专利名称：：ChREBP基因甲基化状态的检测的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，涉及一个与动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)相关的碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate-response-element-bindingprotein,ChREBP；GeneID51085；OMIMNo.605678)启动子和第一个外显子区甲基化状态的检测。
背景技术：
：As性疾病位居人类疾病谱的首位，特别是心脑血管As性疾病具有很高的发病率和致死率。高血糖、高血压、胰岛素抵抗、高脂血症和不良的生活习性等都是其发病的危险因素(KleinL,GheorghiadeM.Coronaryarterydiseaseandpreventionofheartfailure[J].MedClinNorthAm，2004，88(5):1209-2235)。这些危险因素的致病机制均可以从遗传学和表观遗传学角度进行解释[ChengX.,DingT.,ZhengF,etal.TwomutationsinLDLRgenewerefoundintwoChinesefamilieswithfamilialhypercholesterolemia.MolBiolRep,2009；36(8):2053_7.]。表观遗传学，相对遗传学而言，是指在没有细胞核DNA序列改变的情况下，基因功能可逆的、可遗传的改变，如DNA的甲基化、组蛋白的修饰和X染色体的失活等[HatadaI，FukasawaM,KimuraM,etal.Genome-wideprofilingofpromotermethylationinhuman.Oncogene.2006May18；25(21):3059-64.]，在基因的表达调控方面有重要作用，启动子区域的DNA高甲基化可使基因的表达水平降低甚至沉默[IwaseY,ShirayaT,TakenoK.FloweringanddwarfisminducedbyDNAdemethylationinPharbitisnil.PhysiolPlant.2010Jan5.]。许多证据支持AS和表观遗传学特别是DNA甲基化的相关性①高同型半胱氨酸血症^AS白勺各虫tMl^iaf[ThampiP,StewartBff,JosephL,etal.DietaryhomocysteinepromotesatherosclerosisinapoE-defcientmicebyinducingscavengerreceptorsexpression.Atherosclerosis,2008；(197)620-62]，而同型半胱氨酸是体内DNA甲基化反应的甲基供体；②AS斑块区的特定基因存在表观遗传学变化，如雌激素受体基因的高甲基化[KimJ，KimJY，SongKS，etal.Epigeneticchangesinestrogenreceptor旦geneinatheroscleroticcardiovasculartissuesandin~vitrovascularsenescence.BiochimBiophysActa.2007；1772(1):72_80.]，一氧化氮合酶基因的高甲基化和组蛋白修饰[FishJ.E.，YanM.S.，MatoukC.C.，etal.Hypoxicrepressionofendothelialnitric-oxidesynthasetranscriptioniscoupledwithevictionofpromoterhistories.J.Biol.Chem，2010；285:810_826.]，超氧化物歧化酶基因的低甲基化[LaukkanenM0,MannermaaS，HiltunenM0,etal.Localhypomethylationinatherosclerosisfoundinrabbitec—sodgene，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol,1999；192171.]；③AS患者外周血白细胞的基因组DNA的总体甲基化水平降低且和血浆同型半胱氨酸和S腺苷同型半胱氨酸水平相关[YiP,MelnykS.,PogribnaM，PogribnyIP,etal.IncreaseinplasmahomocysteineassociatedwithparallelincreasesinplasmaS-adenosylhomocysteineandlymphocyteDNAhypomethylation.JBiolChem.2000，275:29318_29323.]，更有报道患者白细胞低密度脂蛋白受体基因启动子高甲基化[ZhiYF,HuangYS,LiZH,etal.HypermethylationinpromoterareaofLDLRgeneinatherosclerosispatients.FenZiXiBaoShengffuXueBao,2007；40(6):419-27.]