压力诱导心肌肥厚细胞模型及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种压力诱导心肌肥厚细胞模型及其应用。本发明的压力诱导心肌肥厚细胞模型，是通过给培养的心肌细胞施加压力培养获得，其中所使用的压力为60mmHg～180mmHg，优选为180mmHg，所述心肌细胞可为大鼠H9c2细胞。本发明发现压力可以诱导大鼠H9c2心肌细胞肥厚，促进细胞直径、体积增大和蛋白含量的增加。本发明还公开了所述压力诱导心肌肥厚细胞模型在心肌肥厚的基础研究和药物研究中的应用。
【专利说明】压力诱导心肌肥厚细胞模型及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种压力诱导心肌肥厚细胞模型及其应用。
【背景技术】
[0002]心肌肥厚是心脏对急、慢性血流动力学超负荷的一种基本的适应性反应。以心肌细胞直径、体积增大及细胞内蛋白质合成增加为主要特征，是引起心血管疾病的独立危险因素，也是心血管疾病常见的一种病理状态。早期心肌肥厚是心肌细胞对外界刺激的代偿性改变，有利于维持心输出量，对机体起到代偿性保护作用，但长期的心肌肥厚将会诱发心力衰竭等心血管疾病，甚至引发猝死。因此，探讨心肌肥厚的发生发展机制及其可能的调节机制，寻求防治心肌肥厚新靶点和开发更有效的药物，对心肌肥厚诱发心衰等心血管疾病的预防和治疗具有重要的意义。
[0003]心肌肥厚的发生机制极其复杂至今仍未完全明了，目前认为导致心肌肥厚的原因主要可归纳为:机械性、神经性与体液性。其中机械刺激主要就是指压力诱导。压力超负荷使心室壁张力增加，可导致心肌肥厚的产生。长期患有高血压的患者，可引起左心室的心肌肥厚。压力负荷一方面直接刺激细胞生长，另一方面可激活心肌细胞膜上的压力信号开关，进而调节相关蛋白的表达以及各种细胞因子的分泌如去甲肾上腺素、血管紧张素II和甲状腺素等等。2012年《Nature》杂志已经报道血管紧张素受体样受体APJ可能作为一个压力感受的祀标，参与心肌肥厚的发生(Scimia MC, et al.APJ acts as a dual receptor incardiac hypertrophy.Nature.2012, 16;488(7411):394-8.)。
[0004]压力负荷即机械性因素在心肌肥厚中的作用最为重要。压力负荷诱导心肌肥厚在实验动物上可以通过腹主动脉狭窄来建立，而目前在体外培养的细胞上以前无法实现。压力负荷可以激活机体产生众多细胞因子如去甲肾上腺素、血管紧张素II和甲状腺素的分泌，有报道单独使用这些细胞因子也能诱导体外培养的心肌细胞肥厚，但处理因素单一，并且无法模拟体内压力负荷的环境。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型，其特征在于，其通过给培养的心肌细胞施加压力培养获得。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型，其特征在于，所使用的压力为60mmHg~180mmHg。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型，其特征在于，所使用的压力为优选为180mmHg。
[0008]本发明的另一目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型，其特征在于，所使用的心肌细胞为大鼠H9c2细胞。
[0009]本发明的另一目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型在心肌肥厚的基础研究和药物研究中的应用。
[0010]本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法，其特征在于，其通过给培养的心肌细胞施加压力培养获得。
[0011]本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法，其特征在于，所使用的压力为60mmHg~180mmHg。
[0012]本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法，其特征在于，所使用的压力为优选为180mmHg。
[0013]本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法，其特征在于，所使用的心肌细胞为大鼠H9c2细胞。
[0014]本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法在心肌肥厚的基础研究和药物研究中的应用。
[0015]在本发明中，发明人应用自制的压力细胞培养箱，可以将心肌细胞置于体外的压力负荷环境来培养，从而可以在体外实验中模拟体内的压力负荷环境。应用压力培养可以弥补单一因子诱导培养的不足。压力培养箱的压力还可以调节，从而可以模拟体内压力负荷的动态变化。该模型实施的操作便利，在短时间内(通常48小时)即可复制出心肌肥厚细胞模型，重复性很好，与动物实验也可以做平行研究，具有较好的可比性。
