专利名称：一株适合浓醪发酵的酿酒酵母菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株适合淀粉浓醪发酵乙醇的酿酒酵母菌株及其应用，以及该类菌株的构建方法，属于工业微生物育种和乙醇发酵技术领域。
背景技术：
近年来，由于石油等化石能源日渐枯竭及汽车尾汽等环境问题的日益突出，世界各国越来越重视生物质可再生能源(醇类、氢气、碳氢化合物及生物柴油)的研究开发。自 2005年开始，我国成为继美国和巴西之后的第三大燃料乙醇生产国家，根据《可再生能源中长期发展规划》和《可再生能源发展“十一五”规划》，到2020年我国生物燃料乙醇年利用量将达到1000万吨。尽管燃料乙醇对缓解能源紧张和改善环境质量起到了积极的作用，但我国燃料乙醇生产应用过程中仍面临着诸多制约因素，主要集中在原料受到土地和水资源限制、生产过程能耗高及废料处理等难题。只有通过理论和技术创新，寻求高效清洁的生产工艺才能有效降低燃料乙醇的生产成本，提高其与化石能源的竞争力。针对我国燃料乙醇的生产现状，世界各国学者和工程技术人员普遍认为实现浓醪发酵，使酒精度达到15% (ν/ν)以上可极大地提高生产设备的利用率、减少工艺用水及降低乙醇蒸馏过程中的能耗，以提高燃料乙醇的社会经济效益。但是，与传统的发酵工艺相比，浓醪发酵对酿酒酵母菌株抗逆能力，特别是高渗和高乙醇浓度提出了更苛刻的要求。此外，由于浓醪发酵过程中酿酒酵母菌株会成生更多的副代谢产物(主要是甘油)来应激环境的胁迫。甘油的生成可消耗4%以上的糖，这无疑会严重降低糖醇转化率。因此，选育高抗逆性和乙醇转化率的酿酒酵母菌株成为了突破这项技术瓶颈的关键所在，这也是当前科学研究的一个热门课题。酿酒酵母的环境耐受性是由多基因或基因网络调控下的复杂性状。对个别基因的操作很难实现大幅度改变菌株耐性。近几年的研究发明，相比传统的诱变，杂交和细胞融合等技术，全基因组重排技术在微生物菌株耐受性等复杂性状的改进方面具有明显的优势。 它的原理是通过多轮的杂交或细胞融合使得亲株在全基因组范围内进行基因重排，使重组子积累有益突变，剔除有害位点，从而改进其性状。这项技术的不足之处是对控制菌株副代谢产物方面缺乏有效的筛选方法。相比之下，代谢工程技术能通过对某一代谢途径上的基因进行敲除或过表达从而能有效控制代谢产物的生成。通过敲除酿酒酵母甘油合成途径编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因GPDl和GPD2来实现甘油产量的降低就是一个重要的例子。 但这样的基因操作往往会带来菌株生长能力或胁迫耐受性力下降的不利影响。例如，已有研究表明GPD1/2的敲除会使得酿酒酵母发酵速度减慢，原因是这两个基因对菌株的耐高渗能力和调节胞内氧化还原平衡起着重要作用。因此，很有必要发明一种能集成多种育种方法优势的新策略来构建适合浓醪发酵的酿酒酵母菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一株适于淀粉浓醪发酵乙醇的酿酒酵母菌株及其应用，以及该类菌株的构建方法。本发明采用的技术方案是一株适用于淀粉浓醪发酵乙醇的酿酒酵母菌株——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ZTS3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072， 保藏编号CCTCC No =M 2011四0，保藏日期2011年8月16日。该菌株由优良工业酿酒酵母菌株ZT12为出发菌株，先对其进行甘油-3-磷酸脱氢酶基因GPD2敲除获得低甘油产量的基因工程菌株Z Δ GPD2，再对Z Δ GPD2进行三轮的全基因组重排提高其抗逆性和弥补GPD2敲除对菌株的发酵的不利影响，从而获得环境胁迫耐受性强，浓醪乙醇发酵高产菌株ZTS3 (MAT a/a ;gPd2A :kanMX ； gpd2A :bler)。该菌株ZTS3适宜生长温度为观 40°C，最适生长温度为36°C，可耐受20%的乙醇。与出发菌株ZT12相比，ZTS3在高浓度乙醇、高温和氧化损伤耐受力上提高显著，乙醇产量提高6%左右，同时其副代谢产物甘油产量较亲株降低了 8. 