专利名称：一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种检测肥厚型心肌病相关基因突变的体外诊断试剂盒，具体的是一种采用大规模平行测序平台技术检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒。
背景技术：
心室肌肥厚是一种症状或者说是一种临床表现，并不是病名.关于心室肌肥厚，定义就是在心脏中，心室心肌形态上发生变化，数量上增加，造成心室室壁的增厚，而心室的室腔相对空间减小，血容量减少。对于造成心室肌肥厚的原因有多种，比如高血压，冠心病，肥厚性心肌病，瓣膜病(如主动脉关闭不全)等.除了上述原因外，还有一些遗传因素造成的代谢障碍、心肌发育过程障碍也会引起心肌肥厚。这些疾病多数起病隐匿、临床表现 相似，物理检查差异不大，但是治疗方法和预后方面存在巨大的差异。最常见的遗传性心肌肥厚的原因是肥厚型心肌病。肥厚型心肌病(HCM)是一种原发性的心肌疾病，表现为不明原因的左心室和/或右心室以及室间隔非对称性的肥厚。它的病理学特征是肥厚心肌细胞紊乱。临床表现多样，可以无症状，亦可表现为心衰、心律失常、猝死等恶性心脏事件，是年轻人心源性猝死的首位病因，年死亡率1_6%。过去认为HCM是一种罕见的心脏疾病。但近年流行病学调查显示白人HCM的发病率高达O. 2%。而我国HCM患者超过200万。可见HCM不再是所谓的罕见疾病。巨大的患病群体和严重的临床预后以及患者带病生存的质量差，造成了巨大的社会和家庭负担。西方发达国家20年前就系统地开展了 HCM分子遗传学研究，已公认的遗传度最高的心血管疾病，并明确HCM为常染色体显性遗传的单基因疾病，即后代只要继承了父母任何一方(患病者)的含突变基因的染色体即可能发病。已经发现至少15个突变基因、超过700个位点突变是HCM的病因。对于心肌肥厚疾病的鉴别诊断传统的方法主要依靠临床表现、心电图、超声心动图和心脏核磁。这些手段存在很大的缺点1.心室肥厚出现时间差异性大，早期无肥厚，有的出现肥厚需几十年时间；2.导致心室肥厚因素众多，不仅有时与高血压难以鉴别，还有很多疾病表现出与HCM完全一致的心脏大体形态学特点，例如Fabry病是一个性连锁遗传的溶酶体Ot.半乳糖奇酶缺乏性疾病。此病属于性连锁遗传，致病基因定位在Xq22，目前已经在此基因区内发现了 150个基因突变，其中错义点突变75 %，基因缺失占15 %，多数家族表现为个体基因突变。临床研究证明有6. 3%的年龄超过40以上发病的肥厚性心肌病患者属于Fabry病。而Fabry病不需要手术干预,只要药物替代治疗可以的。并且Fabry病发生心源性猝死的风险要远远低于肥厚型心肌病。故传统诊断方法面临明确诊断时间晚(症状出现后)、容易发生误诊、难以判断预后等问题。基因诊断的优势在于一是特异性高，旦明确致病基因突变，就是100%确诊；二是早期诊断，即可在症状出现前或不可逆病理改变前作出诊断；三是能够根据基因型判断良恶性临床转归和预后，提供针对性的“个体化治疗”；四是可根据基因型提供遗传咨询和生育指导。这一切都揭示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。由于遗传性的心肌肥厚性疾病涉及的病种多、基因多、突变位点多。如何经济有效的进行基因诊断是非常困难的。传统的PCR、多重PCR、第一代自动测序仪测序都只是针对少量的位点筛查可行。但是面对遗传性的心肌肥厚涉及如此多的的已知突变位点和大量未知潜在突变位点的诊断目标时，这些方法就暴露出时间长、成本高、操作难度大的软肋。近年，大规模DNA 平行测序平台(massively parallel DNA sequencingplatform)已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。利用这种平台更能轻松地把病人所有涉及心肌细胞发育和功能的基因完整检测出来，使HCM这类复杂遗传性疾病的基因诊断成为可能。但是直接使用大规模DNA平行测序平台检测的成本目前仍然令个人难以承受。本 发明可以同时把多个甚至几十病人的遗传性的心肌肥厚相关基因精确的选择性捕获，然后用于大规模测序平台，可以进一步极大地降低基因诊断的成本，使之广泛应用于临床成 为可能。
发明内容
本发明的目的是，提供一种检测遗传性的心肌肥厚相关基因突变的多重目标捕获再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种新的多重目标捕获再测序方法，包括以下步骤a.设计并制备用于捕获遗传性的心肌肥厚相关基因的突变捕获探针。并将这些探针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。b.将待测基因组DNA样品分别片段化至100_400bp，然后将末端补平，加入的ATP使片段两端引入粘性末端。c.分别加入设计好的一端带有标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与一对接头连接，形成新的片段。标签序列的设定位置在接头的粘性末端。标签序列的设计见表I。d.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对标准引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR扩增反应；标准引物见表2。e.将步骤d所得PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交，杂交反应后通过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。f.将待测片段通过illumina公司的标准方案进行大规模平行测序。g.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。为实现上述技术方案，步骤a所述的捕获探针可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针的长度从20bp至IOObp不等的与目标互补的片段组成。探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。其中，步骤a所述的捕获探针，包括覆盖以下基因ACTCI、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2KI、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MY0Z2、PRKAG2、RAFl、SOSU TCAP, TNNCU TNNI3, TNNT2、TPMU TTN, TTR、VCL 全部外显子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为15bp-50bp，最优为22bp ;探针之间重叠部分为2-8bp，最优为5bp ;覆盖度为IX至10X，最优为3X。其中，步骤c所述的接头在引物结合区的下游设计标签，标签末端为粘性末端可以和基因组片段结合。接头序列特征如表I所示。其中，步骤d的引物能够在同样条件下效率均一地扩增含有不同标签接头的片段，扩增出的片段包含作为标签的碱基序列。在步骤d的扩增时，不同样品已经进行了等量的混合。本发明的主要优点在于I)本发明可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部遗传性的心肌 肥厚相关基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99. 99%。2)本发明的试剂盒可以一次完成1-18个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大地降低了样品准备的成本。3)本发明的试剂盒可以一次完成8-96个样品的全部遗传性的心肌肥厚的基因，近4000条序列的平行检测，充分利用设备的高通量特性，极大降低了每个样品的测序成本。4)本发明的检测方法步骤简单，减少重复操作的环节，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。5)本发明所提供的检测方法所需时间大大少于sanger法的测序技术，检测的准确度大大优于基因芯片技术，更符合临床检测要求。
