专利名称：一种基于单壁碳纳米管的超灵敏dna生物传感器及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物电化学传感器及其制备领域，特别涉及一种脱氧核糖核酸(DNA) 电化学传感器及其制备方法和检测应用。
背景技术：
基因诊断是通过直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病做出诊断的方法。基因诊断的探测目的物是脱氧核糖核酸或核糖核酸(RNA)。在基因诊断的方法学方面，先后建立了限制性内切酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析、聚合酶链式反应 (PCR)，以及近年来发展起来的DNA传感器及DNA芯片技术等。标记法核酸杂交检测技术现已广泛又能够用于生物学、医学和环境科学等有关领域，但其检验过程费时、费力，并且传统的放射性同位素标记安全性差，难以满足各方面的需要，发展新型分子杂交快速检测技术已经迫在眉睫。DNA传感器为核酸杂交快速检测提供了一个新途径，它是以杂交过程的特异性为基础的快速传感检测技术。自人类基因组破解以来，DNA传感器领域的发展日新月异，目前已取得相当大的进展。生物科学、计算机科学、科学、微电子等各学科中多种理论和技术在该领域得到广泛应用。DNA传感器及DNA芯片应用于DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断以及几乎所有应用核酸杂交的领域。在众多DNA传感器检测方法中，基于分子电学性质的电化学技术具有独特的优越性。电化学检测技术灵敏、快速、成本非常低廉，而且检测装置轻便、低能耗且易于微型化和集成化，符合手持式检测装置以及未来的芯片实验室(lab-on-a-chip)的要求。而且电化学基因传感技术通常具有以下特点杂交反应在其表面上直接完成，并且转换器能够将杂交过程所产生的变化转变成电信号根据杂交前后电信号变化量，从而推断出被检DNA的量；具有准确、快速和廉价等优越性；更重要的是，其能被推广应用到所有和DNA 序列信息相关的领域中。目前，有关纳米材料的合成和应用方面的研究发展迅速。纳米材料的引入使得DNA 传感器对杂交检测的灵敏度和选择性都大为提高。碳纳米管(CNTs)是一种应用广泛的生物传感基底材料，而金纳米粒子是一种应用广泛的抗原、抗体和细胞标记物，美国西北大学纳米技术研究所Mirkin教授领导的研究组(Science，1997，277，1078)在利用寡核苷酸修饰的金纳米粒子进行DNA碱基识别方面进行了开创性研究。通过杂交前后体系颜色的变化来实现对DNA的检测具有仪器简单、实验方便等特点。但由于视觉辨别的局限性，使得色差识别的灵敏度较低，所以这种方法具有一定的局限性。之后，该课题组又发展了一种称为 bio-bar-code 的放大方法(Science, 2003, 301, 1884)，该方法采用 DNA-AuNP 纳米颗粒作为信号探针，同时采用磁性颗粒来连接捕获探针，从混合介质中特异性的捕获到靶向序列，通过DNA杂交DNA-AuNP纳米颗粒形成三明治夹心结构，然后将纳米Au颗粒表面的DNA 分离下来检测。这种方法非常灵敏，但需将DNA分离后才能检测，增加了检测的步骤。为克服上述缺陷，上海应用物理研究所樊春海教授课题组(CN 101245387A)将酶促反应和纳米金放大效应结合起来，用以检测DNA，结果发现不仅无需将DNA从纳米金表面分离下来检测，而且保持了较好的灵敏度(最低检测限为PM级)和选择性。然而遗憾的是该方法需引入特定的底物，经酶催化反应后需产生荧光或有颜色，增加其成本，且一定程度上限制了其应用范围。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种灵敏度和特异性更高且检测方便、检测成本低的一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器。本发明的另一个目的提供一种上述基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的制备方法。另外，本发明还提供一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的应用，即一种DNA的检测方法。