5%左右，适于淀粉浓醪发酵。ZTS3和ZT12在多种抗逆相关生理生化因子的含量变化也进一步证实了 ZTS3的性能优势和本发明中育种策略的有效性。本发明还涉及所述的酿酒酵母CCTCC No =M 2011290在淀粉浓醪发酵制备乙醇中的应用。乙醇的浓醪发酵，简单来说就是发酵过程中的高浓度发酵，具体表现在生产有以下特点1、高酒份；2、高渗透压；3、高酵母数。就酒精生产而言，不同原料、不同时期浓醪发酵的界限存在着明显的差别；大概区分如下淀粉质原料酒精浓度在14 16% (V/V)，糖蜜原料酒精浓度在10 12% (V/V)。所述应用为将酿酒酵母CCTCC No =M 2011290接种至适用于浓醪发酵的发酵培养基中，观 40°C发酵60 80h，发酵结束后发酵液经分离纯化获得乙醇。所述适用于浓醪发酵的发酵培养基可按常规双酶法获得，本发明中具体可按如下方法配制按料水质量比1 1.5 2. 5称取玉米粉，加水搅拌均勻后按5 10U/g玉米粉添加量加入液化酶并升温至85 95°C保温0. 5 2h，待混合液降温到50 60°C时按 180 250U/g玉米粉添加量加入糖化酶，糖化0. 5 1. Oh后添加0. 2% 0. 5% (w/v,l% 表示IOOmL糖化液添加Ig尿素)的氮源尿素，即得所述适用于浓醪发酵的发酵培养基。本发明还涉及一种构建适合浓醪发酵的酿酒酵母菌株的方法，所述方法包括(1)利用基因敲除技术，敲除工业酿酒酵母菌株的GPD2基因，获得工程菌 Z ΔGPD2 ；(2)以工程菌Z Δ GPD2为出发菌株，将其接种至产孢培养基中培养5d诱导产孢，所述产孢培养基组成如下=NaAc 10g/L，酵母提取物2g/L，葡萄糖lg/L，KCl 2g/L，pH 6. 0溶剂为水；(3)离心收集子囊孢子后加入体积比7 2 1的Tris-HCl (pH8.0，0.01mol/L)、 100mg/mL蜗牛酶溶液和0. lmol/L巯基乙醇溶液，120r/min在30°C培养16h，使子囊壁破裂释放孢子，580C高温处理15min致死营养细胞，对所有孢子进行混合后在YPD培养基中进行培养，随机杂交获得重组子，重组子用无菌水稀释后涂在有20%葡萄糖和15%乙醇的YPD 平板，挑取50个生长快速的菌落进行发酵水平测定；(4)再选取10株发酵性能优良的菌株重复上述步骤(2) ( 进行第二轮和第三轮的重排，筛选第三轮重组子中表现最优的重组子，即获得构建适合浓醪发酵的酿酒酵母菌株。本发明的有益效果主要体现在提供一株淀粉浓醪发酵过程中具高抗逆性及高产乙醇的酿酒酵母(ZTS;3)菌株及其构建方法。ZTS3不仅产生较低的主要副代谢产物甘油，而且具有较好的对多种环境胁迫的耐受性和浓醪发酵性能，将其应用于浓醪乙醇生产，可减少能耗，降低生产成本，另外，ZTS3在海藻糖含量、抗氧化和耐高温能力的提高使其具被开发成活性干酵母的潜力。本发明构建方法较以往方法在构建浓醪发酵酿酒酵母菌株上具明显优势，运用此方法构建酿酒酵母菌株不仅产生较低的主要副代谢产物甘油，还能显著提高其对多种环境胁迫的耐受性和浓醪发酵性能，此法也可用于酿酒酵母其它性状或性能的改进。
图1为GPD2基因敲除示意图；图2为菌株ZTS3，ZAGPD2与出发菌株ZT12的浓醪发酵性能参数㈧乙醇，⑶ 葡萄糖，(C)甘油和乙酸以及(D)CFU的比较图3为发酵后期菌株ZT12 (A)和ZTS3 (B)细胞活力和质膜完整性比较；图4重组子ZTS3与出发菌株ZT12在对照YPD平板，及多种胁迫因子处理的生长情况和存活率比较；图 5ZTS3 与 ZT12 海藻糖(trehalose)，CAT, SOD, GSH,麦角固醇(ergosterol)，棕榈酸(C16 0)，棕榈油酸(C16 1)，硬脂酸(C18 0)，油酸(C18 1)，亚油酸(C18 2)含量的比较；图中柱子所示数值为log2(ZT12/ZTS3)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例所用出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ZT12，为发明人实验室选育的燃料乙醇生产菌株，已在得到工业化规模的燃料乙醇生产应用。与我国其它常用乙醇发酵菌株相比，ZT12在浓醪发酵性能上具有明显优势(表1)。表1 我国常用乙醇发酵酿酒酵母菌株淀粉浓醪发酵性能比较发酵产物YgL—1)~^M 发酵速度( g __乙醇甘油乙酸 (gL-1) h^L-1)
