专利名称：低甲基化基因lmo3的应用方法
技术领域：
本发明涉及低甲基化基因LM03在制备脑胶质瘤病人预后预测试剂中的应用。
背景技术：
脑胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，目前采用的治疗手段包括手术治疗联合化疗和放疗，但是胶质瘤病人的生存期仍无显著延长。据报道，胶质瘤病人的5年生存率低于25%，而胶质瘤母细胞瘤的病人总生存时间平均为12.3个月。目前，对脑胶质瘤的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对人脑胶质瘤进行预后判定的需求。因此，对人脑胶质瘤进行预后判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为科学研究亟待解决的重要课题。表观遗传学，即可通过遗传而非DNA序列改变引起的基因表达改变。表观遗传机制，包括高/低甲基化、组蛋白修饰或非编码RNA表达。大量研究发现表观遗传机制在肿瘤的形成过程中发挥着重要作用，包括胶质瘤。DNA甲基化状态的改变包括高甲基化和低甲基化，DNA低甲基化可导致基因表达增加，从而促进肿瘤的发生和发展，在肿瘤中起着非常重要的作用。重复序列和单拷贝位点都可能发生低甲基化。近年来，以DNA甲基化为代表的肿瘤表观遗传学及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用价值，已经逐渐到研究者的重视。有研究表明IGF2低甲基化可作为诊断结肠癌的替代生物分子。癌-睾丸抗原基因MAGEAl在胶质瘤中发生低甲基化，抑制P53的功能及产生耐药。低甲基化的MAL 基因可作为预测卵巢癌对顺钼敏感性的标志物。1号染色体重复序列Sat2的广泛低甲基化可作为卵巢癌预后预测的分子标志。由此可见，基因低甲基化在探寻肿瘤分子标志物方面具有巨大潜力。利用亚硫酸氢盐测序PCR法(BSP)分析所获得的肿瘤特异性甲基化状态，是甲基化分析的金标准，它能明确所测区域每一个CG位点的甲基化状态。LM03 基因(LIM domain only 3)定位于染色体 12ρ12· 3，GeneBank 登录号 ΝΜ_001001395。已证实，LM03在神经母细胞瘤中发挥癌基因的功能，它能与神经元性转录因子ΗΕΝ2相互作用，也能抑制Ρ53的转录活性，并且高表达LM03的神经母细胞瘤患者预后较差。申请人用免疫组织化学法检测LM03蛋白在正常脑组织及脑胶质瘤组织中的表达， 结果显示LM03在胶质瘤中表达增加(ρ < 0. 05，图1)，高级别胶质瘤组织(III级、IV级) 中LM03的表达较低级别(I级、II级)增加，差异有统计学意义(ρ = 0. 023)。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)证实，LM03在胶质瘤中发生低甲基化，并且在高级别胶质瘤(III级、IV级) 中的甲基化频率较低级别(I级、II级)病人降低，差异有统计学意义(P = 0. 047)。然后用SPSS 13. 0软件对LM03蛋白表达与LM03基因低甲基化进行相关性分析，结果表明两者间存在相关性(P < 0. 05)，说明表观遗传学可能参与了 LM03基因的表达调控。
发明内容
本发明的目的是提供一种低甲基化基因LM03的应用方法，对于脑胶质瘤的预后预测具有重要意义。低 甲基化基因LM03用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；特别是用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。如用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂；所述的制剂中包括 根据LM03基因启动子区CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为F 5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3‘，R 5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3‘。一种用于人脑胶质瘤预后预测的LM03基因启动子区甲基化检测试剂盒，包括以下引物F 5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3‘，R 5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3‘。申请人:发现LM03基因在脑胶质瘤组织中表达上调(图1)。LM03转录起始位点上游_401bp至-219bp为一典型的CpG岛(图2)，该CpG岛中CG位点在正常的脑组织中均处于高甲基化状态，而在LM03表达上调的脑胶质瘤组织中其甲基化程度降低(部分结果见图 3)。LM03低甲基化的胶质瘤病人总生存率明显低于高甲基化的病人(图4)，提示LM03基因是胶质瘤中的低甲基化基因，是预测胶质瘤预后的分子标志。本发明为脑胶质瘤预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