为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是包括有金纳米粒子和作为电极基底的单壁碳纳米管，所述的金纳米粒子沉积于单壁碳纳米管上构成单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极，该单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极上组装有作为探针的巯基修饰的 ssDNAo进一步设置是所述的单壁碳纳米管为在硅片上通过化学气相沉积法现场水平生长而成。进一步设置是所述单壁碳纳米管为水平平行排列的阵列结构，阵列密度控制在每 100 μ m区间约有4-50根单壁碳纳米管，每根单壁碳纳米管的长度位于100 μ m-2 mm。进一步设置是所述的金纳米粒子形貌可为带有多级结构的金枝晶。上述基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的制备方法，包括以下步骤
(1)单壁碳纳米管的生长，在硅片上通过化学气相沉积生长单壁碳纳米管；
(2)用电化学方法在生长的SWCNTs上可控沉积金纳米粒子，制备单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；
(3)电极表面探针DNA的自组装，将巯基(SH-)修饰的探针ssDNA与制备好的 SffCNTs-Au电极进行自组装，获得基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器。进一步设置是所述的步骤(1)为利用快速升温法，用i^e/Mo作催化剂，用乙醇作碳源生长单壁碳纳米管。进一步设置是所述的步骤(2)采用两电极体系，用钼丝作对电极，采用计时电流法，电压为-0. IV—0. 5v，沉积时间为5-50S，浓度为0. 1 - 10 mM的HAuCl4为金源，沉积金纳米粒子。本设置的进一步设置是所述步骤(2)的工艺参数为电压为-0. 5v，沉积时间为 8-15s。进一步设置是步骤(3)的自组装条件包括将电极浸泡在含l-μΜ的巯基(SH-)修饰的探针ssDNA的1Tris-HCl缓冲溶液中，并置于1_10°C下约2_10 h。本发明还提供了一种利用基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的DNA检测方法，其技术方案包括有以下工序
(1)杂交，将基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器将置于待检测的DNA溶液中， 在35°C _45°C杂交2h，然后清洗掉非特异性吸附到单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极表面未杂交的DNA ；
(2)用电化学检测法在电解液检测通过步骤(1)杂交前后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极表面的电化学参数的变化，定量或/和定性检测待检测DNA的浓度。进一步设置是所述的步骤(2)的电化学检测法采用电化学阻抗法，频率为100 mHz-10kHz,电压为 0. 17 V。本发明中所说的组装了巯基修饰的ssDNA的SWCNTs-Au电极是利用金纳米粒子与带巯基功能团的DNA相互作用而形成。其中SWCNTs为单壁碳纳米管的英文标识，SffCNTs-Au 为单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极的英文简写。本发明中互补的DNA (探针DNA或待检测DNA，也称目标DNA)的巯基修饰可采用任何现有技术或商业途径获得。而本发明制备方法步骤④中的电解液可为常用的电解液，如ImM [Fe (CN) 4]〃4_ ；而所用的电化学检测方法可为现有常规的电化学检测方法，如电化学阻抗或脉冲伏安法，本发明优选阻抗的方法，可定量检测电极表面的电子传递电阻。本发明利用金与修饰有巯基基团的DNA间的相互作用，将探针DNA固定在 SffCNTs-Au电极表面，通过DNA分子的杂交，捕获与探针DNA匹配序列的DNA。由于碳纳米管具有较好的电容性和比表面积，以及电极表面碳管的密度可以控制金纳米粒子的密度， 进而可控制自组装的DNA和杂交的DNA数量，有效防止DNA链之间的缠绕和信号传导的干扰。由于金纳米粒子的放大作用，此传感器在靶序列浓度极低时也有明显的信号。综合各方面的优势，本发明的DNA传感器对目标匹配DNA的检测限可达到10_2(iM，并具有很强的区分单碱基错配的能力，对单碱基错配DNA的检测限可达到0. IpM0同时本发明的ssDNA功能化SWCNTs-Au修饰电极具有可重复使用的优点。下面结合说明书附图和具体实施方式
对本发明做进一步介绍。
