GTGGCCTGAGAATATCTAGAGGCCTTCAGAAGTAGGGCAAG ACAGCACATGGGCCATGGGGGCGAAAATGGTTACGATGTGAAACTTGAAACTACTCTGGAATTGAATGTGATTGAGT TTTTATTTTACTTGGGCTGAACTTTTCTCATACTTAAARTTCGTTCTGCCCCATCAGCTCCTTTCTGGGTTGTGTGG TGCCTTGATCAGACAGAAGCCAGGCCCTAGGAGTGTTGCTTGAGGAAGAGAAAAATGTTGGTCTGTTGATCTCTGAG GGGCCTTAATCTCCAAAGGAAGCCTGAGTCTAGGGGAGAAACTGGACATTGTAGTCTGAAGACAATGTCTCCTCCCA GAACTTCTTGTATTTTGGGGAGGGTTTCATTTTCCCCATATGATCTTTAATAATGACATGCCATTCCTCAGGGCCAT TATCTTATTTGCTCTATTCCTATCAAAATGCTTCTGTCTACAGCATTGGCTAATAGTATGAAAACCTTAGTCGGTGT TCAGTCTTGAAGGCATGTGAAATCGAGAACTTGGAATTTTGGGTATTTCCAGGTCATTGTTACTCAAAGACATGCTT TGTTTTGCTTATAGGAGAATTTGCATAACTCTTCCCAATAGGGAAGAGCTGAGTTTGCTAAAATACATTTAATGAGA
[0046] 基因序列的第501个碱基R代表了 A/G多态，即为rs3748067的多态性位点。将W上 序列粘贴至引物设计软件Primer Premier 6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度等参 数进行引物设计，根据GC含量和退火溫度等选择最优上下游引物，再将此引物与化bmed中 的Blast序列比对功能化ttp://blast.ncbi .nlm.nih.gov/Blast .Cgi)进行引物比对，最终 确定的上下游引物为正向引物序列：5 ' -AGGATGGAGTGAAGAGGAA-3 '，下游引物序列为5 ' -AGAGATCAACAGACCAACAT-3 '，引物的合成可W采用本领域通用的方法(如固相合成法），亦可 委托生物公司合成。
[0047] 1.3限制性内切酶的选择
[004引在化SNP中找到位点附近的碱基序列，用WatCut在线限制性内切酶分析软件，在线 捜索获得可识别突变位点的限制性内切酶的信息，综合考虑其酶切特异性及经济适用性选 择最佳的限制性内切酶ApoK
[0049] 1.4从全血中提取待测样本的基因组DNA
[0050] 严格按照离屯、柱型DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA。
[0051 ] 1)在1.5ml离屯、管中加入30化1血细胞后，再加入90化1细胞裂解液混和均匀，在冰 上放置IOmin后，在离屯、机中1200化pm离屯、Imin，弃上清，再次加入90化1细胞裂解液，用枪 吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
[0化2] 2)向沉淀物中加入60化1 solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入IOiil 蛋白酶K混匀，在70 °C水浴锅中放置IOmin后，12000巧m离屯、5min;
[0053] 3)将离屯、管中的上清转入编过号的新的离屯、管中，再向新的离屯、管中加入50化1 无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA;
[0054] 4)将混匀的液体转入离屯、柱中（若一次转不完，可分次转入），室溫静置2min，再 12000巧m离屯、Imin，弃废液；
[0055] 5)加入700iU已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室溫静置2min， 12000巧m离屯、Imin，弃废液；
[0化6] 6)加入700]il已加入相应体积无水乙醇的SOIution D漂洗液，室溫静置2min， 12000巧m离屯、Imin，弃废液；
[0057] 7)加入50化1 solution D漂洗液，12000巧m离屯、Imin,弃废液；
[005引8)再次离屯、2min，将离屯、柱置于新的编过号的离屯、管中，敞口放入37°C恒溫箱内 IOmin直至无明显乙醇味；
[0化9] 9)在娃基质膜中央加入已经预热到65°C的solution E 10化1，室溫放置5min， 1200化pm离屯、Imin，重复上述步骤一次，终离屯、后的液体即为提取出的基因组DM;
[0060] 10)吸取化1提取出的DNA用Nano化Otometer Pearl微量分光光度计测定其浓度和 纯度。
[0061 ] 2 结果
[006^ 2. IPCR扩增
[0063] (1)根据提取基因组DNA的浓度，将研究对象的DNA进行稀释，使终浓度为20yg/山。 (2)PCR扩增体系为2X化q PCR Mix 7.扣1、上游引物和下游引物各0.化1、模板DNA 1.0山， 最后用双蒸水补充总体积至15]il。
[0064] (3)位点的PCR反应条件:第一个阶段为预变性阶段，94°C/5min;第二个阶段包括 =个步骤共35个循环，依次设置为94°C/30s、58.2°C退火时间45s、72°C/45s;第=个阶段72 °C/5min。扩增后的产物序列为：
[00 化] AGGATGGAGTGAAGAGGAAGGTCTTTCAAGAAGCAGGGAGCCTGCAGAGTGGCCTGAGAATATCTAGAGGCCTTCAG AAGTAGGGCAAGACAGCACATGGGCCATGGGGGCGAAAATGGTTACGATGTGAAACTTGAAACTACTCTGGAATTGA ATGTGATTGAGTTTTTATTTTACTTGGGCTGAACTTTTCTCATACTTAAARTTCGTTCTGCCCCATCAGCTCCTTTC TGGGTTGTGTGGTGCCTTGATCAGACAGAAGCCAGGCCCTAGGAGTGTTGCTTGAGGAAGAGAAAAATGTTGGTCTG TTGATCTCT。
[0066]下划线部分分别为正向引物和反向引物，第205位bp的R代表A/G多态即SNP位点 rs3748067〇
[0067] 2.2酶切反应
[0068] 酶切体系为PCR扩增产物化I、限制性内切酶0.扣I、Buffer I.化I，最后用双蒸水 补充总体积至15iU。混匀后置于水浴锅中37°C水浴4-16小时。
[0069] 2.3基因型的判定
[0070] 将酶切产物用3%的琼脂糖凝胶在4-lOV/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下 能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs3748067位点不同基因型展现出不 同的条带(见图1)，GG基因型为317bp的一个片段;AA基因型为203bp及114bp的两个片段;GA 基因型为317bp，203bp及114bp的S个片段。各基因型均经测序W进一步鉴定，测序结果(见 图2-4)显示与现有技术测得的结果完全相同。
[0071] 实施例1.人胃癌组织标本测定人IL17A rs3748067多态性
[0072] 在本发明的具体实施方案中，检测人IL17A基因多态rs3748067的具体步骤如下：
[0073] (1)获取手术切取的胃癌组织，采用酪-氯仿法提取胃癌组织的基因组DNA作为待 测DNA，提取步骤如下：
[0074] 1)将胃癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0 . Ig的组织进行娠磨，加入1ml 的灭菌水，颠倒混匀，10000巧m离屯、IOmin，弃上清，W上步骤重复两次
[0075] 2)加入20化1的DNA裂解液，1的蛋白酶K混匀，55 °C水浴消化过夜。
[0076] 3)消化完成后加入等体积的酪氯仿混合液（1:1)，剧烈震荡，使其变成奶咖色。 12000巧m 离屯、1 Omin。
[0077] 4)取上清时避免触及中间介质W及下层液体。加入等体积的氯仿后颠倒混匀。 1 SOOOrm