Lrrc10小分子及其在制备治疗心肌肥厚药物中的应用的制作方法

专利名称：Lrrc10小分子及其在制备治疗心肌肥厚药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种心脏特异性表达的亮氨酸丰富蛋白10 (LrrclO)小分子及其构建方法与在制备治疗心肌肥厚药物中的应用。
背景技术：
心脏病是近几十年来影响人类生命健康的主要危险因素之一，其最终的结果是导致人的心脏衰竭。患者在心衰之前，其心脏会经历一个肥大增生的过程，即心肌肥厚，这一过程通过心肌细胞效应于某种外界的病理刺激，进而激活细胞内部的一些信号通路而完成，这些信号通路包括MAPK信号通路、G蛋白偶联受体信号通路、calcineurin-NFAT通路和PII-AKT通路等等。信号通路由特定的受体、信号转导通路和效应终端所构成。所以， 理论上，在心脏遭到一些病理信号刺激时，如果能抑制这些通路的激活，就能有效治疗和预防心脏病。由于生物体内信号通路并非心脏器官所独有，各种信号通路普遍存在于生物体的各个组织和细胞中，这些信号通路对机体的机能都是至关重要的，所以靶向这些信号通路的药物，通常会出现一些副作用。比如针对于calcineurin-NFAT通路开发的抑制性药物就表现出免疫抑制反应和对肾的毒害作用。筛选到一种新的具有更高组织特异性的小分子药物靶点，成为研制开发新型低副作用治疗心脏疾病药物的一大挑战。

发明内容
本发明的目的是提供一种心脏特异性表达的LrrclO小分子蛋白及其构建方法， 以及LrrclO小分子蛋白在制备治疗心肌肥厚的低副作用小分子药物中的应用。本发明的技术方案是
研究表明，SRF基因(基因银行登记号GI:61743976)是维持心脏正常功能的重要蛋白因子。利用小鼠转基因技术，使得SRF中等程度在心肌细胞中过表达，就能较强的诱导心肌肥厚，使小鼠在出生后很快由于心衰而死亡。在心肌细胞中，即使SRF轻微的过表达，也能使小鼠心脏过早衰老。利用基因敲除技术，将SRF基因在小鼠心脏中特异性敲除，也可以导致心肌肥大和心脏衰竭。但是研究表明，适当的降低SRF在小鼠心脏中的表达量，能使心脏获得一个更好的功能，表现出在病理刺激下不容易出现心衰的现象。另外，研究还发现，小鼠心脏中SRF的含量，是随着小鼠年龄的增加而逐渐升高的。在小鼠心脏中降低SRF的表达量，能使心脏趋于年轻化。SRF是一个非常有名的转录因子，在心脏和肌肉中均有较强的表达。作为一个转录因子，它经常和其他的转录辅助因子发生相互作用，一起调控下游基因的表达。虽然SRF并非组织特异性的因子，但是与其相互作用的某些辅助因子具有组织特异性；二者共同作用调控特定的生理过程，从而可实现SRF在其功能上的广泛性和特异性。LrrclO基因(基因银行登记号GI 6300390 是一个无内含子的功能基因，编码含有7个LRR保守结构域的蛋白，LRR结构域具有为蛋白质相互作用提供作用框架的功能。 研究表明，Lrrc 10基因在小鼠心脏组织中有大量而特异性的表达，在小鼠胚胎期的心脏与NKX2-5有极其相似的表达部位，亚细胞定位实验显示其在细胞质与细胞核都有表达，出生后表达升高。进一步分离的新生大鼠心肌细胞实验证明了 Lrrc 10基因在Z-线上和横小管上表达。但斑马鱼和小鼠LRRClO在胚胎心脏发育中的作用相反，小鼠Lrrc 10对其心脏发育无影响，而小鼠Lrrc 10在心脏特异表达，提示该基因可能与维持成体心脏的功能有关。Lrrc 10基因在人类与小鼠中的相似性高达84% (氨基酸水平)，提示该基因在维持人类成体心脏功能中发挥着重要的作用。本发明建立了以下LrrclO小分子构建方法(1)通过酵母双杂交的方法钓取与 SRF相互作用的蛋白分子；(2)通过心肌肥大模型筛选在心脏表达下调的候选基因并通过相关性分析，得到一个在心脏中特异性表达的亮氨酸丰富蛋白10 (LrrclO)小分子；(3)将其作为候选分子，进行功能鉴定。