图1本发明的电化学DNA杂交传感器的制备与测量原理示意图； 图2是本发明一实施例中SWCNTs-Au电极的扫描电子显微镜(SEM)图加为SWCNTs的SEM图；图2b为在SWCNTs上沉积纳米金后得到的SWCNTs-Au的SEM 图；图2c为SWCNTs-Au局部放大图3 (A)是本发明传感器检测不同浓度完全匹配ssDNA的电化学阻抗图；曲线a为 SWCNTs-Au在含1 mM Pe (CN)4]和0. 1 M KCl的Tris-HCl缓冲液中的电化学阻抗线；b 线为自组装ssDNA后SffCNTs-Au电极在在含1 mM [Fe (CN) 4]讀-和0. 1 M KCl的Tris-HCl 缓冲液中的阻抗线，曲线c-m分别为与含有0.01 aM、0. 05 aM、0. 09 aM、0. 13 aM、0. 17 aM、l. 17 aM ,11. 2 aM、l fM、l pM、l nM 和 0. μΜ 匹配 DNA 杂交后，上述传感器在含 1 mM [Fe (CN)4]3+和0.1 M KCl的Tris-HCl缓冲液中的电化学阻抗线。图3 (A)中的插图为该传感器工作的模拟电路图3 (B)是ssDNA功能化的SWCNTs-Au电极与不同浓度目标DNA杂交前后的电子传递电阻变化值与目标DNA浓度的关系，图3 (B)中的插图为该传感器的电子传递电阻改变值与目标DNA分子数的关系曲线；
图4 (A)是采用本发明的DNA电化学传感器实施的单碱基错配检测。a线是ssDNA(10个碱基)功能化的SffCNTs-Au电极在含1 mM Pe (CN) 4] “4—禾口 0. 1 M KCl的Tris-HCl缓冲液中的电子传递电阻；b线是上述传感器与0. 1 pM三个碱基错配的目标DNA杂交后的电子传递电阻；c线是上述传感器与0. 1 pM单碱基错配的目标DNA杂交后的电子传递电阻；d线是上述传感器与0.1 pM完全匹配的目标DNA杂交后的电子传递电阻，图4(B)是采用本发明的DNA电化学传感器实施的分别与不同浓度的单碱基错配的DNA杂交后，电子传递电阻的变化值与单碱基错配DNA的浓度之间的线性关系图5是本发明中所用的电化学传感电极与完全匹配的0. OlaM DNA杂交后的电子传递电阻与再生次数的关系曲线。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。较佳实施例
本发明制备方法包括下列步骤
(1)SffCNTs的生长
利用快速升温法，用Fe/Mo作催化剂，用乙醇作碳源生长SWCNTs ；
(2)SffCNTs-Au电极制备采用两电极体系，用钼丝作对电极，SWCNTs为工作电极，电压为-0. 5v，沉积时间为10s，HAuCl4为金源沉积金纳米粒子，然后用MilliQ清洗。(3)电极表面探针DNA的组装(1)杂交将步骤(3)中制得的电极置于匹配的DNA 溶液中，在42°C杂交池，然后用MilliQ清洗。清洗掉非特异性吸附到电极表面未杂交的匹配 DNA。(2)电化学检测在1 mM [Fe(CN)4]"4.(含0. IM KCl)中用电化学阻抗法检测组装前后和杂交前后电极表面上的电子传递电阻，定量检测匹配DNA的浓度。下面通过下述几个实施例和实验数据，进一步阐述本发明的区分单碱基错配的能力和高灵敏性。实施例1
(1) SffCNTs-Au电极的制备
如图1所示采用化学气相沉积(CVD)法，首先用加热炉对石英管快速升温到ΙΟΟΟ ， 然后通入乙醇/氦气混合气，用 ^/Μο纳米粒子作催化剂，高温还原反应15 min，在硅基现场生长获得单壁碳纳米管阵列。然后将电极用铜丝连接作为工作电极，IOml (ImM)的 HAuCl4为金源，以Pt丝作为对电极，采用恒电位的方法，并调节电压为-0. 5V，用两电极体系沉积IOs后，关闭电源，用MilliQ水淋洗，用洗耳球吹干电极表面得到SWCNTs-Au电极。(2)传感电极的制备及杂交本实施例中选用的DNA序列如下 探针 ssDNA :5，-SH-CCC CAT CCC C-3， 完全匹配 DNA :5，-GGG GAT GGG G-3，
将(1)中得到的SWCNTs-Au电极浸泡在大约Iml的1 μ M的ssDNA溶液中，在4°C的条件下自组装10h。取出用MilliQ水多次冲洗电极表面，吹干后用阻抗表征；
将所得的传感电极放入浓度为0. 1 μΜ的匹配DNA溶液中，在4 5 °C下杂交池形成SWCNTs-Au-dsDNA，取出用MilliQ水和Tris-HCl缓冲溶液反复冲洗电极表面，洗去非特异性吸附在电极表面未杂交的DNA。(3)记录电化学阻抗曲线(EIS)把制作好的电极浸入溶液为ImM[Fe(CN)4]3* (含 0. 1MKC1)的电解液中，然后进行电化学阻抗实验，得EIS曲线，电路拟合后记录传感电极的电子传递电阻(如图2A中曲线m)。实施例2
