专利名称：双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温扩增方法及试纸条，特别是涉及一种双标记核酸扩增方法及其快速检测试纸条。
背景技术：
随着现代分子生物学和分子技术的发展，研究开发了许多核酸扩增技术。其中核酸环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，由于其具有特异性强、灵敏度高、反应速度快等特点，在核酸特异性扩增和检测领域具有取代PCR的趋势，成为生命科学领域研究的热点之一。核酸环介导扩增的主要原理是基于对靶序列的6 个区域设计2对特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在65°C左右的恒温条件下保温约60分钟，完成核酸扩增反应，在存在环引物的情况下，扩增时间可进一步缩短为40分钟。用于LAMP扩增的3对引物对应于靶基因的8个区段，因而具有比 PCR更高的特异性，同时具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。目前LAMP产物的检测经常采用电泳法和浊度法，需要用高致癌性的荧光染料溴化乙锭，不仅危害操作人员的健康，而且无法排除假阳性的问题，限制了 LAMP技术的推广使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题克服现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、 速度快的双标记核酸恒温扩增方法；
还提供了一种用双标记核酸恒温扩增产物得到的简易检测试纸条，该试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测。本发明的技术方案
一种双标记核酸恒温扩增方法，根据检测目标设计LAMP引物，进行内引物、外引物和环引物的合成；用生物素和荧光素分别标记两种内引物，或分别标记两种环引物，或分别标记一种内引物和一种环引物，将标记引物加入LAMP反应体系中恒温扩增，得到双标记核酸恒温扩增产物。所述标记是标记内引物各引物的5’端；所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。所述恒温扩增是在59-65°C温度下、恒温扩增5-20min。一种含有双标记核酸恒温扩增产物的检测试纸条，含有支撑层、吸附层，支撑层为不吸水薄片条，吸附层粘贴于支撑层上，所述吸附层从测试端依次为测试端纤维层、纤维素膜层和手柄端吸水材料层，所述纤维素膜层含有权利要求1所述的双标记核酸恒温扩增产物，用生物素亲和蛋白及荧光素抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，或用生物素亲和蛋白及荧光素金标抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，检测印迹和对照印迹平行排列为“Il ”。
所述不吸水薄片条为硬质塑料片条或不吸水硬纸片条，所述纤维素膜层是用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，所述手柄端吸水材料层是用吸水纸制成，所述测试端纤维层是用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。
所述测试端吸附纤维层、吸水材料层上均覆盖有保护膜，在测试端纤维层的保护膜上印制有样品标记线，该标记线距离测试端0. 5cm。所述的检测试纸条在检测各种致病性微生物或病原体的特异性基因中的应用。本发明的积极有益效果
1 ·本发明的双标记核酸恒温扩增方法具有下列优点
(1)特异性强，用于LAMP扩增的3对或2对引物分别对应于靶基因的8个或6个区段， 理论上可以检测出一个碱基差异的序列，因而具有比PCR更高的特异性；
(2)灵敏度高，LAMP能在模板DNA纯度很低的情况下进行扩增，很少受培养介质和生物学物质的影响，纯化步骤可以忽略；
(3)速度快，LAMP是恒温扩增反应，没有PCR反应中温度变化的耗时，在30 60min内即可完成反应过程，10 min内即可完成扩增反应，结合本发明中试纸条检测手段，试纸检测可在5min内完成，加上前处理过程，可在1小时左右完成对样品的检测；
(4)易推广，LAMP反应是一个恒温扩增过程，不用控制温度变化，只需简单的恒温器，也不需要昂贵的PCR仪，对操作人员的分子生物学技术要求不高。2 .本发明的检测试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测，具体包括
可用于人致病性病原体的检测，包括牙龈卟啉单胞菌(/^r/^j^roMwas gingival is, Tannerella forsythia, Tf) > ^IjJ W JiE Φ (Treponema den ticola, Td )、粪肠球 i、Enterococcus faecal is),伴放线放线杆 iUctinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)、变形链球 Iif {.Streptococcus mutans、、远缘链球菌 {Streptococcus sobrinus)^ i^tX^tX^tf 1MiAggregatibacter ( Actinobacillus) ac tinomyce temcomi tans )、直肠弯曲菌(Campylobac ter rec tus )、卩齿 t虫艾肯菌(.Eikenella corrodens),具核梭杆 Iif iFusobacterium nucleatum)、角军月干素普氏 Iif {Prevotella intermedia、禾口嗜沫嗜血杆鬼(Aggregatibacter ac tinomyce temcomi tans) > /[叚结核耳口尔森氏 lif (Yersinia pseudotuberculosis、、由结核分枝杆嵐(Mycobacteria tuberculosis )> 牛分枝杆鬼(Mycobacterium bovis、、^ 汐分枝杆据(Mycobacterium africanum )和田鼠分枝杆菌Qfycobac terium micro ti )组成的结核分枝杆菌复合群 (Mycobacterium tuberculosis complex)、鸟结核分枝杆菌办aci6 ria aFia )、胞内 木干 lif iMycobac teriumin tracel IulareiMycobac teriumkansasii )、
