其技术方案如下：
[001^ -种用ApoI检测人胃癌易感基因IL17A rs3748067多态性的方法，包括W下步骤：
[0013] (a)抽提样品的基因组DNA;
[0014] (b)提供扩增人IL17A基因多态性rs3748067位点附近序列的正向引物和反向引 物，rs3748067上游引物：5 ' -AGGATGGAGTGAAGAGGAA-3 '，rs3748067下游引物：5 ' -AGAGATCAACAGACCAACAT-3 '，W步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取 扩增产物；
[0015] (C)使用限制性内切酶对步骤(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产 物；
[0016] (d)将酶切产物采用3 %的琼脂糖凝胶进行电泳，W判定IL17A基因多态性 rs3748067的各基因型。其中，经电泳后有一条条带者为GG基因型，两条条带者为AG基因型， S条条带者为AA基因型。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[001引本发明提供了一种操作简单、成本低、适用范围广泛的检测人胃癌易感基因IL17A 多态性rs3748067的方法。本课题组前期研究发现rs3748067带有A等位基因（尤其是AG基因 型）的个体胃癌的发病风险显著低于带有GG基因型个体。在此背景下提供此方便、快捷的检 测人胃癌易感基因IL17A多态性rs3748067的方法有望预测胃癌的易感性，可用于临床的早 期诊断。
【附图说明】
[0019] 图1是L17A rs3748067位点的电泳图谱；
[0020] 图2是IL17A rs3748067位点GG基因型测序图谱(反向测序）；
[0021] 图3是IL17A rs3748067位点AA基因型测序图谱(反向测序）；
[0022] 图4是IL