按实施例1中的方法获得传感电极放入浓度0. μΜ的匹配DNA溶液中，在45°C下杂交 IOh形成SWCNTs-Au-dsDNA，取出用MilliQ水和1Tris-HCl缓冲溶液反复冲洗电极表面，洗去非特异性吸附在电极表面未杂交的DNA。按实施例1中的方法记录电化学阻抗曲线，结果与实施例1 一致。实施例3
按实施例1中的方法获得传感电极，放入浓度为InM的匹配DNA溶液中，在45°C下杂交 2h形成SWCNTs-Au-dsDNA，取出用MilliQ水和Tris-HCl缓冲溶液反复冲洗电极表面，洗去非特异性吸附在电极表面未杂交的DNA。按实施例1中的方法记录电化学阻抗曲线(如图 2A中曲线1)。实施例4
按实施例1中的方法获得传感电极，放入浓度为IpM的匹配DNA溶液中，在45°C下杂交 2h形成SWCOTs-Au-dsDNA，取出用MilliQ水和Tris-HCl缓冲溶液反复冲洗电极表面，洗去非特异性吸附在电极表面未杂交的DNA。按实施例1中的方法记录电化学阻抗曲线(如图 2A中曲线k)。实施例5
按实施例1中的方法获得传感电极，放入浓度为IfM的匹配DNA溶液中，在45°C下杂交 2h形成SWCOTs-Au-dsDNA，取出用MilliQ水和Tris-HCl缓冲溶液反复冲洗电极表面，洗去非特异性吸附在电极表面未杂交的DNA。按实施例1中的方法记录电化学阻抗曲线(如图 2A中曲线j)。实施例6
按实施例1中的方法获得传感电极，放入浓度为1. 17aM的匹配DNA溶液中，在45°C下杂交形成SWCNTs-Au-dsDNA，取出用MiIliQ水和1Tris-HCl缓冲溶液反复冲洗电极表面， 洗去非特异性吸附在电极表面未杂交的DNA。按实施例1中的方法记录电化学阻抗曲线(如图2A中曲线h)。实施例7
按实施例1中的方法获得传感电极，放入浓度为0. 13aM的匹配DNA溶液中，在45°C下杂交形成SWCNTs-Au-dsDNA，取出用MiIliQ水和1Tris-HCl缓冲溶液反复冲洗电极表面， 洗去非特异性吸附在电极表面未杂交的DNA。按实施例1中的方法记录电化学阻抗曲线(如图2A中曲线f)。实施例7
按实施例1中的方法获得传感电极，放入浓度为0. OlaM的匹配DNA溶液中，在45°C下杂交形成SWCNTs-Au-dsDNA，取出用MiIliQ水和1Tris-HCl缓冲溶液反复冲洗电极表面， 洗去非特异性吸附在电极表面未杂交的DNA。按实施例1中的方法记录电化学阻抗曲线(如图2A中曲线C)。综上实施例获得的结果(图2)可知一、探针DNA在SWCNTs-Au上得到了有效的固定；二、探针的传感电极与target DNA的杂交反应能够使EIS得电阻发生显著的变化。 因而该生物传感电极可定性的判断样品溶液中有无目标DNA序列。用此方法可测定10个碱基序列的下限浓度为0. OlaM。实施例8
用应用实施例1中的方法，在target DNA上存在3个碱基错配和1个碱基错配的序列做为目标DNA，最低浓度都设在0. IpM0结果如图5所示，在0. IpM时3个碱基错配与单链传感器没有明显变化，与错配1个碱基的目的序列杂交后所得的电阻与单链传感器有些许增加，而与taget DNA却有显著的电阻差别。可见，本发明的传感器具有很强的检测单碱基错配的能力，序列特异性很高。本实施例中所采用的DNA序列为 1- Mismatched: 5’ -GGG GTT GGG G-3’ 3-Mismatched: 5，-GGG GCC CGG G_3， 实施例9
将实施例1中步骤(2)中的与0. 1 μ M的target DNA杂交后的传感电极在热水中变性 1 Omin中后，迅速用冰的Mi 11 iQ水冲洗，再于热水中变性1 Omin后，再迅速用冰的Mi 11 iQ水冲洗吹干后，重复杂交，变性4个循环。探针组装量与杂交效率基本保持不变，结果如图5 所示，可见通过数个循环的高温变性过程，再生电极的捕获性能基本保持不变。
权利要求
1.一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器，其特征在于包括有金纳米粒子和作为电极基底的单壁碳纳米管，所述的金纳米粒子沉积于单壁碳纳米管上构成单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极，该单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极上组装有作为探针的巯基修饰的ssDNA。
