用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针、试剂盒及 方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌(S化曲alococcus aureus)属革兰阳性球菌，微球菌科，葡萄球菌 属。它能引起化脈性炎症，当细菌侵入血液时，可引起致病性败血症。
[0003] 自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的 控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解e-内酷胺环， 表现为对青霉素的耐药。为此科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲 氧西林(methicillin)Dl959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感 染，但随后1961年就发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) ,MRSA从发现至今感染几乎 遍及全球，已成为院内和社区感染的重要病原菌之一。
[0004] 自从1961年英国发现MRSA后，在欧美及亚洲一些国家相继报道了MRSA所致的院内 感染。从60年代后期到80年代，MRSA感染率大大增加。美国NNIS报道1975年182所医院MRSA 占金黄色葡萄球菌感染总数的2.4% ,1991年上升至24.8%，其中尤W500张床W上的教学 医院和中屯、医院为多，因为运些医院里MRSA感染的机会较多，耐药菌株既可由感染病人带 入医院，也可因滥用抗生素在医院内产生。欧洲1993年1417家医院ICU分离的MRSA达60%。 而日本Kansai医科大学附属医院MRSA的分离率1993年达到41 %。国内在70年代发现有 MRSA，近几年MRSA的检出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黄色葡萄球菌中MRSA只占 5% ,1988年上升至24% ,1996年激增至72% dMRSA感染多发生于免疫缺陷者，大面积烧伤， 大手术后患者，长期住院及老年患者，MRSA极易导致感染的流行和暴发。为有效控制MRSA的 感染，W及降低疾病造成的危害，建立准确，快速的检测方法是首要任务。
[0005] 目前临床上检测MRSA常用的方法有细菌培养法和PCR法。其中细菌培养法是检测 MRSA的金标准，但该方法需要进行药敏实验，通常需要3-5天才能看到最终的检测结果，检 测成本高、检测周期长;利用PCR方法可在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增 加，有很高的灵敏度和特异性，但缺点是假阳性率高，另一方面，患者血液中有往往含有抑 审化CR反应的成分，运又会导致假阴性的出现，运两方面的缺点限制了 PCR检测的临床应用。 目前，已有用巧光原位杂交(FISH)检测MRSA的报道，但均采用的是线形探针，该方法的缺点 是，杂交完成后，必须用严格的洗涂条件来除去未杂交的探针，而且经常会因为探针清洗不 完全而造成假阳性。由此可见，MRSA感染的临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种巧光信号强度高、特 异性好、可有效、快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子信标探针。
[0007] 同时，本发明还提供了一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒及方 法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌检测的分子信标探针，其包含Beacon MRSA UBeacon MRSA2和Beacon MRSA3 =种探针； 所述Beacon MRSA 1的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示，所述Beacon MRSA2的碱基序列如SEQ ID N0:2所示，所述Beacon MRSA3的碱基序列如SEQ ID N0:3所示；所述Beacon MRSA 1、 Beacon MRSA2和Beacon MRSA3的5'端均标记有巧光基团，Beacon MRSA UBeacon MRSA2和 Beacon MRSA3的3'端均标记有巧灭基团。
[0009] 本申请发明人通过对比大量MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和MSSA(甲氧西林 非耐药金黄色葡萄球菌)菌株的基因序列，挑选出MRSA特有的基因mecA作为检测祀点，并针 对该祀点、在该段祀序列上根据热力学特征和高级结构，设计、合成S条探针（Beacon MRSAl ,Beacon MRSA2和Beacon MRSA3)。运S条探针联合作用，提高了检测的巧光信号强 度，并且特异性高，可W灵敏、有效、快速地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0010] 本发明的分子信标探针中，各探针5'端的茎序列为:5'-TTCCA-3'，3'端的茎序列 为:5 '-TGGAA-3'，各探针5 '端的茎序列与3 '端的茎序列互补，使得探针可W形成颈环结构， 且不会与探针本身形成高级结构。但茎序列并不限于本发明所述序列，本领域的技术人员 可根据现有技术选择其他合适的茎序列。
[0011] 本发明的分子信标探针用于检测的样本范围广泛，包括血液、体液、脈液、尿液、组 织切片、食物样本和来自±壤、空气和水的样本，W及它们的培养物等。运些样本经相应处 理后，只要保持细胞形态完整并且祀核酸未被破坏，均可使用本发明的分子信标探针检测。