本发明构建了含有LrrclO基因(基因银行登记号GI 6300390 的腺病毒载体， 通过转染细胞进一步包装了含有LrrclO的腺病毒，将腺病毒转染新生原代大鼠的心肌细胞，在苯肾上腺素(PE)和10%胎牛血清的刺激(FBS)48小时，通过心肌特异性抗体 α - actin免疫荧光染色，在共聚焦显微镜下观察，选取100个细胞，用SPOT软件对其细胞表面积尺寸分析，发现LrrclO过表达能显著地抑制由PE和10%FBS引起的心肌细胞尺寸变大，表明LrrclO是一个新的心脏保护因子。为了进一步检测LrrclO基因在心肌细胞中对SRF基因的转录抑制作用，本发明者在感染LrrclO腺病毒的心肌细胞和感染GFP (基因银行登记号GI: 211909965)空质粒腺病毒的心肌细胞中，进行了染色质免疫共沉淀实验，选择SRF经典靶基因Egr-I进行检测，发现在血清的刺激下，过表达LrrclO明显使SRF结合Egr-I基因(基因银行登记号 61:31317226)启动子区域的DNA结合减少。Egr-I基因是一个心肌肥大的促进者，此结果进一步验证了 LrrclO基因对心脏的保护功能。与此同时，本发明者还在细胞系中，利用凝胶阻滞的方法，同样发现，在过表达LrrclO的情况下，SRF与Egr-I基因启动子区域的 DNA结合效率降低。为了进一步弄清楚，LrrclO对SRF转录活性抑制的作用机理，我们检测了 SRF在过表达LrrclO心肌细胞中的表达水平，发现SRF并没有受到影响，但是免疫荧光的结果显示，SRF在血清的刺激下，能迅速入核，而在过表达LrrclO心肌细胞中，SRF的这种入核作用受到明显的抑制。SRF是一个经典的转录因子，其功能通过转录调控下游靶基因而实现。这些结果证明LrrclO通过抑制SRF的入核机制而调控SRF下游靶基因。为了验证LrrclO是否是小鼠体内抑制心肌肥厚的保护因子，本发明进一步构建了心脏特异性过表达的LrrclO转基因小鼠，Founder代经过PCR验证传代成功，Northern blot表明，与同窝阴性小鼠相比，转基因小鼠LrrclO在心脏中表达明显升高。当小鼠受到 ISO刺激后，野生型小鼠，出现明显的肥大表型，具体表现为心重胫骨长度比增加，心室厚度增大，纤维化，肥大标志性基因，ANF、SKA、β MHC表达明显上调。而转基因小鼠心重胫骨长度比不那么明显，出现微弱的纤维化，肥大标志性基因上调被明显的抑制。而在没有受到病理刺激的情况下，野生型小鼠和转基因小鼠没有明显差异。通过体内检测，SRF的一系列靶基因，包括SMA、CTGF、Egr-I、ET-I等基因的表达量都出现明显的下调，这说明，在小鼠体内 LrrclO确实抑制SRF的转录活性。 LrrclO是一个小分子蛋白，分子量为32kd，它含有7个LRR结构域，为了开发小分子药物的需求，本发明针对LrrclO的不同结构域，对其蛋白分子进行不同层次的截短，将不同的截短体表达质粒和SRF与ANF荧光报告质粒，共转细胞发现，仅仅包含第6个和第7个LRR结构域的截短体，就能充分的抑制SRF的转录活性。其截断体的结构域是一个含有72个氨基酸的多肽分子，氨基酸序列为