戈登分支杆 lif iMycobacteriumgastri )> 军团菌 M (.Legionella species)、志贺氏菌(^Shigella)、侵袭生大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli )> 产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)禾口大肠杆菌普通株(common strains of Escherichia co/i )、月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae )、父艮难梭菌 {Clostridium difficile, C. d)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、铜绿假单胞菌 QPseudomonas aeruginosa ) > 幽 Π 螺旋杆菌(Jielicobacter pylori, H. pylori 或Hp) (Minami et al, 2006)、流感嗜血杆菌(泡讀似i/ /7此浏e)和副流感嗜血杆菌 {Haemophilus parainfIuenzae)、产 vero 毒素大肠杆菌(toxin-producing Escherichia coH )λ 甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)禾口产肠毒素金黄色葡萄球菌(enterotoxigenic Staphylococcus aureus )、 产毒素霍舌L 弧菌(cholera toxin-producing Vibrio choIerae)^ 豚鼠气单胞菌 {Aeromonas ⑵Kiaa)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌pseudomallei),^M^ ft V^iCampylobacter j^/^/ i)、结肠弯曲杆菌(C^^j^^acter coli)和胎儿弯曲杆菌 ^Campylobacter /fetos)、沙门氏菌09)、布鲁氏菌⑶Ba spp)、创伤弧菌ra7/ i/i^As)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、人类疱疹病毒 6 型(human herpesvirus)、急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus)^7jC|t _(varicella-zoster virus, VZV)、i^g_
毒 A 型(human influenza A viruses)禾口流感病毒 B 型(human influenza B viruses)、 聴腺炎病毒(mumps virus)、登革热病毒(dengue virus)、麻疫病毒(measles virus)、 人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)、流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、细胞巨化病毒(cytomegalovirus)、诺如病毒 (norovirus, NV)、风疫病毒(rubella virus)、基孑L肯雅病毒(Chikungunya virus)、腺病毒(adenovirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、甲型肝炎病毒(!fepatitis A Virus, HAV)^ 乙型肝炎病毒(itepatitis B Virus, HBV)、人细小病毒 B19 型(human parvovirus B19)、 爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)、猴痘病毒(Monkeypox Virus)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeciency virus type 1，HIV-1 )、兽棚病毒(flock house virus, FHV)和导致肾移植患者发生多瘤病的病毒(BK virus)、非洲锥体虫U/rim/ trypanosomes )、布氏闪 t 匕亚锥虫(Trypanosoma brucei gambiense )、布氏罗得西亚锥 (Trypanosoma brucei rhodesiense )^ 恶性症原虫{Plasmodium falciparum ) Λ 月市抱子虫{Pneumocystis pneumonia)、恙虫东方体tsutsugamushi)Λ 冈Ij地弓形虫 (Toxoplasma gondii )等 0 可用于鱼贝类致病性病原体的检测，包括对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、矛兆拉综合征病毒(Taura syndrome virus)禾口斑节对虫下的黄头病毒(Yellow head virus)、鱼虹彩病毒(fish iridovirus)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGVO、太養赞 