[0012] 作为本发明所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针的优选实 施方式，所述巧光基团为CY3,巧灭基团为B册1或者所述巧光基团为FAM，巧灭基团为TANRA。 本发明探针的5'端用CY3标记，3'端用B册1标记时，巧光基团的激发波长为552nm，检测波长 为570nm。当然，本发明分子信标探针的5'端还可W用其他巧光基团标记，例如FITC等，其3' 端也可选择其他巧灭基团标记，例如抓H或TANRA等，巧光基团或巧光巧灭基团可W根据现 有技术进行添加。
[0013] 另外，本发明还提供了含有上述分子信标探针的用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 检测的试剂盒。
[0014] 作为本发明所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的优选实施方式， 所述试剂盒还包括杂交液和洗涂液。
[0015] 作为本发明所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的优选实施方式， 所述杂交液含有硫酸葡聚糖、化CU去离子甲酯胺、化2抓TA、TritonX-100和化is-HCl缓冲 溶液;所述洗涂液含有Tris、NaCl、化iton X-IOO和十二烷基硫酸钢，洗涂液的pH值为6~ 10。作为本发明所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的更优选实施方式，所 述去离子甲酯胺的浓度为10~40% (v/v)。进一步地，所述杂交液含有W下组分：1~10% (讯八）硫酸葡聚糖，100~1000111111〇1几化〔1，10~40%(>/￥)去离子甲酯胺，51]1111〇1几 船26014,0.01~1%(￥八)化11〇诚-100和5~2001111化13-肥1缓冲溶液，化13-肥1缓冲溶液 的抑值为7.5;所述洗涂液含有W下组分:5~50mmol/L Tris，10~lOOmmol/L NaCl，0.01~ 0.2%(v/v)Triton X-IOO和0.01 ~0.2%(v/v)十二烷基硫酸钢。
[0016] 作为本发明所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的优选实施方式， 所述分子信标探针中，Beacon MRSA UBeacon MRSA2和Beacon MRSA3的浓度均为lOng/化。
[0017] 最后，本发明还提供了采用上述试剂盒检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法， 其包括W下步骤：
[0018] (1)吸取样品滴在玻片上，烘干，使样品中的细菌固定在玻片上；
[0019] (2)将玻片浸入无水乙醇中，浸泡；
[0020] (3)在样品上加入杂交液和分子信标探针，置于巧光原位杂交仪上进行杂交；
[0021] (4)用洗涂液洗涂；
[0022] (5)烤干后滴加封片剂，用巧光显微镜镜检，用物镜扫视和计数，并观察细菌形态。
[0023] 上述检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法为巧光原位杂交(Flourescence in situ Hybridization ,FISH)法，该方法是一种应用标记有巧光基团的探针，通过杂交的方 法来检测细胞或组织内特异性DNA或RNA的方法;分子信标探针是一种具有独特"发夹"空间 结构的探针，在未与祀序列结合时，分子信标呈"发夹"结构，有一环序列（loop)和一茎序列 (stem),其中环序列是与祀位点互补的碱基序列，而茎序列是与祀位点无关的互补序列;在 探针的两端分别标记有巧光基团和巧光巧灭基团，当探针处于发卡结构时，巧光基团和巧 灭基团相邻，产生能量共振转移效应，使得巧光基团被巧灭，不能产生巧光信号，而当探针 与祀位点结合时，发夹结构被打开，巧光基团和巧灭基团分开，产生巧光信号，通过巧光显 微镜可W检测到该巧光信号。
[0024] 作为本发明所述检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法的优选实施方式，所述步 骤(3)中，置于巧光原位杂交仪上进行杂交的溫度为42~58°C。
[0025] 本发明的有益效果为：本发明将MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)特有的基因 mecA作为检测祀点，针对该祀点设计、合成分子信标探针。本发明的分子信标探针包含S条 探针，运=条探针联合作用，提高了检测的巧光信号强度，并且特异性高，可W灵敏、有效、 快速地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0026] 本发明还建立了检测MRSA的反应体系及检测方法，克服了 MRSA当前临床检测的诸 多问题，为MRSA感染的诊断、预防和控制提供新的检测方法。
【具体实施方式】
[0027] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0028] 实施例1:分子信标探针
[0029] 本实施例所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的分子信标探针，其包含 Beacon MRSA UBeacon MRSA2和Beacon MRSA3S种探针；所述Beacon MRSA 1 的碱基序列 为：5 ' -CY3-TTCCACCAATACAGGAACAGCATATTGGAA-BHQ1-3 ' ；所述Beacon MRSA2的碱基序列 为：
[0030] 5 ' -CY3-TTCCATAATTCACCTGTTTGAGGGTTGGAA-B册 1-3 ' ；所述Beacon