；④在ApoE基因敲除小鼠中，主动脉和外周血白细胞的DNA甲基化谱的改变早于动脉壁的组织学改变[LundG,AnderssonL,LauriaM,etal.DNAmethylationpolymorphismsprecedeanyhistologicalsignofatherosclerosisinmicelackingapolipoproteinE.JBiolChem,2004；279(28):29147_54.]。可见基因组DNA的低甲基化与特异基因的高甲基化与As的形成密切相关。脂代谢紊乱和As的发生发展密切相关，然而脂代谢基因甲基化状态的改变与As的关系研究甚少。对于脂代谢相关基因的表观遗传学研究仅局限于低密度脂蛋白受体相关蛋白、载脂蛋白E、肝X受体这几个基因。ChREBP在葡萄糖和多不饱和脂肪酸调控糖酵解和生脂基因上发挥着决定性的调节作用。(MaL，TsatsosNG，TowleHC.DirectroleofChrebp.mixinregulatinghepaticglucose-responsivegenes[J].JBiolChem,2005,280(12)12019-12027；RenaudDentin，FadilaBenhamed，Jean—PaulPegorier，etal.PolyunsaturatedfattyacidssuppressglycolyticandlipogenicgenesthroughtheinhibitionofChREBPnuclearproteintranslocation.ThejournalofClinInves.2005,115(10):2843_2854)。然而迄今为止，还没有有关与As相关的基因ChREBP甲基化状态与疾病的相关性的研究报道。
发明内容本发明的第一个目的在于提供用于检测基因CHREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态的PCR引物。本发明的第二个目的在于，提供用于检测基因CHREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态的试剂盒。本发明研究发现，与As相关的基因ChREBP启动子区和第一个外显子区甲基化状态与冠心病相关。ChREBP启动子区和第一个外显子区甲基化频率在AS组中显著高于正常对照人群(具体数值见下表)。表1病例组和对照组甲基化率的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注这里甲基化涉及ChREBP基因CG岛内的29个CG位点，只要其中存在甲基化的位点，则认为ChREBP启动子区和第一个外显子区为甲基化状态。由此可见，通过检测ChREBP基因启动子区和第一个外显子区高甲基化状态可以用作AS预警的一个新指标。为此，本发明提供一种提供用于检测基因ChREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态的PCR引物，其扩增产物至少包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列中的C220、C222、C227、C229、C245、C251、C254、C257、C270、C273、C275、C291、C293、C308、C310、C315、C317、C332、C338、C350、C359、C367、C370、C375、C377、C381、C391、C395以及C411位点中的一个。优选，其扩增产物包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列中的220411片段。一般而言，PCR引物应当以SEQIDNo.1所示核苷酸序列为模板。当然，本领域技术人员可以根据亚硫酸盐修饰后的DNA为模板设计恰当的PCR引物，但其至少应当包括上述位点中的一个或多个。此外，在设计引物时应当避开C甲基化位点，这样在扩增时不论是甲基化的ChREBP还是未甲基化的ChREBP都能扩增出相应的序列。为了保证PCR扩征的特异性，采用巢式PCR方式进行扩增，这时就需要设计2对弓I物。具体而言，巢式PCR的外侧引物包括但不限于ChREBPffS5'TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG3'ChREBPffA5'CTCACAAACTCAAACCAAATATC3'内侧引物包括但不限于<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>基于上述引物，采用亚硫酸盐测序法检测基因CHREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态。首先，提取基因组DNA，亚硫酸氢钠修饰和纯化基因组DNA。然后，针对亚硫酸盐修饰后的DNA序列，设计巢式PCR扩增引物(例如上述引物)。采用Touch-Down程序(95°C，5min；95°C，45s，65°C_45°C，每个循环降一度，72°C，45s；72°C，10min)扩增目的片段，并将PCR产物纯化后进行T-A克隆。挑取单个菌落增菌后用CHREBP内侧引物扩增验证阳性克隆。每一个样品至少挑取5个阳性克隆测序。采用反向测序，甲基化的CG在测序图上表现为GC，未甲基化的CG在测序图上表现为AC,因而可以鉴别相关位点是否甲基化。为方便应用，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括上述PCR引物，还可以进一步包括亚硫酸盐测序法应用到的相关试剂、耗材，例如选自对苯二酚、亚硝酸氢钠、异丙醇、乙酸铵、糖原、无水乙醇、氢氧化钠中的一种或多种。