iScophthalmus maximus)红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus, TRBIV)、传染性造血器官坏死症病毒 (infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)、锦鲤疱疫病毒(Koi herpesvirus, KHV)、皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)λ 罗氏沼虫下诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirusj MrNV)、 小病毒颗粒(extravsmall virus, XSV)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)、鲤春血症病毒(spring viraemia of carp virus, SVCV)、诺如病毒(norovirus)、迟纯爱德华氏廣QEdwardsiel la te fe)、叉尾鮰爱德华菌(^/^ feidh icteA/ri)、柱状黄杆胃(Fla vobac terium co Iumnare )、 若 + 氏胃{Nocardia seriolae )、· & 氏耳口氏 M (Yersinia ruckeri ) Λ 鲑鱼肾杆菌{Renibac terium salmoninarum ) Λ 漂美人弧菌 (Vibrio nigripulchri tudo )、微抱子虫(Microsporidia )、粘抱子虫(Tfe tracapsuloidesbryosalmonae )禾口脑丰占体虫(i^o 办 cerebral is )等。可用于农牧养殖业中病原体的检测，包括猪水泡病病毒(Swine Vesicular Disease Virus, SVDV)、猪圆环病毒(porcine circovirus type 2， PCV2)、猪瘟(classical swine fever virus, CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)> 猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)> If#(Newcastle disease virus, NDV)> H5N1 # ^ 毒(H5N1 avian influenza virus)、H9 禽流感病毒(H9 avian influenza virus)、 ￥-1 iS # (duck plagues virus, DPV) ^ ^ # (Canine Distemper Virus)、* 细小病毒(canine parvovirus)、牛白血病病毒(bovine leukemia virus, BLV)羊传染性脓疱病毒(orf virus)、锥体虫(trypanosomes)、犬吉氏巴贝斯虫〔Babesia gibsoni )、马 泰勒虫(Theileria equi )、驽巴贝斯虫、Babesia cabalIi )、环形泰勒焦虫(Theileria annul a ia )、吕氏泰勒虫(Theileria Iuwenshuni，UTRlu8 )、尤氏泰勒虫 (Theileria uilenbergi, UTRu6)、牛 EL贝西虫属寄生虫(bovine Babesia parasites)、 隐孢子 ^^Cryptosporidium)、绦虫(Taenia)、畐Ij 结核分枝杆 MQfycobacterium para tuberculosis )、^im^MMW (.Lep tospira )等。可用于植物病源微生物的检测，包括番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)、病毒马铃薯病毒Y型(Potato virus Y, PVY)、李树和桃树的李痘病毒(Plum pox virus, PPV)、柑橘青果病细菌(Citrus Greening Organism)、柑橘黄龙病病原类细菌(Liberibacter Species Associated with Citrus Huanglongbing)、^H禾斗雷尔氏菌solanacearum)> ^tM ^Ral s tonia so lanacearum)iPhytophthora ramorum)等。可用于食品中病源微生物的检测，包括沙门氏菌(Salmone 1 Ia)、副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus ) > 赌状芽抱杆 {Bacillus cereus ) > 仓ij 伤弧 lif ( Vibrio vulnificus、、小肠结肠炎耶尔森氏菌(/ersiflia enterocolitica),弯曲杆菌属 ^Campylobacter spp.)金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus ) > 单 ±曾李其jf 特菌 {.Listeria monocytogenes)>ΕξIif (Shigella. Spp)禾口大肠杆菌 0157:H7 {Escherichia coli O157:H7)等。3.本发明的试纸条使用时检测结果形象、直观、准确，试纸条同时显示绿色荧光检测印迹“丨”和对照印迹“丨”，或显示红色检测印迹“I ”和对照印迹“I ”，则检测结果为阳性， 表示样品中含有待检物质；若只显示绿色荧光或红色对照印迹“丨”，则检测结果为阴性，表示样品中不含待检物质。即在纤维素膜上检测线位置显示一条绿色或红色检测印迹“I”，表示待检样品中含有特异性核酸片段。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性的误判。4.本发明的检测试纸条，既能直观检测LAMP扩增产物，又能克服胶体金检测试纸特异性相对较低的缺点，广泛适用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、基层卫生医疗部门、食品质量监督部门和食品企业等各层次的需求，具有较好的市场前景和经济效益。