1300108.15±1.0611.51±0.090.36±0.0542.75±1.441.50±0.07
1308115.50±1.1411.99±0.170.64±0.1029.14±1.501.60±0.02
拉斯 12 号103.73±1.1211.34±0.280.94±0.0353.04±1.311.44±0.02
安琪酵母112.10±1.8912.26±0.240.54±0.0436.71±1.511.56±0.03
K 氏酵母115.74±0.7511.83±0.370.48±0.0528.36±1.281.61±0.01
ZT12_122.43±1.98 10.23±0.29 0.70±0.06 18.38±1.33 1.70±0.03*发酵条件同发明内容中的发酵条件一致，发酵液中含有279. 3g/L葡萄糖实施例1 基因工程Z Δ GPD2的构建根据已报道的酿酒酵母GPD2基因及侧翼序列(Genebank号NC 001147. 6)为模板，设计引物(GPD5S和GPD5A)和引物(GPD3S和GPD3A)来分别扩增GPD2基因的5，端和 3’端两段序列连入分别带有G418和Zeocin抗性基因的酿酒酵母基因工程操作常规质粒 PUGk和pUGb构建两种GPD2敲除盒(图1)。使用引物(GPD5S和GPD3A)扩增敲除盒后转化酿酒酵母ZT12后利用其与基因组上的GPD2位点进行同源重组将其GPD2基因敲除。用引物(VkS和VkA)和引物(VbS和VbA)两对引物来验证两种敲除盒是否准确整合进预期位点。最终获得工程菌ZAGPD2。引物序列如下GPD5S :5，-GTTACCAGCTGCGGTTATTTTATCGGAACAT-3，GPD5A 5' -TTTAGTCGACTTTATTAAGGATCCTATAAGGAAGGG GAGCGAA GG-3’GPD3S :5’ -ATTACCTGCAGGTCTGATCTTTCCTGTT-3’GPD3A 5' -CTTATCGGAATTCAATGGGGAGACAAGAT-3，VkS :5’ -ATCTGCCGGTCTCCCTATA-3，VkA 5' -GCCAAACAAACTTTTCCC-3，VbS :5，-GTTAGTCTGAACGGTGTATGG-3，VbA 5，-TGAGCTGCCGATAAGGAAAG-3，。实施例2 全基因组重排获得稳定重组子ZTS3以ZAGPD2为出发菌株，对其在产孢培养基中(10g/L NaAc，2g/L酵母提取物， lg/L葡萄糖和2g/L KCl，pH 6.0)培养5d进行诱导产孢。离心收集子囊孢子后加入 700 μ LTris-HCl (ρΗ8. 0,0. 01mol/L)、200 μ L100mg/mL 蜗牛酶溶液和 100 μ L0. lmol/L 巯基乙醇，120r/min在30°C培养16h，使子囊壁破裂释放孢子，58°C高温处理15min致死营养细胞。对所有孢子进行混合后在YPD培养基中进行随机杂交获得重组子。重组子用无菌水稀释至IO3细胞/mL后涂在有20%葡萄糖和15%乙醇的YPD平板，挑取50个生长快速的菌落进行发酵水平测定。再选取10株发酵性能优良的菌株重复上述过程进行第二轮的重排。 经过三轮这样的全基因组重排后，从第三轮重组子中筛得了表现最优的重组子ZTS3(即CCTCCNo =M 2011290)。对ZTS3在YPD培养基中连续转接50次后，随机挑取10个克隆进行测定，发现其发酵性状与ZTS3没有显著差异，这个结果说明有丝分裂过程中ZTS3的遗传稳定性。 实施例3 菌株的浓醪发酵水平比较发酵种子液在50mL YPD中培养20h至菌体浓度为120D左右收集菌株。发酵培养基采用玉米粉经双酶法处理获得。具体方法如下按料水质量比1 1. 