MGNTIRALVAFIPADRCQNYVVRDLREMPLDKMVDLSGSQLRRFPLHVCSFRELVKLYLSDNHLNSLPPELGo将这段氨基酸序列连入真核表达载体，转入真核细胞，即可得到这段抑制SRF活性的多肽分子蛋白，这就为制备LrrclO的小分子药物提供了很好的应用基础。本发明所述的含有LrrclO小分子的药物，能有效抑制心肌肥大，可用于治疗由病理刺激引起的心肌肥大。本发明的有益效果是本发明以原代培养的心肌细胞作为靶细胞，腺病毒载体介导，和转基因动物，证明LrrclO基因在体外和体内对心肌肥大具有抑制作用。通过细胞学， 组织学和分子生物学方法，都证明抑制作用十分明显，而且由于LrrclO转基因小鼠在正常的生理水平没有明显的表型，同时LrrclO基因是心脏特异性表达基因，这种分子可制备成毒副作用低致病性小的治疗心肌肥大的药物。再加上LrrclO截短体对SRF具有更强的抑制作用，为开发制备以LrrclO基因为靶点的小分子药物提供了依据。又由于SRF与心脏的老年化相关，所以过表达LrrclO基因的药物既可以用来作为治疗心肌肥大疾病又可以用作防止心脏过早老化的保健药物。


图1是LrrclO和SRF相互作用图谱； 图2是LrrclO和SRF直接相互作用图谱；
图3是LrrclO在小鼠肥大模型中表达下调图谱； 图4是LrrclO在小鼠肥大心肌细胞中表达下调图谱； 图5是LrrclO在人类肥大标本中中表达下调图谱； 图6是LrrclO抑制SRF的转录活性图谱； 图7是腺病毒介导LrrclO在心肌细胞中过表达图谱； 图8是LrrclO抑制心肌细胞尺寸变大图谱； 图9是LrrclO抑制PE和10%FBS刺激的ANF上调图谱； 图10是LrrclO导致SRF对Egr-I启动子部分DNA结合减少图谱； 图11是LrrclO导致SRF对Egr-I启动子部分DNA结合减少图谱； 图12是转基因阳性小鼠的鉴定图谱； 图13是转基因阳性小鼠LrrclO蛋白表达水平上升图谱； 图14是转基因阳性小鼠LrrclO转录表达水平上升图谱； 图15是转基因阳性小鼠LrrclO转录表达水平上升图谱； 图16是转基因小鼠抑制ISO诱导的ANF表达上升图谱； 图17是转基因小鼠抑制ISO刺激的心重胫骨长度比值的增加示意18是转基因小鼠总心室厚度增加被抑制图谱； 图19是转基因小鼠在ISO刺激后，纤维化(蓝色)较野生型小鼠微弱图谱； 图20是野生型和转基因小鼠在正常生理状态下SRF的和信号无明显改变，在ISO刺激下，转基因小鼠中SRF的和信号降低图谱；图21是ANF、β MHC在ISO刺激下的野生型心脏中表达明显上调，而转基因小鼠ANF、 β MHC的上调受到抑制图谱；
图22是ANF、β MHC在ISO刺激下的野生型心脏中表达明显上调，而转基因小鼠ANF、 β MHC的上调受到抑制图谱。图23是SMA、CTGF、Egr-l、ET-l在转基因小鼠中较野生型小鼠的下调图谱图M是过表达LrrclO使SRF在胞浆中增加，在胞核中减少图谱。图25是LrrclO各片段拆分示意图沈是LrrclO对SRF的转录活性抑制作用图谱。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明。LrrclO小分子构建方法(1)通过酵母双杂交的方法钓取与SRF (基因银行登记号 61:61743976)相互作用的蛋白分子；(2)通过心肌肥大模型筛选在心脏表达下调的候选基因并通过相关性分析，得到一个在心脏中特异性表达的亮氨酸丰富蛋白10 (LrrclO)，将其作为候选分子，进行功能鉴定(具体参见后文所述各实施例)。通过免疫共沉淀和GST-Pull down实验，结果表明，LrrclO确实能和SRF相互作用。同时，我们在人类心肌肥大的标本中检测LrrclO的蛋白含量，发现在6个心肌肥大病理标本中，与正常心脏相比，LrrclO的蛋白含量明显偏低。此结果表明，LrrclO参与人类心肌肥厚疾病发生的过程。我们把LrrclO基因、SRF与ANF报告载体共转染入细胞，发现LrrclO基因能显著地抑制SRF对ANF报告载体荧光素酶活性的激活作用，而在没有SRF 基因过表达的细胞中，LrrclO对ANF荧光素酶报告活性没有什么影响。此结果说明， LrrclO能抑制SRF的转录活性。又由于ANF基因是心肌肥大的一个重要标志性基因，所以此结果同时表明LrrclO能进而抑制心肌肥厚的发生。实施例1 LrrclO与SRF相互作用的验证