本发明研究发现ChREBP基因高甲基化状态与冠心病相关，可作为AS的一个新的预警指标。通过本发明的引物及方法可以对冠心病的发病有效提供预警。图1显示的是采用亚硫酸盐测序法获得的甲基化的ChREBP基因启动子区和第一外显子区序列，其中“辺”表示甲基化的CG位点。图2显示的是ChREBP基因启动子区及第一外显子区亚硫酸盐测序图中，CG岛内代表性的CG位点。图3显示的是ChREBP基因启动子区及第一外显子区亚硫酸盐测序图中，CG岛内代表性的未甲基化CG位点，未甲基化的CG经亚硫酸盐处理后C-U，经PCR扩增后变为T。采用反向测序，所以未甲基化的CG在测序图上表现为CA。图4患者组和对照组ChREBP基因启动子区甲基化分布图，A为冠心病组，B为正常对照组。具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例11.材料与方法1.1对象采集100例2007年10月至2008年10月在武汉市亚洲心脏病医院心血管内科经冠状动脉造影术确诊的50-75岁冠心病患者血样，并收集其年龄、性别、血压等基本资料。所有冠心病患者至少一支血管内径有>50%的具有临床意义的狭窄。96名正常对照为武汉大学中南医院健康体检人员。患者和对照者的种族及地区来源无明显差异，均为汉族，无血缘关系，入选者均无严重肝、肾、肺功能不全，无严重贫血、营养不良、糖尿病、风湿病、恶性肿瘤及生殖系统、内分泌系统疾病，自身免疫性疾病和感染性疾病史。所有研究对象均经知情同意。1.2基因组DNA提取和血脂水平的检测所有研究对象均空腹12h后于次日清晨采集2mL静脉血，经EDTA抗凝，分离白细胞，用蛋白酶K法提取基因组DNA。同时采集2mL静脉血，经肝素抗凝，分离血浆用全自动生化分析仪检测血脂水平。1.3基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰及纯化1.3.1将约2μgDNA于1.5mlEP管中使用双蒸水(DDW)稀释至50ul；加5.5μ1新鲜配制的3ΜNaOH；55°C水浴20min；1.3.2水浴期间配制10mM对苯二酚(氢醌)，加30ul至上述水浴后混合液中；(溶液变成淡黄色)，3.6M亚硫酸氢钠(Sigma，S9000)，配制方法1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3MNaOH滴定溶液至pH5.0，最终体积为5ml。加520μ1至上述水浴后溶液中。轻柔颠倒混勻溶液。加200μ1石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。55°C避光水浴16h。1.3.3将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。使用PromegaWizardCleanupDNA纯化回收系统(Promega,A7280)回收纯化亚硫酸盐修饰的DNA。1)力卩ImlPromega'sWizardDNAClean-upresin，轻柔颠倒混勻，使DNA充分与树脂结合；2)将5ml的注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积；3)向针筒内加入2ml80%的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出；4)将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min,以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥；5)将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50μ1预热好的DDW，室温放置5min；6)离心12000rpm，20s。L3.4加5.5μ1新鲜配制的3ΜNaOH，室温放置15min。1.3.5加33μ1IOM乙酸铵、4μ110mg/ml糖原，250μ1冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。1.3.6在4度12000印111离心151^11，弃上清液，加入18(^170%乙醇，4度12000rpm离心5min。离心后弃上清，重复一次。1.3.7倒掉上清，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20μ1-30μ1DDff,溶解沉淀。-20°C保存DNA溶液。1.4PCR扩增及测序检测针对亚硫酸盐修饰后的DNA序列，应用在线引物设计软件设计巢式PCR扩增引物。采用Touch-Down程序(95°C，5min；95°C，45s，65°C-45°C，2cycles/2°C，45s，72°C，45s；72°C,10min)扩增目的片段，并将PCR产物纯化后进行T-A克隆。挑取单个菌落增菌后用ChREBP内侧引物扩增验证阳性克隆。每一个样品至少挑取5个阳性克隆测序。本发明中的扩增产物片段包含29个CpG位点，但片段大小是一个范围涵盖从209bp到400bp之间的片段，根据巢式PCR所采用的内侧上下游引物起始位置而定。