用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，设及医学分子诊断及生物技术，具体设及用于非治疗 目的的肥厚型屯、肌病相关致病基因突变的筛查方法。
【背景技术】
[0002] 肥厚型屯、肌病化CM)为一种最常见的遗传性屯、脏疾病，主要表现为左屯、室不对称 性肥厚或屯、肌壁增厚，较少患者表现出左室流出道梗阻、右屯、室肥厚或双屯、室肥厚。病理特 征为屯、肌细胞弥漫性肥大、崎形、核大、深染和屯、肌纤维素乱等。HCM临床表现从无征兆到呼 吸困难、晕厥、胸痛甚至发生屯、源性巧死和致命性的屯、律失常。
[0003] HCM是第一个从遗传角度阐明病因的遗传性屯、脏疾病。1990年在一个加拿大家族 性肥厚型屯、肌病患者中发现第一个致病基因 MYH7,其遵循的是常染色体显性遗传模式。HCM 的全球发病率和年死亡率分别约为1/500和1 %。相关证据表明，Zou等人随机抽查中国9个 省的成年人8080人，其中男性4064人，女性4016人，并对其进行超声屯、动图检测，结果表明 中国人群患HCM的概率大约为0.8/500。实际上，超声屯、动图对肥厚型屯、肌病的检测为一种 患病后的诊断方式，还存在更多潜在的HCM患者，依此推断，中国人群中至少存在200万HCM 患者。该病也是是青少年和年轻运动员巧死的最主要原因之一，Morn等人对1986-2006年巧 死的1886名美国年轻运动员进行统计分析发现，死亡的主要原因为屯、血管疾病1056名，占 约56 %，其中HCM的患者就占据了 36 %。
[0004] 相关研究表明，HCM主要由肌苄基因突变所致，故HCM又称为肌小节疾病。HCM主要 遵循常染色体显性遗传模式，常染色体隐性遗传较少，大约有50 %的HCM患者为家族性遗 传，称为家族性肥厚型屯、肌病(FHCM) dHCM具有高度的临床遗传异质性，到目前为止，发现的 与HCM发病相关的致病基因大约有30个，致病性突变位点超过1400个，但约80%的HCM患者 的致病基因主要发生在编码粗肌丝、细肌丝或能量代谢蛋白的基因上，运些基因为:MYH7、 MYBPC3、?NT2、TONI3、MYH6、TPMl、ACTCl、P服AG2、MYL2和MYL3。肌节蛋白突变导致HCM的机 制还不太清楚，目前认为肌节蛋白基因突变后导致粗肌丝或细肌丝对Ca 2+的亲和力和敏感 性加强，过度消耗了细胞内的能量，屯、肌细胞供能不足，触发了屯、肌细胞的死亡，导致屯、肌 细胞电传导能力受损，从而表现出屯、室肌肥厚。
[0005] 对肥厚型屯、肌病患者进行基因检测和家族筛查能够为临床诊断提供重要的指导 作用，主要体现为：1)产前诊断，指导优生优育；2)辅助明确诊断，进行临床干预;3)家族筛 查，进行家族疾病发生风险评估及管理。
[0006] 肥厚型屯、肌病最大特点为临床遗传异质性，致病基因较多，致病性突变位点已经 接近1400个。CN 102965428A公开了及一种检测遗传性屯、肌肥厚相关基因突变样品制备试 剂盒。该试剂盒包括a)独特设计并制备捕获探针，针对基因 ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、 CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、肝H2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、 MYLK2、MY0Z2、P服AG2、RAF I、SO SI、TCAP、?NC I、?NI 3、TNNT 2、TPMI、TTN、TTR、VCL全部外显 子片段;b)设计带有独特标签序列的接头;c)通用引物对探针序列进行PCR扩增;d)设计独 特的混合后目的片段的捕获操作。该申请采用探针捕获测序，与其他传统的DNA忍片杂交和 毛细管电泳测序技术一样，不仅费时费力，而且价格昂贵，根本不能满足对肥厚型屯、肌病的 基因检测。
[0007] 下一代测序技术为最近几年生命科学领域发展最为迅速的技术之一。在遗传疾病 基因检测方面，最引人注目的是下一代半导体测序平台，该平台由美国Life Technologies 公司在2010年发布，是一款专口针对临床遗传疾病基因检测而开发的一款台式个体化高通 量基因测序仪，其W布满微孔的高密度半导体忍片为测序基础，具有快速、经济、灵敏性好、 准确率高等特点。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种用于非治疗目的的肥厚型 屯、肌病相关致病基因突变的筛查方法，该方法利用多重PCR对祀基因进行扩增后，在下一代 半导体测序平台的基础上，采用314半导体忍片对祀基因进行大规模的平衡测序，一次可检 测多个病例样本，具有简便、快速、准确和经济等特点，为肥厚型屯、肌病的临床早期诊断和 预防建立了新的方法。