将 pCMV-tag-2B-LRRC10 和 pCMV-myc_FHL2 载体共转染 100 mm 板培养的 HEI^93T 细胞，转染48hr后，去除细胞培养液，用PBS (室温)贴壁洗3次。400 μ 1细胞裂解液(50 mM Tris,pH 7. 5,25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞，12000 rpm离心10 min，收集上清。测定蛋白浓度，在上述细胞裂解物1000 μ g总细胞蛋白中加入2 μ g抗-Flag的单克隆抗体(Sigma公司)或抗_myc的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)，4°C摇床鮮育 4h。之后再力口入 20 μ 1 protein-A/G plus-agarose, 4°C摇床孵育》ir。4000 rpm (IOOOg)离心。小心去掉上清。用裂解缓冲液或PBS洗三次，每次均用2500 rpm转速离心。最后一次离心后，去上清加入30 μ 1 2XSDS上样缓冲液。样品煮沸8 9 min，每1 mm宽的胶孔加入5_10 μ 1样品。SDS-PAGE分离蛋白， 湿法转膜，用抗-Flag (Sigma)或抗-myc单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)进行 Western-blot检测。检测结果发现LrrclO能与SRF发生共沉淀现象，说明二者具有相互作用(见图1)
将 pGEX-4T-I-LRRC10、pGEX_4T-l_LRR12 和 pGEX_4T-l_LRR123LINK 载体转入大肠杆菌BL21，在合适的时间温度下经IPTG诱导蛋白原核表达，表达后的蛋白用谷胱胺肽琼脂糖珠4B纯化。pCMV-myc-FHL2和pcDNA3. lA-myc-SRF分别转入IOOmm培养皿培养的 HEK293T细胞瞬时表达，转染48hr后，去除细胞培养液，用PBS (室温)清洗贴壁洗3次， 然后用 400ul Triton-glycerol 细胞裂解液(1% Triton X-100,10% glycerol, 25 mM HEPES, 150 mM NaCl，2 mM EDTA，蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞，12，OOOrmp离心lOmin， 收集上清。将结合了 GST-LRRC10 , GST-LRRl2和GST-LRR123LINK的谷胱胺肽琼脂糖珠 4B IOul分别加入上清蛋白中，4°C孵育4hr，4000rpm离心收集琼脂糖珠子，用细胞裂解液洗涤3次。去上清，加入30 μ SDS-上样缓冲液。样品煮沸;3min，每个Imm宽的胶孔上样10 μ 1。SDS-PAGE分离蛋白(同时制备2张SDS-PAGE胶)，一张用考马斯亮蓝染色，另一张湿转膜，用抗-myc单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)进行flfestern-blot检测， 结果显示SRF能和LrrclO发生直接的相互作用(见图2)。实例2 LrrclO与心肌肥厚的相关性分析
