转基因玉米bt176核酸标准样品及其制备方法
【技术领域】
[0002] 本发明属于生物技术领域，特别设及一种转基因玉米BT176核酸标准样品及其制 备方法。
【背景技术】
[0003] 转基因玉米BTl76是孟山都公司(Monsanto)的产品。该品系所改变的性状为耐除 草剂(草甘麟）。在不同国家被批准食用的时间分别为:美国1994年;加拿大、阿根廷、日本、 荷兰、瑞±1996年;乌拉圭1997年；己西、墨西哥1998年;俄罗斯1999年;韩国、罗马尼亚2000 年;南非2001年。可供人类食用或动物饲用。
[0004] 近年来，转基因作物培育技术取得突破进展，陆续推出了一批新品种，在改善农作 物品质、提高产量等方面发挥了巨大作用。然而，人们对转基因食品的安全性问题存在着很 多的争论。转基因作物的生态风险、可能带来的环境问题、作为食品对人体健康影响的问 题、产品加贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界广泛性的关 注。转基因产品的安全性问题已由学术观点分歧，发展到知识产权、环境问题、经济问题甚 至政治问题。欧盟和一些国家相继出台了转基因产品管理法规，我国于2002年3月开始实施 《农业转基因生物安全管理条例》及其=个配套管理办法。2001年，欧盟要求对转基因食品 进行标识管理，并提出对非转基因食品只要不是有意污染，允许含有1%的转基因产品（阔 值），而不用标识。日本、韩国、澳大利亚等不同国家的限量阔值不同，从1%-5%不等。
[0005] 转基因食品的检测是运些旨在保护生物和生态安全、维护消费者权益、促进贸易 和经济健康发展的法规和政策的基本依据，其标准化将为制订、实施和改进运些法规和政 策提供有力保证。开展转基因成分检验标准样品的研制在保证测试结果的可比性和溯源性 、保障食品安全、解决贸易争端，促进经济发展等方面均具有重要的意义。国内外转基因食 品的检测研究刚刚起步，许多问题都有待解决，标准样品则是该领域尚未解决的重要问题。 更为严峻的问题是目前国外仅有转基因大豆粉、转基因玉米粉M0N810等少数几个品种的标 准物质，价格非常昂贵，手续繁多，周转时间长，不能适时地满足检验检疫工作的需要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种具有高稳定性的转基因玉米BT176 核酸标准样品。本发明的另一目的是提供一种转基因玉米BT176核酸标准样品的制备方法。
[0007] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是:一种转基因玉米BT176核酸标准样 品，其特征在于:所述转基因玉米BT176核酸标准样品包含转基因玉米BT176品系特异性基 因片段和玉米内源zein基因片段，具体序列为： 转基因玉米BT176品系特异性基因片段序列： ggccgtg曰曰C g曰gctgttnn nnnnn曰gc曰曰 cc曰g曰tcggc eg曰c曰ccnnn nnnnnnntt曰 gaaaacatgt aggcttcttc cc ; 玉米内源zein基因片段序列： Ggtcgtttcc C过tctcttcc tcc打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打过过tc过gg gctc过ttttc tcgctcctc过打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打g过Ctg 过gggtctcgg 过gtggn
[000引进一步地，所述转基因玉米BT176品系特异性基因片段为玉米基因组DNA与BT176 品系特异基因之间的边界序列。
[0009] -种转基因玉米BT176核酸标准样品的制备方法，其特征在于:包括W下步骤： 第一步:总DNA提取： 取转基因玉米BT176品系种子进行种植，并在玉米成熟后收取转基因玉米作为原料，采 用TaKaRa公司的DNA提取试剂盒(货号D9093)进行DNA提取； 第二步:特异性PCR扩增： 特异性PCR扩增的25化反应体系：10XPCR Buffer 2yL，dNTPs(2.5mmol/L) 2yL，Ex hq巧U/yL)0.^L，引物（lOpmol/yL)各1化，模板DNA(0.3-6蛇/化分化，用无菌水补充至25 化； 异性PCR扩增的反应条件:94°C预变性3.〇111111;94°(：变性0.4111111，55°(：退火1111111，72°(：延 伸Imin，35个循环;72 °C 5min; 4°C保存，引物及探针序列见表1: 亲1引物巧探针序列
， 第=步:PCR扩增产物回收纯化： PCR扩增产物回收纯化采用PCR纯化试剂盒（DV805A)(TaKaRa Agarose Gel DNA 化rification Kit Ver.S.O试剂盒(DV805A))进行； 第四步:质粒制备： 将PCR扩增后获得的转基因玉米BT176品系特异性基因、玉米内源zein基因的目的片段 回收后，连接至PMD19-T Vector载体，通过筛选鉴定获得具有插入片段的克隆，质粒标准样 品再经其他有资质的测序公司进行测序比对确认，具体步骤如下： (1)选取载体与连接 选取宝生物工程(大连)有限公司生产的PMD19-T Vector载体，将T载体与插入目标基 因片段大小矜々n下hk俩I诺按.