[0009] 为达到上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0010] 第一方面，本发明提供用于非治疗目的的肥厚型屯、肌病相关致病基因突变的高通 量筛查方法，包括如下步骤：
[0011] (1)提取基因组；
[0012] (2)采用多重PCR扩增祀基因；
[0013] (3)祀基因文库构建；
[0014] (4)对祀基因文库通过下一代半导体测序平台进行测序，筛查出与有肥厚型屯、肌 病发病相关的基因突变位点。
[0015] 本发明中，利用多重PCR对祀基因进行扩增后，在下一代半导体测序平台的基础 上，采用314半导体忍片对祀基因进行大规模的测序，一次可检测多个病例样本，具有简便、 快速、准确和经济等特点。
[0016] 优选地，步骤（1)所述的基因组来自于人的外周血、屯、肌组织、淋己器官、脾脏、骨 髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合。
[0017] 优选地，步骤（2)所述祀基因包括MYH7、MYBPC3、TONT2、?NI3、MYH6、TPMl、ACTC1、 P服AG2、MYL2和MYL3全部外显子片段的编码区及其附近不少于50bp的非编码区。
[001 引本发明中，用于扩增祀基因 MYH7、MYBPC3、?NT2、TONI3、MYH6、TPM1、ACTC1、 PRKAG2、MYL2和MYL3全部外显子片段的编码区及其附近不少于50bp的非编码区的引物对如 下表1所示：
[0024]
[0025] 优选地，步骤（2)所述多重PCR的反应体系为：5XPrimeSTAR GXL Buffer lOuL， dNTP Mixture 4uL，IOuM的上下游引物各化L，模板DNA为化L(250ng/uL) ,PrimeSTAR G)(L DNA Polymerase 化L，d地2〇为30uL，终体积为50uL。
[00%]优选地，步骤(2)所述多重PCR的反应条件为：
[0027] (a)98°C预变性3分钟；
[002引 （b)98°C变性10秒，54或57°C退火15秒，68°C延伸1-3分钟，共35个循环；
[00巧](c)68°C延伸5分钟。
[0030] 优选地，所述方法还包括在步骤（2)所述多重PCR扩增祀基因后进行多重PCR产物 纯化及片段化。
[0031] 优选地，所述多重PCR产物纯化包括如下步骤:对每个样品各个区段的多重PCR产 物进行定量，W等比例混合后，用磁珠进行纯化。
[0032] 优选地，所述多重PCR产物片段化包括如下步骤:将纯化后的产物进行定量，再通 过核酸超声破碎仪将片段打断到约150~25化P。
[0033] 优选地，步骤(4)所述的半导体测序平台为采用314半导体忍片进行测序。
[0034] 本发明中，利用Life Technologies公司不同通量的忍片，一次可检测7-96个样本 的10个祀基因，大大的降低了每个样品的检测成本。
[0035] 优选地，所述方法包括如下步骤：
[0036] (1)提取基因组；
[0037] (2)采用多重PCR扩增祀基因：
[0038] A)多重PCR的反应体系为：5 XPrimeSTAR G)(L Buffer IOuL，dNTP Mixture 4uL， IOuM的上下游引物各化L，模板DNA为化L(250ng/uL) ,PrimeSTAR G)(L DNA Polymerase 化L，ddH2〇为30化，终体积为50化；
[0039] B)多重PCR的反应条件为：（a)98°C预变性3分钟；（b)98°C变性10秒，54或57。(：退火 15秒，68°C延伸1-3分钟，共35个循环；（c)68°C延伸5分钟；
[0040] (3)将各个样品各个区段的多重PCR产物定量后进行等比例混合，用磁珠进行纯 化，将纯化后的产物定量后再通过核酸超声破碎仪将其打断到约150~25化P;
[0041 ] (4)将打断后的DNA样本加上特异性的barcode序列标签接头和通用的测序接头；
[0042] (5)应用高分辨率的琼脂糖凝胶2%E-Gel将(4)中加好接头的DNA片段进行电泳回 收；
[0043] (6)祀基因文库构建:应用通用引物将(5)中琼脂糖凝胶电泳回收的DNA片段进行8 个循环的PCR扩增反应；
[0044] (7)对祀基因文库通过下一代半导体测序平台进行测序，筛