6-8周FVB品系小鼠，采用皮下注射异丙肾上腺素，30mg/kg/d连续注射7天，使其心肌肥大。后取心脏提取mRNA和蛋白质，取用同龄的FVB小鼠，注射生理盐水作对照，利用Real-time PCR的方法和Western-blot的方法检测LrrclO的表达水平(见图3)。分离原代新生大鼠心肌细胞，利用IOOuM浓度的苯肾上腺素和10%胎牛血清刺激，使其心肌细胞肥大。分别提取肥大的心肌细胞和未处理的心肌细胞mRNA，利用Real-time PCR的方法LrrclO的表达水(见图4)；分别提取人类正常心脏组织和心衰标本组织蛋白，利用 Western-blot的方法检测LrrclO的表达水平(见图5)综合所有结果显示，LrrclO的表达模式和心肌肥大呈现出负相关性。实例3 评价LrrclO对SRF转录活性的影响
将质粒pCMV-Tag2B-LRRC10和ANF-Luc转染至细胞。细胞培养48h后，细裂解胞，其步骤和荧光活性的检测简述如下细胞用PBS洗2次后，加入裂解液80 UL / 孔，-80°C冰箱放置15min，37°C放置15 min，使细胞更充分裂解，然后用细胞刮迅速刮下细胞，转移至1.5 mL的微量离心管，并在12000 rpm,4°C离心15s，取上清20 μ L于_80°C 暂时保存。测量前冰上解冻，同时将荧光显色剂液放置冰上解冻，打开荧光测量仪，设置合适的参数，将荧光显色剂按照40 μ L/管的比例加到20 μ L细胞裂解液中，并迅速置于荧光测量仪内，记录数据。取上清20 yL与10 μ L ONPG assay混勻放入37°C恒温箱培养反应30 min，再加入50 μ L trisbase终止反应，最后加入300 μ L灭菌水用分光光度计测420 nm的吸光值，记录数据，观察其转染效率。实验共重复三次，每次重复两个。用生物统计学分析实验数据。结果显示LrrclO能有效的抑制SRF转录活性(见图6)
实例4 LrrclO基因体外过表达系统的建立
PCR得到目的基因ORF后连T-载体，测序正确后大量酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳，使目的基因DNA片段和T-载体片段尽可能分开，回收纯化目的基因DNA片段，连入 TRACK载体，利用RiieI酶切线性化，电转入BJ5183感受态，提取重组质粒，得到腺病毒质粒。 将腺病毒质粒，PacI酶切线性化，转入细胞，带细胞全部出现绿色荧光，大约有50%变圆飘起的时候，收集细胞，冻融三次后，获取病毒颗粒。将病毒感染，原代心肌细胞，2天后， 收取心肌细胞，提取蛋白，利用Western-blot的方法检测LrrclO标签HA的表达水平.结果显示体外过表达成功。(见图7)
实例5体外实验证明LrrclO抑制心肌肥大分离原代心肌细胞，饥饿M小时候，分别携带LrrclO基因和GFP基因的腺病毒，5小时后撤去病毒，加利用IOOuM浓度的苯肾上腺素和10%胎牛血清刺激48小时后，对心肌细胞进行免疫荧光实验，照相，用SPOT软件统计细胞尺寸大小。同时提取心肌细胞的蛋白，利用Western-blot的方法检测肥大标志性基因的表达情况。结果发现LrrclO病毒感染的细胞，能抑制苯肾上腺素和10%胎牛血清诱导的心肌肥大。(见图8)。实例6:蛋白印记杂交检测LrrclO过表达心肌细胞中中ANF的蛋白表达水平
腺病毒转染原代心肌细胞后，PE和10%FBS刺激48小时，收取蛋白，约20微克在 10%聚丙烯酰胺蛋白胶电泳，用GAPDH作为内参，蛋白电泳后转移至PVDF膜，分别用ANF和 GAPDH抗体(SANTA CRUZ公司)杂交。由图9显示在未过表达LrrclO的心肌细胞中，PE和 10%FBS刺激后，ANF表达明显上升，在过表达LrrclO的心肌细胞中ANF几乎不能检出。实例7 染色质免疫共沉淀检测SRF对其靶分子Egr-I的结合能力