9 称取一定量的玉米粉，加水搅拌均勻后按6U/g淀粉加入液化酶(河南天冠企业集团有限公司)并升温至90°C左右保温lh，液醪降温到55°C时按200U/g淀粉加入糖化酶(河南天冠企业集团有限公司)，糖化0. 5h后添加0. 2%的氮源尿素，即得所述发酵培养基。发酵培养基降温至34°C后按5% (ν/ν)的接种量接入种子液，发酵体积为0. 5L。 在34°C恒温增养箱中静置发酵68h。发酵液中的葡萄糖、甘油、乙酸和乙醇等成分含量均用高效液相色谱(HPLC)配备多孔性阴离子树脂Aminex HPX-87H柱(300mmX7. 8mm) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)进行测定。每单位体积活细胞数量(CFU)是根据将发酵液稀释后涂至YPD平板菌落出现的个数来计算。发酵后期细胞活性和质膜完整性采用二乙酸荧光素-溴化乙淀(FDA-PI)双染色法分析在发酵时间58h从发酵液中收集细胞，用 IXPBS (pH 7. 2)洗涤两次并调整至细胞浓度为OD6tltl = 0. 1 (约1 X IO6细胞)。在80 μ L细胞中加入10 μ L PI母液lXPBS(500y g/mL)和FDA母液(lmg/mL)，在暗处染色30min后， 用激光共焦显微镜LSM-510(Zeisis，Germany)观察拍照。与出发菌株ZT12相比，工程菌ZAGPD2的甘油产量降低了 19.6%，但其乙醇产量也降低了 2. 8% (图2)，这与GPD2基因敲除后发酵不完全有密切关系。经过三轮全基因组重排后，重组子ZTS3的发酵性能较ZT12和Z Δ GPD2有明显的提高，乙醇产量较ZT12提高了 6. 1% (乙醇终浓度为16. 2%，ν/ν)，甘油产量降低了 8.6%，残余葡萄糖在0.5%以下(图 2)。这与ZTS3在发酵中后期具有较高的活细胞数相一致(图2D)。图3显示的结果进一步证明了在发酵后期ZTS3比ΖΤ12具有更高细胞的活力和质膜完整性(活细胞被FDA染成亮绿色，失去细胞膜完整性的细胞能被PI染成红色)，也提示了重组子ZTS3在高糖发酵过程中具有更好的胁迫耐受力是其发酵性能提高的重要原因。实施例4 菌株的对单一胁迫因子的耐性比较挑取相等菌量接种至25mL YPD(酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L) 液体培养基中培养20h，用无菌水将菌体调整成3X 107cells/ml，并依次按ICT1稀释两个梯度。用吸液枪吸取3μ L点样于YPD平板及YPD中含有18%乙醇，IOmM H2O2，50%葡萄糖的平板。高温致死胁迫耐性比较，是先将置于1. 5mL离心管的菌体稀释液在水浴锅55°C保温 8min，再吸取3yL点样在YPD平板。点样后将平板置于30°C恒温培养箱培养观察。图4显示重组子ZTS3在对照YPD培养基中与ZT12的生长情况无异，但在高浓度乙醇、高温和H2O2 胁迫处理时具有明显提高的生长速度或存活率。对多种胁迫耐性的提高不仅可以使ZTS3 在乙醇发酵过程中生成更多的乙醇，也扩展了菌株ZTS3的应用，如开发成活性干酵母。实施例5 :ZTS3和ZT12的多种生理生化因子含量比较已有研究表明海藻糖、抗氧化因子和质膜成分等生理生化因子在酿酒酵母抵抗环境胁迫过程中起着重要作用。为进一步证实ZTS3性能的提高和该方法的有效性。我们对菌株ZTS3和亲株ZT12进行了一些重要的抗逆因子的测定。两株菌株在YPD中培养20h后(初始0D_ = 0. 05)，收集一定的细胞量进行抗逆相关生理生化指标的测定。其中海藻糖含量采用常用的蒽酮硫酸法测定。麦角固醇的测定采用HPLC配备RP18色谱柱测定。质膜脂肪酸通过气相色谱(GC FOCUS)配备DSQIIMS检测器(Thermo，USA)和DB-5MS毛细管柱(J&W Scientific Inc.，Folson, CA, USA)来测定 。过氧化氢酶(CAT)，过氧化物酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)采用南京建成生物工程研究所所售的试剂盒测定，试剂盒编号分别为 A007，A001和A006。粗酶液的提取采用Yeastbuster蛋白提取试剂盒(Novagen，Germany)。