图1 本发明的双标记核酸恒温扩增检测试纸条结构示意图。图2 本发明的双标记核酸恒温扩增检测试纸条俯视结构示意图。图中1为支撑 层，2为测试端纤维层，3为纤维素膜层，4为手柄端吸水材料层，5为检测印迹，6为对照印迹，7为测试端纤维层的保护膜，8为手柄端吸水材料层的保护膜，9为样品标记线。
具体实施例方式本发明的双标记核酸恒温扩增及简易检测试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测，下面举例说明。实施例1 食品中志贺氏菌(Migella )特异性基因的扩增方法及检测试纸条 1.食品中志贺氏菌特异性基因i/^//的扩增方法
(1)引物设计及标记
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出志贺氏菌特异性基因ipaH的232 — 437位核酸序列，针对该片段的八个位点(这八个位点分别是233 - 254bp、256 — 273 bp,275 一 294 bp,302 一 323bp、341 — 362bp、363 — 382bp、386 — 405bp 和 420 — 438bp)设计出 LAMP弓丨物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物 正向外引物 F3-ipaH 5，-CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC-3， 反向外引物 B3-ipaH 5，-GAGGCGGAACATTTCCCTG-3， 正向内引物
FIP-ipaH 5' -TCCTCACAGCTCTCAGTGGCATTTTTCTGCGGAGCTTCGACAG-3’ 反向内引物
BIP-ipaH 5' -ATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTTTTTAGCGCCGGTATCATTATCGA-3' 正向环引物 LF-ipaH 5，-AGCAGCAACAGCGAAAGACT-3， 反向环引物 LB-ipaH 5，-CCATCAGGCATCAGAAGGCC-3，。将生物素和异硫氰酸荧光素分别标记正向内引物FIP和反向内引物BIP的5’端。(2)反应体系(反应总体积为25μ1)见下表。__
权利要求
1.一种双标记核酸恒温扩增方法，其特征在于根据检测目标设计LAMP引物，进行内引物、外引物和环引物的合成；用生物素和荧光素分别标记两种内引物，或分别标记两种环引物，或分别标记一种内引物和一种环引物，将标记引物加入LAMP反应体系中恒温扩增， 得到双标记核酸恒温扩增产物。
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于所述标记是标记内引物各引物的5’端。
3.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。
4.根据权利要求1-3任一项所述的扩增方法，其特征在于所述恒温扩增是在59-65°C 温度下、恒温扩增5-20min。
5.一种含有双标记核酸恒温扩增产物的检测试纸条，含有支撑层、吸附层，支撑层为不吸水薄片条，吸附层粘贴于支撑层上，所述吸附层从测试端依次为测试端纤维层、纤维素膜层和手柄端吸水材料层，其特征在于所述纤维素膜层含有权利要求1所述的双标记核酸恒温扩增产物，用生物素亲和蛋白及荧光素抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，或用生物素亲和蛋白及荧光素金标抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，检测印迹和对照印迹平行排列为“ 丨丨”。
6.根据权利要求5所述的检测试纸条，其特征在于所述不吸水薄片条为硬质塑料片条或不吸水硬纸片条，所述纤维素膜层是用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，所述手柄端吸水材料层是用吸水纸制成，所述测试端纤维层是用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。
7.根据权利要求5所述的检测试纸条，其特征在于所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。
8.根据权利要求5-7任一项所述的检测试纸条，其特征在于所述测试端吸附纤维层、 吸水材料层上均覆盖有保护膜，在测试端纤维层的保护膜上印制有样品标记线，该标记线距离测试端0. 5cm。
9.权利要求5所述的检测试纸条在检测各种致病性微生物或病原体的特异性基因中的应用。
全文摘要
本发明公开一种双标记核酸恒温扩增方法及试纸条，该方法通过先合成内引物、外引物和环引物，用生物素和荧光素标记内引物或/和环引物，将标记引物加入LAMP反应体系中恒温扩增，得到双标记的核酸恒温扩增产物。试纸条包括支撑层、核酸扩增产物吸附层，核酸扩增产物吸附层粘贴于支撑层上，以生物素亲和蛋白及异硫氰酸荧光素抗体分别在纤维素层上印制检测印迹和对照印迹。本发明的试纸条检测特异性强、灵敏度高、速度快，既能直观检测LAMP扩增产物，又能克服胶体金检测试纸特异性相对较低的缺点，可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测。
文档编号C12Q1/70GK102329790SQ20111029331
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者张改平, 李学伍, 王德国, 赵东, 邓瑞广, 邢广旭, 郭军庆 申请人:河南省农业科学院