原代心肌细胞感染GFP和LrrclO过表达的腺病毒，胰酶消化收集106个心肌细胞为一个反应，将细胞悬浮于20毫升的DMEM中，加入560微升37%的甲醛(最终浓度为1%)， 在37度摇床中处理10分钟，加3毫升1摩尔每升的甘氨酸(终浓度为0. 125摩尔每升)，摇床中处理3分钟，400rmp 10分钟，用10毫升的，添加有蛋白酶抑制剂的预冷的PBS，洗涤细胞，转入15毫升的管中，用100微升加入了蛋白酶抑制剂CHIP SDS Lysis缓冲液，悬浮细胞，转至1. 5毫升EP管中。30%能量，1. 5分钟一次，探头直接超声，点样检测，超声片段在1KB以内，HOOOrmp离心10分钟，上清转入新的EP管中。测OD值，大概为1微克每微升。加入9倍体积的添加了蛋白酶抑制剂的CHIP稀释液，取20微升作为INPUT对照。每管加入50微升的ftOteinA Agarose, 4度翻转，30分钟(出去非特异结合)。300rmp3分钟， 取上清转入新的EP管中，加3微克的抗体，4度孵育过夜。加入60微升浑浊的ftOteinA Agarose, 4度1小时，300rmp3分钟除去上清，用1毫升低盐、高盐、LiCl溶液，3-5分钟每次，用TE洗液洗两次，3-5分钟每次，用小枪头吸出上清液(一定要吸干净不然有非特异)， 加入250微升洗脱液，温室翻转15分钟，2000rmp 2分钟取上清，重复一次，将500微升的上清，加入250微升的NaCl，酚氯仿的方法提取DNA.使用如下引物做PCR反应C-Egr-1-S: CCCACCACTCTTGGATGGGAGGGCTTCAC, c-Egr-l-aTCGGCCTCTATTTCAAGGGTCTGGAACAGC；c-β -g lobin-sCAGCGTTTTCTTCAGAGGGAGTACCCAGAG, c-β -globin-aTCAGAAGCAAATGTGAGGAGCGA CTGATCC.图10显示在LrrclO过表达的心肌细胞中SRF对Egr-I的启动子结合减少。实例9 凝胶阻滞实验检测LrrclO过表的细胞中SRF对其靶基因Egr-I的结合能力
将过表达LrrclO的质粒转染只细胞中，提取核蛋白备用。将Egr-ISRF结合区域的核酸序列正义为ACAGACCTTATTTGGGCAGCGCCTTATATGGAGTGGCCCAA 反义为 5’ TTGGGCC ACTCCATATAAGGCGCTGCCCAAATAAGGTCTGT3’退火，退火方式为，首先将核酸序列稀释成3微克每微升，各取1微升与退火液混合，退火液的配方是IOOmM KAc,30mM HEPES 2mM MgAc ，于 PCR 仪器中，94C 4min 80C 15min 75C 4min 70C 15min 25C 10S 4C IOmin .退火后，取3.42ul相当于100pm的寡聚核苷酸，4ul切的反应缓冲液，4ul CoC12溶液Iul DIG-ddUTP溶液，Iul末端转移酶，加水至20ul . 37C 15min .置于冰上，加2ul 0. 2M EDTA(PH=8. 0)终止反应。取 2ulDIG 标记的核苷酸，4ul binding buffer (Tris ρΗ7· 5 0. IM KCl 0. 5M DTT 1 OMm), Iul ρ IayD I-DC 4ug核蛋白，室温25分钟，紫外交联两次，加溴酚蓝，95C水浴5min冰上5min，western用DIG的抗体作为一抗，显色。图11显示过表达
LrrclO SRF对Egr-I的启动子结合减少。 实例10:心脏特异性LrrclO转基因小鼠的建立
将LrrclO片段连入SK载体，然后在LrrclO片段钱再连入Myh6基因的启动子，利用 KpnI和SacII酶切线性化，通过显微注射方式，将片段注射小鼠受精卵中，通过胚胎移植的方法将其移植到假孕小鼠的输卵管中(见表1)。在怀孕小鼠的后代中通过PCR的方法，检测首建者小鼠(见图12).通过首建者小鼠传代获得能稳定遗传的转基因小鼠.