在本例中，外侧引物为ChREBPffS5'TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG3'ChREBPffA5'CTCACAAACTCAAACCAAATATC3'内侧引物为P15'GAAAGACGGGAAGGGAGA3'P25'TTTTATGGTGTCGTCGTCG3'2.结果分析对病例组合对照组的检测结果如表2所示。结果表明，ChREBP启动子区和第一个外显子区甲基化频率在AS组(病例组)中显著高于正常对照人群，表明冠心病与ChREBP启动子区和第一个外显子区甲基化相关，通过对ChREBP基因启动子区和第一个外显子区甲基化检测能够有效评估冠心病发病的潜在可能性。表2病例组和对照组甲基化率的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上实施例虽然仅给出了一组巢式PCR引物，然而，本领域技术人员按照本发明公开的实质，很容易设计其他PCR引物来扩增本发明所给出的包含CpG岛的序列，从而实现对是否甲基化的检测。权利要求用于检测ChREBP基因启动子区和第一外显子区甲基化状态的PCR引物，其扩增产物至少包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列中的C220、C222、C227、C229、C245、C251、C254、C257、C270、C273、C275、C291、C293、C308、C310、C315、C317、C332、C338、C350、C359、C367、C370、C375、C377、C381、C391、C395以及C411位点中的一个。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物的扩增产物包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列中的220411片段。3.如权利要求1或2所述的引物，其特征在于，该引物以SEQIDNo.1所示核苷酸序列为模板。4.如权利要求1所述的引物，其特征在于，该引物为巢式PCR引物，包括外侧引物ChREBPffS5'TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG3'ChREBPffA5'CTCACAAACTCAAACCAAATATC3'以及选自以下引物中的内侧引物序号正向(5'-3')反向(5'-3')1GAAAGACGGGAAGGGAGATTTTATGGTGTCGTCGTCG2GAAAGACGGGAAGGGAGAGGTTTGTTTCGTTCGTAGG3AAGACGGGAAGGGAGATGGGTTTGTTTCGTTCGTAGG4AAGACGGGAAGGGAGATGCGATATGCTGCTGCTGTGG5TAAGGAAAGACGGGAAGGCGACGACGACACCATAAAA6GAAAGACGGGAAGGGAGATGCTGCTGCTGTGGTATT7AAGACGGGAAGGGAGATGGCGATATGCTGCTGCTGT8GAAAGACGGGAAGGGAGATTGGATGCTTGCTTTGTTT9GAAAGACGGGAAGGGAGATTATTGGATGCTTGCTTTGT10AAGACGGGAAGGGAGATGTTGGATGCTTGCTTTGTTT11AAGACGGGAAGGGAGATGTTATTGGATGCTTGCTTTGT12AAGACGGGAAGGGAGATGCGACGACGACACCATAAAA13GCGGAGTAGGGATTAGGCTATGCTGCTGCTGTGGTA14TAGGGATTAGGCGGTTGCGCGATATGCTGCTGCTGT15TAAGGAAAGACGGGAAGGGGCTTAGGCTTAGATTTGAT16GCGGAGTAGGGATTAGGCGCGATATGCTGCTGCTGT17AAGACGGGAAGGGAGATGTATGCTGCTGCTGTGGTA18AGGAAAGACGGGAAGGGAGGGTTTGTTTCGTTCGTAGG19AGGAAAGACGGGAAGGGAGTTGGATGCTTGCTTTGTTT20ATGAGGTTCGGTTGGTTAAGAGTTACGACGACGACACCATAAAATA。5.用于检测基因CHREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态的试剂盒，其包括权利要求14任一项所述的PCR引物。6.如权利要求5所述的试剂盒，其还包括选自对苯二酚、亚硝酸氢钠、异丙醇、乙酸铵、糖原、无水乙醇、氢氧化钠中的一种或多种。全文摘要本发明提供了一种用于检测ChREBP基因启动子区和第一外显子区甲基化状态的PCR引物，以及含有该引物的检测试剂盒。本发明采用亚硫酸盐测序法研究发现冠心病组中ChREBP基因启动子区和第一个外显子区甲基化频率显著高于正常对照人群，ChREBP基因高甲基化状态与冠心病相关。可作为AS的一个新的预警指标。本发明提供的检测引物和检测试剂盒可以有效用于ChREBP基因启动子区和第一外显子区甲基化状态的检测。为评估对象的患病潜在可能性提供了手段和依据。文档编号C12N15/11GK101824478SQ20101016228公开日2010年9月8日申请日期2010年4月27日优先权日2010年4月27日发明者严明,杨娜,涂建成,熊陈岭,郑芳,郭书忍,钱冉申请人:武汉大学