连接体系为：
(2) 制备JM109感受态细胞 挑一个感受态细胞的单菌落到IOmL不含有抗生素的LB培养基中，37°C剧烈振摇培养 池 ，使其浓度达到ODsoo =0.4左右，将培养好的感受态细胞分装在1.5mL经高压灭菌的EP管 中，冰浴lOmin，之后4°C，4100rpm离屯、lOmin，弃净培养基，用750mL预冷的O.lmol/L CaCh 溶液重悬细胞，4°C，4100rpm离屯、lOmin，弃净CaCh溶液，200yL预冷的O.lmol/L CaCb重悬 细胞，4°C存放一周内使用，或加入10%灭菌甘油，一70°C存放待用； (3) 热转化 将（1)中的连接液2化L加入至10化L JM109感受态细胞中，放置冰中30 min;42°C加热 45s后，再在冰中放置2-5 min;加入90化L SOC培养基，转入15mL小管中，37°C振荡培养60 min; W10化L和20化L两个梯度涂SOC平板，37°C过夜培养，形成单菌落，计数白色、蓝色菌 落； (4) 阳性克隆的筛选 用灭菌牙签挑取白色菌落，进行PCR筛选，电泳确定插入片段大小，挑选已经插入正确 片段的菌落植菌，4mL TB(Amp)培养，37°C过夜； 巧）质粒回收 应用质粒回收纯化试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 (货号DV80IA))回收质粒DNA，挑选阳性克隆质粒DNA进行DNA双向测序，确保构建的质粒DNA 与预期DNA序列一致； (6)目标分子DNA线性化处理 将上述质粒，即目标分子DNA用化nd-虹限制酶进行线性化处理，经PCb抽提、乙醇精 审IJ，取山L进行电泳确认，即得转基因玉米BT176核酸标准样品。
[0010] 本发明方法制备出的核酸标准样品不再具有生物活性，在构建、扩增及分析鉴定 的过程中，对实验室环境进行监控分析，不存在生物污染和传染的问题，解决了分子生物学 阳性对照的来源问题，而且样品稳定，无污染。本发明标准样品的制备完成，有助于全面深 入的研究解决转基因成分检测分子DNA标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展 我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有重要的现实意义。
【附图说明】
[0011] 图1为转基因玉米BT176核酸标准样品的制备流程图。
[001^ 图2为转基因玉米BT176核酸标准样品的电泳结果图，图中：M:AHind-III DNA Marker，1: Hind-H I线性化后的质粒DNA，2:未线性化的质粒DM。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。 实施例
[0014] 一种转基因玉米BT176核酸标准样品，包含转基因玉米BT176品系特异性基因片段 和玉米内源zein基因片段，具体序列为： 转基因玉米BT176品系特异性基因片段序列： ggccgtg曰曰C g曰gctgttnn nnnnn曰gc曰曰 cc曰g曰tcggc eg曰c曰ccnnn nnnnnnntt曰 gaaaacatgt aggcttcttc cc ； 玉米内源zein基因片段序列： Ggtcgtttcc C过tctcttcc tcc打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打过过tc过gg gctc过ttttc tcgctcctc过打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打打g过Ctg 过gggtctcgg 过gtggn
[0015] -种所述转基因玉米BT176核酸标准样品的制备方法，包括W下步骤： 第一步:总DNA提取： 取转基因玉米BT176品系种子进行种植，并在玉米成熟后收取转基因玉米作为原料，采 用TaKaRa公司的DNA提取试剂盒(货号D9093)进行DNA提取； 第二步:特异性PCR扩增： 特异性PCR扩增的25化反应体系：10XPCR Buffer 2yL，dNTPs(2.5mmol/L) 2yL，Ex hq巧U/yL)0.^L，引物（lOpmol/yL)各山L，模板DNA(3蛇/化分化，用无菌水补充至25化； 异性PCR扩增的反应条件:94°C预变性3.〇111111;94°(：变性0.4111111，55°(：退火1111111，72°(：延 伸Imin，35个循环;72 °C 5min; 4°C保存，引物及探针序列见表2: 表2引物及探针序列
第=步:PCR扩增产物回收纯化： PCR扩增产物回收纯化采用PCR纯化试剂盒（DV805A)(TaKaRa Agarose Gel DNA F^urification Kit Ver.2.0试剂盒(DV805A))进行； 第四步:质粒制备： 将PCR扩增后获得的转基因玉米BT176品系特异性基因、玉米内源zein基因的目的片段 回收后，连接至PMD19-T Vector载体，通过筛选鉴定获得具有插入片段的克隆，质粒标准样 品再经其他有资质的测序公司进行测序比对确认，具体步骤如下： (1)选取载体与连接 选取宝生物工程(大连)有限公司生产的PMD19-T Vector载体，将T载体与插入目标基 因片段大小按如下比例连接：
(2) 制备JM109感受态细胞 挑一个感受态细胞的单菌落到IOmL不含有抗生素的LB培养基中，37°C剧烈振摇培养 池 ，使其浓度达到ODsoo =0.4左右，将培养好的感受态细胞分装在1.5mL经高压灭菌的EP管 中，冰浴lOmin，之后4°C，4100rpm离屯、lOmin，弃净培养基，用750mL预冷的O.lmol/L CaCh 溶液重悬细胞，4°C，4100rpm离屯、lOmin，弃净CaCh溶液，200yL预冷的O.lmol/L CaCb重悬 细胞，4°C存放一周内使用，或加入10%灭菌甘油，一70°C存放待用； (3) 热转化 将（1)中的连