图1LM03蛋白在正常脑组织及不同病理分级胶质瘤中的表达；A 正常脑组织；B 胶质瘤WHO I级；C 胶质瘤WHO II级；D 胶质瘤WHO III级； E 胶质瘤WHO IV级；图2LM03基因启动子的活性区域_401bp至_219bp为一典型的CpG岛；浅蓝色区域为CpG岛图3BSP检测正常脑组织和胶质瘤组织中LM03基因启动子区甲基化状态；图中所示为部分结果，N3 第3例正常脑组织；N8 第8例正常脑组织；T5 第5例胶质瘤组织；T8 第8例胶质瘤组织。〇表示非甲基化位点， 表示甲基化位点，每一行表示一个克隆中所有CG位点的甲基化状态，计算5个克隆中的甲基化比率进行比较。结果表明，正常脑组织中LM03基因启动子区CpG岛为高甲基化状态，而胶质瘤组织中该CpG岛发生低甲基化；图4LM03启动子低甲基化与胶质瘤病人预后的关系。绿色曲线表示LM03基因启动子甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间，蓝色曲线表示LM03基因启动子发生低甲基化的胶质瘤病人的生存状况及时间。用SPSS 13.0软件进行Kaplan-Meier检验，差异有统计学意义(ρ = 0. 047)，说明LM03低甲基化的病人预后较高甲基化的病人差。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1
米用 Promoterscan，Genomatix Promoter Inspector 及 CpGplot 等生物信息学软件对LM03基因5’端序列进行生物信息学分析，结果表明LM03基因的启动子区域可能位于_581bp至Obp处(以起始密码子ATG中A为+1)。Methl primer express软件和在线软件Methprimer分析LM03启动子预测区域_401bp至_219bp，结果显示为一 CpG岛，设计并合成 LM03 启动子区的甲基化引物，5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA3‘ (F), 5‘ ATAT CCTCCTTTTAAACAACTACAA3 ‘ (R)。对10例正常脑组织进行经亚硫酸盐处理后的基因组测序 (BSP)，发现LM03基因启动子CpG岛中CpG位点在正常的脑组织均处于甲基化状态。同时对不同级别脑胶质瘤组织标本(I级6例，II级20例，III级12例，IV级12例)50例，进行了 LM03启动子区甲基化状态的检测，发现88%的脑胶质瘤组织中LM03的启动子区发生低甲基化，与正常脑组织比较，差异有统计学意义(P < 0. 05)，各级胶质瘤的LM03启动子区甲基化水平没有明显的差异(ρ >0.05)。LM03启动子区低甲基化的病人预后较甲基化病人的差，差异有统计学意义(P = 0.047)。以上研究结果提示，LM03基因是一个新发现的脑胶质瘤甲基化基因，是一个胶质瘤预后预测标志。操作步骤 (一 )亚硫酸氢盐修饰样品gDNA制备选择已商品化的亚硫酸氢盐修饰试剂盒。( 二)亚硫酸氢盐直接测序PCR (BSP)试剂盒的使用内容该试剂盒包括用于检测LM03基因启动子区甲基化的PCR引物5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3' (F)；5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3' (R)；PCR扩增体系(_20°C保存)。原理利用甲基化引物进行PCR扩增LM03启动子区CpG岛。步骤1取经亚硫酸氢盐修饰后的样品gDNA4y 1(总量约IOOng)，加入含甲基化引物 2 μ 1 的 PCR 扩增体系(50 μ 1)，使用 Takara 公司的 EmeraldAmp PCR Master Mix (含 DNA 聚合酶、缓冲液及dNTP混合物)进行扩增。PCR扩增体系为
权利要求
1.低甲基化基因LM03的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因LM03用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因LM03用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因LM03用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂。
4.根据权利要求1或3所述的应用方法，其特征在于，所述的制剂中包括根据LM03基因启动子区CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为F 5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3‘， R 5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3‘。
5.一种用于人脑胶质瘤预后预测的LM03基因启动子区甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物F 5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3‘， R 5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3‘。
全文摘要
本发明涉及低甲基化基因LMO3的应用，即用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂。特别是用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤预后的制剂。通过研究证实LMO3在胶质瘤组织中因启动子发生低甲基化而高表达，将检测LMO3基因低甲基化应用于胶质瘤预后预测，为预测胶质瘤病人的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。
文档编号C12Q1/68GK102329870SQ20111029323
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者余志斌, 刘晓萍, 卞艳慧, 唐海林, 李桂源, 武明花, 王泽友 申请人:中南大学