[0016]在本发明中，发明人将普通细胞培养箱改装成压力细胞培养箱，通过这种压力细胞培养箱，给培养的心肌细胞施加压力。发明人的研究结果发现压力可以诱导大鼠H9c2心肌细胞肥厚，促进细胞直径、体积增大和蛋白含量的增加，并且细胞内血管紧张素受体样受体APJ表达的增加。
[0017]发明人进一步设计`并合成小分子RNA用于干扰APJ的表达，结果发现干扰APJ后可以逆转压力诱导的心肌细胞直径、体积增大和蛋白含量的增加。整个实验结果可通过如图1所述的信号通路图来描述说明:压力刺激细胞膜上的压力感受器一APJ受体，使APJ受体表达增加，然后诱导心肌细胞肥厚；而1?^干扰抑制APJ的表达后能逆转压力诱导的心肌细胞肥厚(如图1)。此外，使用磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002和细胞自噬抑制剂3-Methyladenine两种工具药也可以逆转压力诱导的心肌细胞肥厚。
[0018]综上所述，本发明发现了用发明人自制的压力细胞培养箱可以诱导H9c2心肌肥厚细胞模型，深入研究后发现APJ介导压力诱导的心肌细胞肥厚。本发明为压力如何诱导心肌细胞肥厚提供了实验的证据。这一心肌细胞模型及其制备方法在心肌肥厚的基础研究和药物研究中都有重要的意义和广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1信号通路图，显示压力刺激细胞膜上的压力感受器一APJ受体，使APJ受体表达增加，然后诱导心肌细胞肥厚；而1?嫩干扰抑制APJ的表达后能逆转压力诱导的心肌细胞肥厚。
[0020]图2本发明自制的压力细胞培养箱实物照片。
[0021]图3Western Blot结果图，显示压力诱导大鼠H9c2心肌细胞中APJ的表达显著增加( T 士s，n=6 )。[0022]图4shRNA 干扰 APJ 的结果图(无士S，11=6 )。
[0023]图5本发明自制的压力细胞培养箱外部结构图，I为压力控制器，2为放气阀，3为温度计，4为压力表，5为温控开关，6为气瓶。
[0024]图6本发明自制的压力细胞培养箱内部结构图，I为压力控制器，2为放气阀，3为温度计，4为压力表，5为温控开关，6为气瓶，7为高压箱体。气体流通路径:6气瓶一4压力表一 I压力控制器一7高压箱体。
[0025]图7本发明自制的压力细胞培养箱内置高压小箱体二维图，I为内六角螺栓，2为密封垫圈，3为高压箱体门。
【具体实施方式】
[0026]建立压力诱导心肌肥厚细胞模型的实验方法如以下实施例所示。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027]实施例1大鼠H9c2心肌细胞培养
[0028]大鼠H9c2心肌细胞(市售可得，可从例如中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库或其它公司获得)是源于B DlX大鼠胚胎心脏组织的亚克隆细胞株，用含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM(1.5g/LNaHC03，4.5g/L C6H12O6,4mM L-谷氨酰胺)培养；每2411 换一次培养液，换液前用 0.01M PBS (称取 8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HP04 和 0.24g KH2P04，溶于 800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L)洗3遍后再加入新鲜培养液；当细胞生长到约70%融合时可传代，用0.25%胰酶细胞消化液消化，显微镜下观察到贴壁细胞从长梭形变为圆形时停止消化，加入新鲜培养基吹打均匀后分瓶培养。在倒置显微镜下观察，大鼠H9c2心肌细胞呈长梭形、带状三角形，细胞间有突起相连，未见心肌搏动。取生长状态良好的细胞用于后续实验。
[0029]实施例2压力培养箱培养大鼠H9c2心肌细胞
[0030]将生长状态良好的大鼠H9c2心肌细胞放入自制的压力细胞培养箱继续培养。靠注入5%C02混合气体(即95%的空气和5%的CO2),可以调节压力培养箱中的压力。
[0031]本发明自制的压力细胞培养箱实物照片参见图2。
[0032]实施例3大鼠H9c2心肌细胞肥厚的检测
[0033]1.大鼠H9c2心肌细胞直径和体积测定
[0034]收集培养后的大鼠H9c2心肌细胞，用0.01M PBS洗3次，加入0.25%胰酶细胞消化液，充分消化后吹打均匀制成细胞悬液，离心弃掉上清，再加入0.5ml PBS重悬细胞，使其呈单个悬浮液，并且用PBS调节细胞密度在5X 104-5X 105/ml，取200 μ I装于2ml的EP管中；用Scepterf.0手持式细胞计数器(Millipore公司，美国)测量细胞直径和体积，直径单位:μ m/cell,体积单位:μ m3/cell。