片段名称注射卵数移植卵·移植鼠数怀孕鼠数仔鼠数首建鼠数阳性率PMHC-LrrclO38237716 527518. 5%
表1 显微注射情况
实例11 检测LrrclO在转基因小鼠心脏中过表达
提取转基因小鼠心肌蛋白，约50微克在10%聚丙烯酰胺蛋白胶电泳，蛋白电泳后转移至PVDF膜，分别用LrrclO和β-actin抗体(SANTA CRUZ公司)杂交。图13显示LrrclO转基因小鼠心脏中蛋白水平表达升高。提取转基因小鼠心脏RNA，通过反转试剂盒(TAKARA公司)反转成cDNA，通过Real-time PCR的方式检测LrrclO转录水平的变化，以GAPDH作为内参。LrrclO的上游引物为5，GGATGTGGTCTGTGAACT 3’下游引物为 5，GGAAGTAGCGGATACTGT 3’ ；GAPDH 的上游引物为5，AGCCCAGAACATCATCCCT3，下游引物为GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG. 图14所示，LrrclO的转录水平显著升高。取15微克RNA, 在处理过RNA的装置中，凝胶电泳2-3小时，100伏特，将其转入硝酸纤维素膜中，紫外交联一次，能量1200，80度烘烤1小时，预杂交6小时候，加入用同位素32P标记的探针，杂交18小时，洗膜三次，压片至-80度，一周后显影。图15所示，LrrclO转录水平明显升高。 LrrclO探针从cDNA,中扩增出来，上游引物GTCGTCGACTCCCTGACAGAGTTGGTG下游引物 TCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA AGAGCTGGAAGGAAG 3’
实例12 转基因小鼠灌注异丙肾上腺素ISO
取5对同窝同龄同性别对照的野生型和LrrclO转基因小鼠，将ISO溶解在0. 9%的生理盐水中，以每天每公斤体重皮下注射30mg的ISO量，连续注射7天，另外取5对5对同窝同龄同性别对照的野生型和LrrclO转基因小鼠，注射生理盐水做对照。实例13 蛋白印记杂交检测转基因小鼠中ANF的蛋白表达水平
提取转基因小鼠心肌蛋白，约50微克在10%聚丙烯酰胺蛋白胶电泳，蛋白电泳后转移至PVDF膜，分别用ANF和GAPDH抗体(SANTA CRUZ公司)杂交。图16显示ANF在小鼠ISO 刺激的心脏中蛋白水平表达升高。而在转基因小鼠总ANF的上调明显抑制。实例13 组织学分析转基因小鼠表型
解剖小鼠，取其心脏，称量重量，量取后肢胫骨长度，统计学分析心脏重量和胫骨长度比值，图17显示，转基因小鼠，明显抑制了 ISO刺激的心重胫骨长度比值的增加。取其心脏组织，4%多聚甲醛固定过夜，将组织进行系列乙醇脱水70%乙醇(30分钟)，80%乙醇 (30分钟)，90%乙醇(30分钟)，95%乙醇(30分钟)，无水乙醇(30分钟)，无水乙醇(30分钟)， 二甲苯(15分钟)，二甲苯(15分钟)。将脱过水的组织转至处理好的石蜡(石蜡熔化，于60 ！放置过夜)中，透蜡2小时，中间换蜡两次。将组织转到预热的包埋框中，小心除去底板内的气泡，室温放置，使熔蜡凝固。修整蜡块至所需大小。在轮转切片机(MICR0M HM340E)上切片，37 °C干燥过夜。苏木素伊红染色将石蜡组织切片系列乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)复水。置于 Harris苏木素(SIGMA)内染色1分30秒，然后流水冲5分钟，盐酸乙醇分化30秒，再流水冲 5分钟进行蓝化。95%乙醇1分钟，然后伊红染液染色1分钟。染色后的切片经95%、100%、 100%浓度的乙醇脱水，二甲苯透明(2分钟X2次)，中性树胶封片。图18显示心室厚度在小鼠ISO刺激的增加，而在转基因小鼠总心室厚度增加被抑制。染色组织切片脱腊至水。在Bouin's固定液中室温过夜。蒸馏水充分漂洗去处切片上固定液的颜色，苏木素染色5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。