由图5可见经过全基因组重排后，ZTS3与ZT12在生理生化水平上发生了显著变化，ZTS3在多种胁迫条件下均能起到细胞保护作用的抗逆因子海藻糖和CAT的含量上较亲株提高了 48%和25%。在质膜组成方面，ZTS3在长链脂肪酸((18:0和(18:1)的含量上有明显的提高。这些抗逆因子含量的变化可能是ZTS3具有更好胁迫耐性的重要因素，同时了证明了全基因组重排可以调整细胞的生理代谢，弥补因GPD2敲除所带来的不利影响。从而使ZTS3在副代谢生成和抗逆性两方面都比亲株具有显著优势。
权利要求
1.一株适用于淀粉浓醪发酵乙醇的酿酒酵母菌株一酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ZTS3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072， 保藏编号CCTCC No僅2011四0，保藏日期2011年8月16日。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母CCTCCNo =M 2011290在淀粉浓醪发酵制备乙醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为将酿酒酵母CCTCCNo=M 2011290接种至适用于浓醪发酵的发酵培养基中，28 40°C发酵60 80h，发酵结束后发酵液经分离纯化获得乙醇。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述适用于浓醪发酵的发酵培养基按如下方法配制按料水质量比1 1.5 2. 5称取玉米粉，加水搅拌均勻后按5 10U/g玉米粉添加量加入液化酶并升温至85 95°C保温0. 5 2h，待混合液降温到50 60°C时按180 250U/g玉米粉添加量加入糖化酶，糖化0. 5 1. Oh后添加0. 2% 0. 5%的氮源尿素，即得所述发酵培养基。
5.一种构建适合浓醪发酵的酿酒酵母菌株的方法，所述方法包括(1)利用基因敲除技术，敲除工业酿酒酵母菌株的GPD2基因，获得工程菌ZAGPD2；(2)以工程菌ZΔ GPD2为出发菌株，将其接种至产孢培养基中培养5d诱导产孢，所述产孢培养基组成如下=NaAc 10g/L，酵母提取物2g/L，葡萄糖lg/L，KCl 2g/L，pH 6. 0溶剂为水；(3)离心收集子囊孢子后加入体积比7 2 1的Tris-HCl (pH8.0，0.01mol/L)、 100mg/mL蜗牛酶溶液和0. lmol/L巯基乙醇溶液，120r/min在30°C培养16h，使子囊壁破裂释放孢子，580C高温处理15min致死营养细胞，对所有孢子进行混合后在YPD培养基中进行培养，随机杂交获得重组子，重组子用无菌水稀释后涂在有20%葡萄糖和15%乙醇的YPD 平板，挑取50个生长快速的菌落进行发酵水平测定；(4)再选取10株发酵性能优良的菌株重复上述步骤( ( 进行第二轮和第三轮的重排，筛选第三轮重组子中表现最优的重组子，即获得构建适合浓醪发酵的酿酒酵母菌株。
全文摘要
本发明提供了了一株环境胁迫耐性强，适于淀粉浓醪乙醇发酵的酿酒酵母菌株(ZTS3)及其应用，以及该类菌株的构建方法。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZTS3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NoM2011290，保藏日期2011年8月16日。ZTS3不仅能克服淀粉浓醪发酵过程中的胁迫因子和生成较少的甘油，降低乙醇生产成本，它的成功构建也为高效选育优良性状的酿酒酵母菌株提供一种方法和思路上的创新。
文档编号C12N1/18GK102329742SQ20111029325
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者刘天喆, 吴雪昌, 王品美, 郑道琼, 陶香林 申请人:浙江大学