[0035]2.大鼠H9c2心肌细胞蛋白含量测定
[0036]收集培养后的大鼠H9c2心肌细胞，对各组心肌细胞进行细胞计数。进一步离心沉淀细胞后加入5倍体积的含90%RIPA裂解液和10%苯甲基磺酰氟(PMSF)的细胞裂解液，裂解大鼠H9c2心肌细胞的细胞膜，4°C 12000rpm离心30min后吸取上清，用BCA蛋白定量分析试剂盒(Pierce公司，美国)测定H9c2大鼠心肌细胞的蛋白含量,单位:pg/cell。
[0037]实施例4蛋白质印迹Western Blot[0038]取培养后的大鼠H9c2心肌细胞，弃去培养液，PBS洗3次，滤纸吸去多余液体，加入含90%RIPA裂解液和10%苯甲基磺酰氟(PMSF)的细胞裂解液50-70 μ 1，冰上裂解20min，用细胞刮匙刮取蛋白收集于1.5ml EP管中，4°C 12000rpm离心15min，收集上清后用BCA蛋白定量分析试剂盒进行蛋白定量。加入25%蛋白样品体积的4X上样缓冲液并混匀，煮沸lOmin，取30μ g蛋白样品上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，于电泳缓冲液中80V恒压电泳30min，待样品进入分离胶后改用120V恒压电泳，直至样品电泳至分离胶底部。然后转膜，于转膜液中250mA恒流湿法电转2.5h使蛋白从凝胶转移至PVDF膜上，5%BSA封闭液摇床室温封闭PVDF膜2h后加APJ (兔抗)一抗(1:1000)，4°C摇床孵育过夜。次日，用TBST洗膜4次，IOmin/次，加辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔)(1:3000)室温下摇床孵育lh, TBST洗膜4次，15min/次，然后将PVDF膜放入发光剂(Millipore公司，美国)中孵育2分钟，随后将膜放置于Tanon-6200化学发光成像系统的平台上，曝光，拍照。应用软件Alphalmager2200 (FORM公司，美国)进行图像分析，统计灰度扫描值 。
[0039]实施例5针对APJ的RNA干扰可以逆转压力诱导的心肌细胞肥厚
[0040]shRNAs在上海吉玛公司设计和合成的，共合成了四条APJ干扰链(分别为pGPU6/Neo-APJ-rat-53I, pGPU6/Neo-APJ-rat-399, pGPU6/Neo-APJ-rat-107I 和 pGPU6/Neo-APJ-rat-759)。以pGPU6/Neo_shNC并连接一段与目的基因APJ无同源性的siRNA作为对照。细胞待长到70%左右的时候，进行转染。转染的时候，先将质粒2μ I(含l.0ygDNA)溶于100 μ I无血清培养基中，转染试剂Attractene (Qiagen公司，德国)4.5 μ I溶于100 μ I无血清培养基中，然后两者混合后常温下静置30分钟，再加入六孔板培养的H9c2细胞中，同时加入2ml培养基进行培养，6个小时后，进行一次换液。24小时后提取蛋白，检测APJ的表达。
[0041]实施例6结果分析
[0042](一)压力诱导心肌细胞肥厚
[0043]分别使用压力(60mmHg、90mmHg、120mmHg、150mmHg和 180mmHg)来处理大鼠 H9c2细胞48小时，并检测细胞的直径、体积和蛋白含量的变化。结果显示:与Control组比较，用120mmHg、150mmHg和180mmHg的压力培养大鼠H9c2心肌细胞，心肌细胞直径、体积明显
增大，蛋白含量显著增加(表1)。
[0044]表1压力培养对大鼠H9c2心肌细胞直径、体积和蛋白含量的影响
[0045]
【权利要求】
1.一种压力诱导心肌肥厚细胞模型，其特征在于，其通过给培养的心肌细胞施加压力培养获得。
2.权利要求1所述的细胞模型，其特征在于，所使用的压力为60mmHg~180mmHg。
3.权利要求2所述的细胞模型，其特征在于，所使用的压力优选为ISOmmHg。
4.权利要求1~3任一项所述的细胞模型，其特征在于，所述心肌细胞为大鼠H9c2细胞。
5.权利要求1~4任一项所述的细胞模型在心肌肥厚的基础研究和药物研究中的应用。
6.一种心肌肥厚细胞模型的制备方法，其特征在于，其通过给培养的心肌细胞施加压力培养获得。
7.权利要求6所述的方法,其特征在于,所使用的压力为60mmHg~180mmHg。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所使用的压力优选为ISOmmHg。
9.权利要求6~8任一项所述的方法，其特征在于，所述心肌细胞为大鼠H9c2细胞。
10.权利要求6~9任一项所述 的方法在心肌肥厚的基础研究和药物研究中的应用。
【文档编号】C12N5/071GK103525754SQ201310472471
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】李兰芳, 谢凤, 柳威, 吕德官, 陈临溪, 陈冠峰 申请人:李兰芳