2.根据权利要求1所述的一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器，其特征在于所述的单壁碳纳米管为在硅片、石英玻璃或蓝宝石中的一种作为基底，并通过化学气相沉积法现场水平生长而成。
3.根据权利要求2所述的一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器，其特征在于所述单壁碳纳米管为水平平行排列的阵列结构，阵列密度控制在每100 μ m区间约有 4-50根单壁碳纳米管，每根单壁碳纳米管的长度位于100 μπι -2 mm。
4.根据权利要求1所述的一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器，其特征在于所述的金纳米粒子形貌可为带有多级结构的金枝晶。
5.一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤单壁碳纳米管的生长，在硅片上通过化学气相沉积生长单壁碳纳米管；用电化学方法在生长的SWCNTs上可控沉积金纳米粒子，制备单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；电极表面探针DNA的自组装，将巯基(SH-)修饰的探针ssDNA与制备好的SWCNTs-Au电极进行自组装，获得基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器。
6.根据权利要求5所述的一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)采用i^e/Mo作催化剂，用乙醇作碳源生长单壁碳纳米管。
7.根据权利要求5所述的一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)采用两电极体系，用钼丝作对电极，采用计时电流法，电压为-0. IV - -0. 5v，沉积时间为5-50s，浓度为0. 1-10 mmol/L的HAuCl4为金源，沉积金纳米粒子。
8.根据权利要求5所述的一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的制备方法，其特征在于步骤(3)的自组装条件包括将电极浸泡在含广10 ymol/L的巯基(SH-)修饰的探针ssDNA的IYis-HCl缓冲溶液中，并置于1_10°C下约2_10 h。
9.一种利用权利要求1所述的基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器的DNA检测方法，其特征在于包括有以下工序杂交，将基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器将置于待检测的DNA溶液中，在35°C-45°C杂交2-10 h，然后清洗掉非特异性吸附到单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极表面未杂交的DNA ；用电化学检测法在电解液中检测通过步骤(1)杂交前后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极表面的电化学参数的变化，定量或/ 和定性检测待检测DNA的浓度。
10.根据权利要求9所述的一种利用权利要求1所述的基于单壁碳纳米管的超灵敏 DNA生物传感器的DNA检测方法，其特征在于所述的步骤(2)的电化学检测法采用电化学阻抗法，频率为100 mHz-10kHz,电压为0. 17 V。
全文摘要
本发明提供了一种基于单壁碳纳米管的超灵敏DNA生物传感器及制备方法和应用，本发明首先利用化学气相沉积法在硅片表面现场生长单壁碳纳米管(SWCNTs)，然后采用电化学沉积技术，实现碳纳米管电极表面沉积金纳米粒子。将单链DNA(ssDNA)探针自组装到SWCNTs-Au电极表面，并与互补的ssDNA进行杂交反应。利用碳纳米管独特的比表面积和电极快速动力学特性，以及纳米金的电流信号放大作用，运用电化学阻抗法记录该传感器在杂交前后电子传递电阻的变化，实现定量检测互补DNA。该传感器对目标DNA的检测限可达10-20M，具有高灵敏度、强选择性和可重复使用等优点，在医疗诊断、食品工业和环境保护等领域具有十分重要的意义。
文档编号G01N27/416GK102262122SQ20111016904
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者李玲, 王舜, 金辉乐, 陈锡安 申请人:温州大学