去离子水浸润5-10分钟， Biebrich Scalet-Acid Fucshin染色5分钟，去离子水浸润5_10分钟，切片置于磷钨酸溶液中放置5分钟，用Armilline Blue溶液染色5分钟，切片置于1%乙酸中2分钟。切片的分化、脱水和封片。图19显示转基因小鼠在ISO刺激后，纤维化较野生型小鼠微弱。免疫组织化学石蜡切片58°C烘烤2小时，脱蜡，系列乙醇复水，3%过氧化氢室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水洗2分钟X3次，PBS浸泡5 分钟。将组织切片置于400ml 0. IX柠檬酸钠缓冲液内，微波炉加热4分钟，重复两次，然后使其自然冷却，加入山羊血清的封闭液，室温孵育30分钟。倾去血清，滴加1:50稀释的 SRF (SANTA CRUZ)稀释，4° C冰箱过夜。PBS洗，5分钟X3次，滴加1:200稀释的生物素化二抗(中山生物技术公司)，37°C孵育30分钟，PBS洗，5分钟X3次，滴加1:200稀释的辣根酶标记链霉卵白素(中山生物技术公司)，37° C孵育30分钟，PBS洗，5分钟X 3次，显微镜下观察DAB显色情况。流水冲洗，系列乙醇脱水，中性树胶封片。图20显示在野生型和转基因小鼠在正常生理状态下SRF的和信号无明显改变，在ISO刺激下，转基因小鼠中SRF 的和信号降低。实例14 Northern杂交检测ANF、β MHC的表达水平
15微克野生型和转基因的心脏组织mRNA，在琼脂糖凝胶(1. 0%)上缓慢电泳IOOv 2-4小时。用蒸馏水洗两次，9.用毛细管转移法将DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上。转移结束后，用铅笔标记凝胶加样孔的位置，将滤膜置于两组3M滤纸中间，80°C干烤1小时。将滤膜置于预杂交液中，65°C温育1小时，换用新的预杂交液，加入变性的DNA 探针和鲑精DNA，65°C杂交过夜，将滤膜于lxSSC，0. 1%SDS中温室洗20分钟，随后将膜置于 0. 2xSSC, 0. P/oSDS 65°C水浴摇床中温和摇动漂洗三次，每次1小时。将滤膜置于两张3M滤纸中稍事干燥，然后用保鲜膜包好滤膜，贴上数张荧光标签，以便日后校准放射自显影条带在滤膜的位置。将滤膜置于X光片片夹中，于-70°C加增感屏曝光48小时，显影、定影。图 21显示，ANF、β MHC在ISO刺激下的野生型心脏中表达明显上调，而转基因小鼠ANF、β MHC 的上调受到抑制。引物序列如下
权利要求
1.一种心脏特异性表达的LrrclO小分子，其特征在于，LrrclO是一个小分子蛋白，含 72 个氨基酸，氨基酸序列为MGNTIRALVAFIPADRCQNYWRDLREMPLDKMVDLSGSQLRRFPLHVCSFR ELVKLYLSDNHLNSLPPELG。
2.一种如权利要求1所述心脏特异性表达的LrrclO小分子的构建方法，包括以下步骤(1)通过酵母双杂交的方法钓取与SRF相互作用的蛋白分子；(2)通过心肌肥大模型筛选在心脏表达下调的候选基因并通过分析，得到一个在心脏中特异性表达的LrrclO基因； (3)将其作为候选基因分子，进行功能鉴定。
3.如权利要求1所述心脏特异性表达的LrrclO小分子在制备治疗心肌肥大疾病药物中的应用。
全文摘要
Lrrc10小分子及其在制备治疗心肌肥厚药物中的应用，该Lrrc10小分子含72个氨基酸。其构建方法是(1)通过酵母双杂交的方法钓取与SRF相互作用的蛋白分子；(2)通过心肌肥大模型筛选在心脏表达下调的候选基因并通过分析，得到一个在心脏中特异性表达的Lrrc10基因；(3)将其作为候选基因分子，进行功能鉴定。含有Lrrc10小分子的药物，能有效抑制心肌肥大，可用于治疗由病理刺激引起的心肌肥大。
文档编号A61P9/00GK102166346SQ20111010317
公开日2011年8月31日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者吴秀山 申请人:湖南师范大学