离屯、1 Omin。
[0078] 5)取上清，注意避免触及中间介质W及下层液体。加入1/10的醋酸钢W及2.5倍的 无水乙醇，颠倒混匀，12000巧m离屯、IOmin，弃上清。
[00巧]6)加入1ml 70%乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000巧m离屯、IOmin，弃 上清，室溫静置5-lOmin使乙醇挥发干净。
[0080] 7)加入SOiil灭菌水溶解DNA，即得胃癌组织基因组DNA。
[0081 ] (2)碱基序列信息从NCBI的化SNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确 无误后采用Primer Premier 6.0设计各位点引物，结合退火溫度、GC含量W及化bmed中的 Blast序列比对结果化ttp://blast .ncbi .nlm.n;Lh.gov/Blast.Cgi)等信息筛选出最优引 物为正向引物序列：5'-AGGATGGAGTGAAGAGGAA-3'，下游引物序列为5'-AGAGATCAACAGACCAACAT-3 '，进行PCR 引物扩增，制备PCR扩增体系：2 X ^qPCRMix7.化1，双 蒸水5 .化1，上游引物0 .化1，下游引物0.3iil W及模板DNAl.化1，充分混匀后即得15 . Oiil PCR扩增反应体系;按照第一阶段:94 °C变性5min，第二阶段共包括35个循环S个步骤，首先 94°C变性3〇3,58.2°(：退火453，最后72°(：延伸453，第^阶段:72°(：延伸5111111，最终4°(：储存^ 备用，即得长为31化P的PCR扩增产物；
[0082] (3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶ApoI抓水浴锅中酶切6-14h，PCR反应 产物扣1，限制性内切酶0.扣1，Buf f erl.化1W及无核酸酶纯水8.化1共计15山酶切体系，于 水浴锅中37 °C酶切6-14h，即得酶切产物。所述的识别AAATTC序列的限制性内切酶为内切酶 ApoI及其同裂酶;所述的识别AATT序列的限制性内切酶为内切酶Sse9I ,MluCI及其同裂酶， 综合考虑经济实用性W及简单操作性最终选择ApoI进行酶切鉴定；
[0083] (4)酶切产物采用3%的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的 条带判断野生纯合基因型，杂合基因型W及突变纯合基因型(见表2)。
[0084] 表2 rs3748067位点基因型判定
[0085]
[00化]实施例2.人外周血全血标本测定人IL17A rs3748067多态性
[0087] 与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从人外周血中中提取基因组DNA 作为待测DNA。
[0088] 按照肥P004-1全血基因组DNA提取试剂盒的操作步骤进行待测血样基因组DNA的 提取，具体步骤如下：
[0089] 1)在1.5ml离屯、管中加入30化1血细胞后，再加入90化1细胞裂解液混和均匀，在冰 上放置IOmin后，在离屯、机中1200化pm离屯、Imin，弃上清，再次加入90化1细胞裂解液，用枪 吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
[0090] 2)向沉淀物中加入60化1 solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入IOiil 蛋白酶K混匀，在70 °C水浴锅中放置IOmin后，12000巧m离屯、5min。
[0091] 3)将离屯、管中的上清转入编过号的新的离屯、管中，再向新的离屯、管中加入50化1 无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA;
[0092] 4)将混匀的液体转入离屯、柱中（若一次转不完，可分次转入），室溫静置2min，再 12000巧m离屯、Imin，弃废液；
[0093] 5)加入700iil已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室溫静置2min， 12000巧m离屯、Imin，弃废液；
[0094] 6)加入700iil已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室溫静置2min， 12000巧m离屯、Imin，弃废液；
[00巧]7)加入50化1 solution D漂洗液，12000巧m离屯、Imin,弃废液；
[0096] 8)再次离屯、2min，将离屯、柱置于新的编过号的离屯、管中，敞口放入37 °C恒溫箱内 IOmin直至无明显乙醇味；
[0097] 9)在娃基质膜中央加入已经预热到65°C的solution E 10化1，室溫放置5min， 1200化pm离屯、Imin，重复上述步骤一次，终离屯、后的液体即为提取出的基因组DM。
[0098] 提取完毕基因组DNA后按照案例一的步骤进行基因型的鉴定，鉴定结果如下：将酶 切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯下拍照鉴定。对于不同的基因型，rs3748067位 点不同基因型展现出不同的条带（见图1)，GG纯合野生基因型，317bp-条带;AG杂合基因 型，长为317bp，203bp及114bpS条带;AA纯合突变基因型，长为203bp和114bp两条带。各基 因型均经测序W进一步鉴定，测序结果(见图3-4)显示与现有技术测得的结果完全相同。
[0099] 本发明对PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际运用 中具有很大的灵活性，加之检测方法简单易行，因此是一种进行单碱基突变位点基因型鉴 定的好方法。技术关键点是设计出的IL17A多态性rs3748067的上下游引物，正向引物序列： 5 ' -AGGATGGAGTGAAGAGGAA-3 '，下游引物序列为5 ' -AGAGATCAACAGACCAACAT-3 ' W及限制性 内切酶ApoI的使用。本发明所提供得检测人胃癌易感基因IL17A多态性rs3748067的方法操 作简单、成本低、适用范围广泛。
[0100] W上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明 披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的 保护范围内。
【主权项】
1.一种用Apol检测人胃癌易感基因 IL17A rs3748067多态性的方法，其特征在于，包括 以下步骤： (a) 抽提样品的基因组DNA; (b) 提供扩增人IL17A基因多态性rs3748067位点附近序列的正向引物和反向引物， rs3748067上游弓| 物：5 ' -AGGATGGAGTGAAGAGGAA-3 '，rs3748067下游弓| 物：5 ' -AGAGATCAACAGACCAACAT-3 '，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取 扩增产物； (c) 使用限制性内切酶对步骤(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物； (d) 将酶切产物采用3 %的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定IL17A基因多态性rs3748067的 各基因型；其中，经电泳后有一条条带者为GG基因型，两条条带者为AG基因型，三条条带者 为AA基因型。
【专利摘要】本发明公开了一种用ApoI检测人胃癌易感基因IL17A rs3748067多态性的方法，采用聚合酶链式反应扩增目的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱分析此段序列的特异切位点，藉由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。简而言之，就是先PCR扩增相应目的片断，而后进行限制性内切酶切反应，电泳后观察比较限制性图谱来分析序列之间的差异。此方法重复性好，操作较简单，成本低，酶切结果容易辨识。因此，本发明的目的是提供一种操作简单、成本低、适用范围广泛的检测人胃癌易感基因IL17A多态性rs3748067的方法及检测试剂盒。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105695613
【申请号】CN201610248517
【发明人】王凯娟, 高三友, 侯瑞生, 李丽, 徐娅娟, 和红, 杨倩, 董凯艳, 段富交, 胡艳丽
【申请人】郑州大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月20日