17A rs3748067位点AG基因型测序图谱(反向测序）。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0024] 本发明提供了一种检测胃癌易感基因的方法，由于识别特定位点的限制性内切酶 ApoI适用范围广，价钱较为经济，进而大大降低了检测SNP的成本。经序列分析发现，检测该 A/G多态的方法可使用表一中的巧中酶，综合考虑简单操作性与经济实用性，限制性内切酶 ApoI是不二选择。
[0025] 表1中提供的限制性内切酶的价格从肥B公司化ttp: //Ww.neb-china. com)，限制 性内切酶的选择从WatCut限制性内切酶分析软件上获取化ttp: //watcut. water Ioo. Ca/ template.php?act = 3吨_116?〇，W此作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。
[0026] 表1几种限制性内切酶识别序列及其价格
[0027]
[0028] 在本发明的实施中，正向引物和反向引物的设计采用Primers.0软件进行，设计的 原则综合考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度W及扩增效率的影响。按照碱基互不配对的 原则设计引物，引物长度一般在15~30碱基之间，过长或短均会造成特异性差，过长还会导 致其延伸溫度大于74°C，不适于化qDNA聚合酶进行反应。引物GC含量在40 %~60 %之间，化 值最好接近72°C，GC含量过高或过低都不利于引发反应。碱基要随机分布，引物自身及引物 之间不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。引物5/端和中 间AG值应该相对较高，而y端AG值较低。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有 特异性，引物设计完成W后，应对其进行BLAST检测，W确保其与其它基因不具有互补性。在 此基础上，最终选取的上游引物序列为5 ' -AGGATGGAGTGAAGAGGAA-3 '，下游引物序列为5 ' -AGAGATCAACAGACCAACAT-3'。由此引物扩增出的面的片段317bp，扩增产物如下： AGGATGGAGTGAAGAGGAAGGTCTTTCAAGAAGCAGGGAGCCTGCAGAGTGGCCTGAGAATATCTAGAGGCCTTCAG AAGTAGGGCAAGACAGCACATGGGCCATGGGGGCGAAAATGGTTACGATGTGAAACTTGAAACTACTCTGGAATTGA ATGTGATTGAGTTTTTATTTTACTTGGGCTGAACTTTTCTCATACTTAAARTTCGTTCTGCCCCATCAGCTCCTTTC TGGGTTGTGTGGTGCCTTGATCAGACAGAAGCCAGGCCCTAGGAGTGTTGCTTGAGGAAGAGAAAAATGTTGGTCTG TTGATCTCT(317bp)〇
[0029] 下划线部分分别为正向引物和反向引物，第205位bp的R代表A/G多态即SNP位点 rs3748067。该长为317bp的扩增产物经限制性内切酶ApoI酶切后可产生317bp，203bp(该片 段下游序列相比上游序列由于ApoI酶切产生的粘性末端增加四个单链碱基），114bp(该片 段下游序列相比上游序列由于ApoI酶切产生的粘性末端减少四个单链碱基)共S种片段类 型。基因型判定结果:AA突变基因型，长为203bp及114bp两条带;GG野生基因型，长为317bp; AG杂合基因型，长为31化P，203bp及114bpS条带。
[0030] 凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙締酷胺凝胶电泳，琼脂糖(Agarose)是一种 线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却 凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的，可用于DNA片段的制备电 泳。聚丙締酷胺凝胶主要有两种方式:一是用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙締酷 胺凝胶，二是用于分离及纯化单链DNA片段的变性聚丙締酷胺凝胶。但综合考虑实用性、便 利性W及经济性，使用琼脂糖凝胶电泳不失为一种最佳选择。在本发明中目的片段扩增产 物使用限制性核酸内切酶ApoI抓水浴锅中酶切6-1地。酶切产物采用3%的琼脂糖进行琼脂 糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型W及突变 纯合基因型。
[0031] 在本发明中，PCR扩增体系的反应条件并不受特别的限制，基于PCR原理S步骤而 设置变性-退火-延伸=个溫度点。在标准反应中采用=溫度点法，双链DNA在90~95°C变 性，再迅速冷却至40~60°C，引物退火并结合到祀序列上，然后快速升溫至70~75°C，在 化qDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短祀基因（长度为100~3(K)bp时）可 采用二溫度点法，除变性溫度外、退火与延伸溫度可合二为一，一般采用94 °C变性，65°C左 右退火与延伸（此溫度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。而对于待测DNA也没有较高的浓度 及纯度要求，既可W是人体体液或组织中提取的DNA，也可W是经过预先降解处理的基因 组。但为了方便实施W及减少受试者痛苦，一般优先选择从血液中进行基因组DNA的提取。
[0032] 本发明经过多年研究，首次证明了 IL17A基因单核巧酸多态性位点rs3748067位于 内含子3' -UTR中，发现了在IL17A基因rs3748067G一A在胃癌病例组和正常健康对照组中的 分布存在显著性差异(P<0.05)。在此基础上本发明提供了一种检测胃癌易感性基因的方 法，还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增位点的引物。利用本发明检测位点的基 因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为胃癌的诊断提供了一个简捷的新途径。
[0033] 在本发明的具体实施方案中，本发明检测人IL17A基因多态rs3748067的具体步骤 如下：
[0034] (1)提取待测人基因组DNA模板，所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人 基因组模板。
[0035] (2 )PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序 列的PCR产物。
[0036] (3)对PCR扩增产物用限制性核酸内切酶ApoI进行酶切反应，得到酶切产物；
[0037] (4)酶切产物进行琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带 判断野生纯合基因型，杂合基因型W及突变纯合基因型。
[0038] 下面对上述各个主要步骤进行详细描述：
[0039] 1材料与方法
[0040] 1.1主要仪器与试剂
[0041 ] 仪器:BCD-228CH冰箱(新飞电器），皿-2数显恒溫水浴锅(华峰仪器），SmartGel凝 胶成像仪(北京赛智创业）,GT9612梯度PCR仪(百泰克生物）,WD900SL23-2型号微波炉(格兰 仕电器），DG-300C型电泳仪(鼎国昌盛生物)等。
[0042] 试剂:肥P004-1DNA提取试剂盒（鼎国昌盛生物），50bp DNA Ladder(莱风生物），2 Xhq PCR Mix(莱风生物），ApoI(Thermo),琼脂糖（SIGMA)等。
[00创 1.2引物设计
[0044] 在NCBI的化SNP数据库中，查找IL17A rs3748067的核巧酸序列如下：
[0045] CAAAAACAAAAACAATTTTTTCTTTTCATCATCACCGTTCAGAGAAAGCTTGAAAACGAGCAGCAGGTTTTTAGTGA GAAGCTTGAAAGCGTAAAGGCTGTGAGGAACTGTCCCTGGAAGCTGCCTGGGGATTTCCTGTAGGAAAATGGTGACA GGGATGGTCACAGGAATCAAGATGTGAGCACAAAATGACTGAGAGGAGGTGGCTGGAGAGGCCAACCCCTGGATTTG GAATAGGGAAAGAAGCCTAGAAAAGCCATGGGCCTCTGGGTGGGCTGGAGCACACTGGATGGAGCAGGATGGAGTGA AGAGGAAGGTCTTTCAAGAAGCAGGGAGCCTGCAGA