附图
是探针设计示意图。
具体实施例方式下面用实施例仅是对本发明实际应用的举例描述，本发明的实际应用不仅限于以下实施例实施例一、肥厚型心肌病221 例检测 MYH7、MYH6、MYBPC3、TNNT2、TNNI3, TNNCUACTCl、TPMl、TTN、CSRP3、DES、DMD、LDB3、VCL, TCAP, PLN、NEXN、ACTN2、FKTN、MYPN、TMPO,ANKRDl、PSENl、PSEN2、ABCC9、SGCD、DSG2、EYA4、DSP、SCN5A、LMNA, MURC 基因外显子，寻找新的突变位点。一、探针设计根据人类基因组数据库公布的基因MYH7、MYH6、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TNNCl、ACTCl、TPMl、TTN、CSRP3、DES、DMD、LDB3、VCL、TCAP、PLN、NEXN、ACTN2、FKTN、MYPN、TMPO, ANKRDl、PSENl、PSEN2、ABCC9、SGCD、DSG2、EYA4、DSP、SCN5A、LMNA, MURC 的外显子序列设计合成探针，探针为RNA，在目标区段叠瓦式设计，探针长度20bp，重叠区域5bp，覆盖范围达到目标区段两端15bp。采用agilent公司的SureSelect缓冲系统体系。二、基因组提取采用 Qiagen FlexiGene DNA Kit (Code No :51204)进行提取待测96份样本的基因组，OD值达到I. 8-2. 0，各取5ug做为起始模板。三、测序前样品制备I)目的基因片段化取定量过的96份基因组DNA，稀释至每100 μ L中含有5 μ g基因组DNAJP 50ng/yL。取110 μ L，用超声破碎仪分别进行片段化。
2)末端补平取I. 5mL EP管，96份基因组样品分别按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态
权利要求
1.一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒，其特征在于捕获目的基因探针；一对用于扩增待测片段的通用引物；12对加入不同标签的测序接头序列；缓冲液；dNTP ；高保真聚合酶；Dynabeads M-280 Streptavidin (invitrogen 公司，112-06D)磁珠。
2.根据权利要求I所述的肥厚型心肌病基因检测试剂盒其特征在于；捕获ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MY0Z2、PRKAG2、RAFI、SOSI、TCAP、TNNCI、TNNI3、TNNT2、TPMl、TTN、TTR、VCL全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针。
3.权利要求2所述的探针可以是寡聚核糖核酸(RNA)，也可以是寡聚脱氧核糖核酸(DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括修饰后的DNA或者RNA等。
4.根据权利要求2所述的探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。
5.权利要求2所述的探针针对目标区域以叠瓦式设计，探针序列与目标区域为互补序列。
6.权利要求2所述的探针长度在15-50bp，最优为22bp;探针之间重叠区域为2_10bp，最优为5bp。
7.根据权利要求I所述的一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒其特征在于；12对加入不同标签的接头序列；
8.权利要求5种所述的标签特征是标签序列的位置接头的最内侧，通过粘性末端与待测片段结合；接头5’和3’端分别进行磷酸化和硫化修饰。
9.按照权利要求I所述，根据权利要求I所述的检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒其特征在于一对通用引物，可以扩增任何加入了标签接头的目的片段，其反应体系和条件完全一致。
10.一种基因检测遗传性心肌肥厚的方法，其特征在于，所述方法包括以下内容 a.设计并制备捕获ACTCl、ACTN2、BRAF, CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS, JPH2、KRAS,LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MY0Z2、PRKAG2、RAFl、SOSI、TCAP、TNNCl、TNNI3、TNNT2、TPMl、TTN, TTR、VCL全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针； b.将多个待测DNA样品分别连接到设计好的加了特异性标签的接头； c.将经过步骤b所得的不同样品的DNA片段混合然后使用设计好的通用引物进行扩增； d.将处理好的待测DNA片段混合物和步骤a所得探针加入反应管中，DNA样本与探针杂交，通过洗脱得到待测的目标片段； e.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对通用引物对步骤d所得序列进行PCR扩增反应； f.将步骤e所得PCR扩增反应产物通过大规模基因平行分析平台进行测序。大规模基因平行分析平台可以是illumina公司的GA系列，但是不仅限于此测序平台。
g.根据标签特征分别对不同来源的基因样本比对进行数据分析。
全文摘要
本发明涉及一种检测遗传性心肌肥厚相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测遗传性心肌肥厚相关基因的产品，该试剂盒包括a)独特设计并制备捕获探针，针对基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外显子片段；b)设计独特带有标签序列的接头；c)通用引物对探针序列进行PCR扩增；d)设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便，极大地降低了测序检验成本。
文档编号C12Q1/68GK102965428SQ20111029385
公开日2013年3月13日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者侯青 申请人:康旭基因技术(北京)有限公司